雪茄煙葉晾制過程色素降解和膜脂過氧化對顏色變化的影響

范寧波，蔡斌，張瑞娜，高華軍，鄒宇航，宋朝鵬，路曉崇*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；

2 中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克?，海口 571100；

3 四川省煙草公司德陽市公司，德陽 618400

近年來，隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們對雪茄產(chǎn)品的需求量不斷增加，對雪茄原料的要求也越來越高，而雪茄煙的外觀質(zhì)量是雪茄質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，雪茄煙葉在調(diào)制過程中的顏色變化直接影響其外觀質(zhì)量[1]。雪茄煙葉調(diào)制過程的顏色變化一般為由綠變黃，最終固定為褐色。煙葉變色過程伴隨著色素降解和膜脂氧化等生理變化[2]，因此在雪茄煙葉調(diào)制的四個時間段（萎蔫期、變色期、定色期、干筋期）中，變色期是最關(guān)鍵的一個時期[2]。雪茄煙葉顏色的變化受多種因素的影響，如水分含量的變化[2-3]、色素的降解和細(xì)胞膜脂的氧化等[4-5]，時向東[6]等發(fā)現(xiàn)調(diào)制過程中溫度較高時有利于煙葉內(nèi)含物質(zhì)的降解，使煙葉顏色均勻一致；顧會戰(zhàn)[7]也認(rèn)為，高溫高濕條件有利于煙葉顏色的形成。另外，與自然晾制相比，采用晾房晾制可以有效改善煙葉的變色情況[8-9]。色素的降解和膜脂氧化與煙葉的顏色變化有直接的關(guān)系，而細(xì)胞膜脂主要包括糖脂和磷脂（Phospholipids，PL），糖脂又主要包括單半乳糖甘 油 二 酯（Monogalactosyldiacylglycerol，MGDG）和雙半乳糖甘油二酯（Digalactosyldiacylglycerol，DGDG）[10-12]。不飽和脂肪酸的氧化使得膜脂過氧化加劇，容易導(dǎo)致褐變的發(fā)生[13-14]。另外，膜脂的過氧化作用會導(dǎo)致葉綠體膜系統(tǒng)的破壞，使葉綠素含量下降[15-16]。本文以“德雪7號”中部葉為試驗材料，在恒溫恒濕箱中進(jìn)行雪茄煙葉的晾制，探究雪茄煙葉晾制過程色素降解和膜脂氧化對煙葉顏色變化的影響，旨在對雪茄煙葉在晾制過程中顏色的形成提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018—2019年在四川省什邡市師古鎮(zhèn)大泉坑村雪茄煙葉生產(chǎn)基地進(jìn)行，供試品種為德雪7號，試驗田土壤pH值5.8～7.0，有機質(zhì)含量13.01g/kg，速效鉀含量89 mg/kg，速效磷含量38.1 mg/kg，速效氮含量120 mg/kg，按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行統(tǒng)一管理[2]。

基金項目：四川省煙草專賣局科技項目（SCYC201809）

作者簡介：范寧波（1995—），在讀碩士研究生，研究方向為煙草調(diào)制加工，Email：bnf1995@126.com

通訊簡介：路曉崇（1988—），碩士研究生，主要從事數(shù)據(jù)挖掘與煙葉調(diào)制生理研究，Email：ruciyubici @163.com

收稿日期：2020-04-15；網(wǎng)絡(luò)出版日期：2020-12-30

1.2 試驗設(shè)計

選取處于大田成熟期，長勢基本一致的適熟煙葉，置于3 臺規(guī)格、型號完全一致的恒溫恒濕箱（HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）中進(jìn)行晾制，每臺設(shè)備中晾制煙葉40片，一共120片煙葉。參照鄒宇航等人的四川雪茄調(diào)制技術(shù)參數(shù)進(jìn)行溫濕度參數(shù)的設(shè)置[3]。雪茄調(diào)制的最關(guān)鍵時期為變色期[17]，因此針對該特性，自晾制當(dāng)天起（鮮煙葉），固定3片煙葉，每2天拍照記錄，并利用Photoshop軟件測定煙葉的變黃、變褐程度；另外，每2天取樣1次，用于其他生理指標(biāo)的測定。每次取樣選取6 片具有代表性的煙葉樣品（每臺設(shè)備中選取2片），直至煙葉變色完成。（1）煙葉中色素含量的測定：每次選取煙葉中間部位葉片組織用于色素含量的測定；（2）煙葉膜脂的測定：取煙葉中間部位葉片組織（注意避開葉脈），并迅速轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫冰箱中保存，用于膜脂MGDG、DGDG、PL的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 變黃、變褐程度測定

參照汪代斌等[18]的方法，將白色背景布平整地鋪于實驗臺上，將用來跟蹤記錄外觀變化的3片煙葉鋪于上面，用相機拍照，并利用Photoshop像素法計算煙葉變黃部分面積、變褐部分面積與總?cè)~片面積的比值，進(jìn)而計算煙葉的變黃程度、變褐程度。

1.3.2 煙葉色素含量測定

葉綠素、類胡蘿卜素含量采用95%乙醇浸提法提取，并使用分光光度法進(jìn)行色素的測定[19]。

1.3.3 煙葉中膜脂含量的測定

用純化的植物雙半乳糖甘油二酯（DGDG）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入植物雙半乳糖甘油二酯（DGDG），再與HRP標(biāo)記的雙半乳糖甘油二酯（DGDG）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物雙半乳糖甘油二酯（DGDG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中植物雙半乳糖甘油二酯（DGDG）濃度。單半乳糖甘油二酯（MGDG）、磷脂（PL）（上海酶聯(lián)試劑有限公司）的測定方法同DGDG。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，Microsoft Excel 2010進(jìn)行圖形的繪制；利用PSCC2019進(jìn)行照片的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉晾制過程中變黃、變褐程度的變化

由圖1可見，由于煙葉在剛開始晾制時保持綠色，因此變色程度都保持為0。但晾制第2天時，煙葉已經(jīng)開始變黃，并且在接下來的兩天中，其變黃速率極快，到第10天時，變黃速度減緩，變黃基本完成，并在第12天時，變黃完成。與煙葉變黃規(guī)律不同，煙葉在晾制初期，煙葉基本不變褐，隨著時間的延長，變褐啟動，其速率也開始逐漸加快，并約在2周后變褐完成，變褐程度達(dá)到了100%。

圖1 烘烤過程中煙葉變黃、變褐程度變化Fig. 1 Changes in the degree of yellowing and browning of cigar tobacco leaves during air curing

2.2 雪茄煙葉晾制過程中質(zhì)體色素含量和類胡蘿卜素含量/葉綠素含量的變化

由圖2可知，葉片中色素的含量呈逐漸降低的趨勢，且葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素的降解速率在煙葉的變黃階段均較快，在煙葉基本變黃之后降解速率較為緩慢。在煙葉顏色變化完成時，總?cè)~綠素含量減少了80.96%，類胡蘿卜素含量降低了65.94%。在晾制開始時，類胡蘿卜素的含量占據(jù)了總色素的15.52%，而在變色完成時，類胡蘿卜素的相對含量占據(jù)了24.74%，其相對含量有所增加。進(jìn)一步分析類胡蘿卜素與葉綠素比值的變化，結(jié)果顯示雪茄在調(diào)制過程中，兩者之間的比值表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。

圖2 煙葉晾制過程中葉綠素、類胡蘿卜素含量和類胡蘿卜素含量/葉綠素含量的變化Fig. 2 Changes of chlorophyll, carotenoid content and carotenoid / chlorophyll in cigar tobacco leaves during air curing

2.3 煙葉晾制過程中膜脂含量和組成成分的變化

如圖3所示，隨著調(diào)制進(jìn)程的增加，煙葉中單半乳糖甘油二酯（MGDG）、雙半乳糖甘油二酯（DGDG）、磷脂（PL）的含量逐漸降低，尤其是進(jìn)入變褐階段，即變色中后期時，膜脂的含量急速降低。在晾制初始時，MGDG、DGDG、PL的含量分別為178.49 ng/g、956.05 ng/g、2262.53 μg/g，變色完成時，3種膜脂的含量分別僅為78.27 ng/g、498.18 ng/g、1455.47 μg/g，MGDG、DGDG、PL分別降解了降了45.9%、64.1%和51.9%（P＜0.05），這表明了煙葉在調(diào)制過程中發(fā)生了膜脂的降解。脂類物質(zhì)降解時，DGDG /MGDG 比值卻隨著晾制時間的增加而逐漸升高，2周之后，兩者之間的比值從5.37增加到了6.37，增加了18.6%。

圖3 煙葉中膜脂含量和DGDG / MGDG的變化Fig. 3 Changes of membrane lipid content and DGDG / MGDG in cigar tobacco leaves during air curing

2.4 晾制過程中煙葉顏色變化與色素和膜脂含量變化的相關(guān)分析

由表1可知，葉片的變黃程度的大小分別與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與類胡蘿卜素含量/葉綠素含量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；變褐程度與色素含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，與類胡蘿卜素/葉綠素呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。由表2可知，煙葉的變黃程度和變褐程度與DGDG、MGDG以及PL含量之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與DGDG / MGDG之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

表1 晾制過程中變色指數(shù)與色素含量和類葉比之間的相關(guān)分析Tab. 1 Correlation analysis between the coloring index, pigments content and Carotenoid / Chlorophyll during air curing

表2 晾制過程中變色指數(shù)與膜脂含量之間的相關(guān)分析Tab. 2 Correlation analysis between the coloring index and the content of membrane lipids during air curing

2.5 晾制過程中變色指數(shù)與色素含量、膜脂含量之間的回歸分析

分別以晾制過程中煙葉的變黃程度（?1）、變褐程度（?2）為因變量，以葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素、類胡蘿卜素含量/葉綠素含量、單半乳糖甘油二酯（MGDG）、雙半乳糖甘油二酯（DGDG）、磷脂（PL）以及DGDG / MGDG（X1-X9）為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，建立雪茄在晾制過程中煙葉色素含量、膜脂含量對顏色變化的貢獻(xiàn)的預(yù)測方程：

由上述分析可知，雪茄在晾制過程中煙葉的變色程度與葉綠素、類胡蘿卜素、膜脂等各指標(biāo)的的回歸方程擬合度較好，方差分析結(jié)果均達(dá)到了極顯著水平，表明煙葉中色素和膜脂的含量對雪茄煙葉在晾制過程中顏色的形成有極大的貢獻(xiàn)。

3 討論

煙葉顏色的變化不僅僅是簡單的外在變化，更是與煙葉內(nèi)含物分解和轉(zhuǎn)化等生理生化變化密切相關(guān)[20]。其中，質(zhì)體色素的降解不僅是影響煙葉顏色變化的重要因素[20]，也是影響煙葉香氣質(zhì)形成的重要因素[5]。在雪茄煙葉的調(diào)制過程中，葉綠素和類胡蘿卜素含量隨著調(diào)制時間的延長而降低，類胡蘿卜素含量/葉綠素含量的值也隨之呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是由于葉綠素降解幅度較大，類胡蘿卜素的降解幅度較小，由此引起葉組織內(nèi)色素比例的變化，造成了類胡蘿卜素相對含量增加，從而導(dǎo)致煙葉的顏色逐漸由綠色轉(zhuǎn)為黃色[20-21]。隨著煙葉晾制時間的延長，煙葉的變黃程度、變褐程度均逐漸增加，直至煙葉最終褐變完全。相關(guān)分析表明，煙葉的變黃、變褐與色素的含量密切相關(guān)（表1），這說明色素含量的變化是導(dǎo)致煙葉顏色變化的原因之一，與盧紹浩等人的結(jié)論一致[5]。

煙葉在晾制過程中膜脂發(fā)生了降解，膜脂的主要組成成分包括糖脂（MGDG、DGDG）和磷脂（PL），MGDG 與DGDG 在結(jié)構(gòu)上有較大差異，DGDG 為雙層膜脂，MGDG 為非雙層膜脂，且MGDG 為DGDG的合成底物[11-12]，膜脂中MGDG和DGDG的含量以及DGDG / MGDG 的比例會影響生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。煙葉的褐變與膜脂的降解密切相關(guān)[4]。周琪、闞娟[22-23]等發(fā)現(xiàn)在褐變的過程中，膜脂氧化的產(chǎn)物——MDA等物質(zhì)的含量逐漸上升，這暗示了煙葉在褐變的過程中，煙葉中膜脂的組分和含量將會隨之發(fā)生變化。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著晾制時間的延長，膜脂降解，細(xì)胞膜的主要組成成分——糖脂和磷脂含量均逐漸降低，DGDG與MGDG的比值也逐漸增大，尤其是在煙葉啟動變褐后，膜脂含量急劇下降，表明在煙葉在變色時發(fā)生了強烈的氧化脅迫反應(yīng)，變色程度和膜脂含量之間的相關(guān)分析也證明了這一點（表2）。膜脂含量的減少是由于煙葉在調(diào)制過程中，細(xì)胞逐漸失水干癟，在失水脅迫的影響下，細(xì)胞膜被逐漸破壞，促使了膜脂降解。DGDG 的雙分子層結(jié)構(gòu)會部分補償磷脂雙分子層的損傷，對膜進(jìn)行重塑，有助于在最大程度上維持膜的穩(wěn)定，以抵御煙葉失水所造成的脅迫[11-12]。另外，MGDG是DGDG 的合成底物，會部分轉(zhuǎn)化為DGDG，以期在最大程度上減輕膜脂降解所帶來的傷害。齊凌云和李倩[10,11]等人也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小麥遭遇外界脅迫時，小麥葉片膜脂含量會降低，DGDG / MGDG增大。本文的研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，表明了煙葉的調(diào)制過程中發(fā)生了膜脂的降解，這將影響到細(xì)胞膜的生理功能，細(xì)胞中的多酚類物質(zhì)與酶充分接觸而發(fā)生美拉德反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致煙葉的褐變[24]。

色素和膜脂的降解均是導(dǎo)致煙葉顏色變化的重要因素，其中有研究表明，煙葉在變黃的過程中主要與色素的降解有關(guān)[5]，而褐色的形成主要與膜脂氧化有關(guān)[25]。目前關(guān)于雪茄在晾制過程中色素的降解已經(jīng)有所研究報道，但是關(guān)于細(xì)胞膜脂降解與褐變之間的關(guān)系尚未見報道。本研究對晾制過程中雪茄煙葉中色素含量、膜脂含量與煙葉的變色程度進(jìn)行相關(guān)分析和逐步回歸分析，結(jié)果表明煙葉的顏色與色素和膜脂含量的相關(guān)性均較好，回歸方程的擬合度之間也較高，因此可以認(rèn)為，雪茄煙葉在晾制過程中的顏色形成與色素降解和膜脂降解之間具有密不可分的聯(lián)系。

4 結(jié)論

雪茄在晾制過程中，煙葉的變色程度逐漸增加，直至煙葉完全變色；葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸減低，類胡蘿卜素含量/葉綠素含量的值先增大后減小；伴隨著煙葉細(xì)胞的逐漸脫水，煙葉的細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞膜脂逐漸降解，其組分比例亦發(fā)生改變。色素和膜脂的降解可能導(dǎo)致了煙葉的變黃過程和變褐過程。本文研究了影響雪茄煙葉顏色形成的兩大關(guān)鍵因素，旨在為雪茄在晾制過程的變色理論研究提供一些思路。