宮頸細(xì)胞學(xué)p16INK4a蛋白檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)在宮頸癌篩查中的價(jià)值

劉湛秋，何 玉，許 馳，胡曉文，王 麗，駱欣敏

近年來，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[1]。為了盡早發(fā)現(xiàn)癌前病變，降低宮頸癌的發(fā)病率，有必要找出宮頸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。理想的篩查方法應(yīng)該識(shí)別更多的癌前病變，并盡可能減少陰道鏡的轉(zhuǎn)診率。目前宮頸癌篩查方法主要有細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、人乳頭瘤病毒(HPV)檢測(cè)及兩者聯(lián)合檢測(cè)，但細(xì)胞學(xué)檢測(cè)缺乏敏感性，且易受閱片醫(yī)師的主觀影響；HPV檢測(cè)缺乏特異性，不能甄別“持續(xù)性”高危型HPV(HR-HPV)感染這一宮頸癌發(fā)生的必要因素，較高的陽性率可能導(dǎo)致不必要的轉(zhuǎn)診和治療。p16INK4a蛋白作為誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，被認(rèn)為是HR-HPV持續(xù)感染的一個(gè)生物標(biāo)志物，能夠預(yù)測(cè)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變的存在[2]。本研究以醫(yī)院門診人群為基礎(chǔ)，同時(shí)行液基薄層細(xì)胞學(xué)(TCT)、HPV及p16檢測(cè)，比較并探討p16、HPV、TCT單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年5-8月于我院婦科門診就診要求行宮頸癌篩查的受檢者790例，同時(shí)進(jìn)行HPV、TCT和p16檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～70歲，有性生活史，非妊娠狀態(tài)，無宮頸手術(shù)史(如宮頸錐切術(shù)、宮頸切除術(shù))，同意采集用于本研究的宮頸上皮脫落細(xì)胞及宮頸組織。所有受檢者均簽署知情同意書，并通過我院倫理委員會(huì)審查。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集標(biāo)本前24 h內(nèi)禁止性生活、陰道檢查及陰道用藥，先將宮頸表面分泌物拭凈，將細(xì)胞刷置于子宮頸管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)5～8圈后取出，將附著于小刷子上的標(biāo)本置于保存液中。

1.2.2 HPV分型檢測(cè) HPV分型檢測(cè)試劑盒(廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司)，包括高危HPV分型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59及66型，和低危HPV分型：HPV68、CP8304、6、11、43、73、82、26、40、42、44、54、61及83型。

1.2.3 TCT檢測(cè) 采用全自動(dòng)制片系統(tǒng)制作薄層涂片，由細(xì)胞學(xué)醫(yī)生采用TBS分級(jí)法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)閱片，其結(jié)果判斷為未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞和惡性細(xì)胞(NILM) 時(shí)定義為陰性，當(dāng)判讀為意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)及以上時(shí)定義為陽性。

1.2.4 p16檢測(cè) 采用廣州江元醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)免疫細(xì)胞獨(dú)立溫控單獨(dú)滴染染色機(jī)和配套的p16抗體檢測(cè)試劑盒(免疫細(xì)胞化學(xué)法),按步驟依次完成。普通光學(xué)顯微鏡下,整張涂片：上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)(或伴細(xì)胞核)染為黃棕色5個(gè)及以上為陽性，上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核未見黃棕色或染為黃棕色小于5個(gè)為陰性(見圖1、2)。所有標(biāo)本均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師閱片診斷。

1.2.5 陰道鏡檢查及病理學(xué)診斷 任一檢測(cè)結(jié)果陽性以及檢測(cè)均陰性但有明顯臨床癥狀高度懷疑宮頸病變者轉(zhuǎn)診陰道鏡及定位活檢。由有經(jīng)驗(yàn)的婦科醫(yī)生操作，在子宮頸和陰道壁的異常區(qū)域進(jìn)行2～4點(diǎn)活檢，未見病變則對(duì)在宮頸外鱗柱交界處的隨機(jī)活檢，對(duì)于細(xì)胞學(xué)提示腺體病變、鱗柱交界不完全可見或Ⅲ型轉(zhuǎn)化區(qū)，則進(jìn)行宮頸搔刮術(shù)(endocervical curettage,ECC)?；顧z或ECC標(biāo)本送至我院病理科進(jìn)行診斷。組織病理學(xué)分為宮頸慢性炎、宮頸低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)1歸為LSIL，CIN2-3歸為HSIL。

1.2.6 計(jì)算公式 靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陽性預(yù)測(cè)值(PPV)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陰性預(yù)測(cè)值(NPV)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，準(zhǔn)確率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%,假陽性率=假陽性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)和χ2趨勢(shì)檢驗(yàn)，采用受試者工作特征 (ROC) 曲線對(duì)各種篩查方法的診斷能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 篩查結(jié)果 790例受檢者中，HR-HPV陽性率為25.6%(202/790)，TCT陽性率為16.3%(129/790)，p16陽性率為14.6%(115/790)，任一篩查陽性者共270例，三者均陰性但有明顯臨床癥狀者17例(均行陰道鏡活檢，其中16例病理診斷為慢性炎，1例為LSIL)，共召回210例女性行陰道鏡活檢，組織病理診斷為慢性炎131例、LSIL 41例、HSIL30例及宮頸癌8例。在HSIL及以上病變中，HPV陽性34例(89.5%)，TCT陽性29例(76.3%)，p16陽性33例(86.8%)。其中HPV16/18陽性率(67.6%，23/34)與非HPV16/18陽性率(32.4%，11/34)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 8.47，P<0.05)；在非HPV16/18陽性HSIL及以上病變中，HPV33(54.5%，6/11)和HPV52(36.4%，4/11)較多(見表1)。

2.2 HPV、TCT和p16檢測(cè)在不同級(jí)別宮頸病變中的陽性表達(dá)情況 隨著宮頸病變程度的加重，HPV、TCT和p16 陽性率呈趨勢(shì)性增加(P<0.05～P<0.01)(見表1)。通過配對(duì)樣本McNemar檢驗(yàn)可知，在宮頸慢性炎及LSIL中，p16陽性率分別低于HPV陽性率和TCT陽性率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在HSIL及以上病變中，三者陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變各指標(biāo)陽性率比較[n；百分率(%)]

2.3 HPV、TCT以及p16單獨(dú)及聯(lián)合篩查的臨床效果評(píng)價(jià) 790例篩查女性中，去除篩查陽性但未行陰道鏡檢查者77例，最終納入713例受檢者進(jìn)行宮頸癌篩查效能的比較。p16、HPV、TCT檢測(cè)診斷HSIL及以上的靈敏度分別為86.8%、89.5%和76.3%，特異度分別為91.9%、80.3%和88.1%。p16+TCT、HPV+TCT、p16+HPV檢測(cè)的靈敏度分別為92.1%、94.7%和97.4%，特異度分別為85.6%、77.5%和78.8%(見表2)。

表2 以HSIL及以上為終點(diǎn)時(shí)，p16、HPV、TCT單獨(dú)篩查以及兩兩聯(lián)合篩查的臨床效果評(píng)價(jià)

續(xù)2

2.4 HPV、TCT、p16單獨(dú)及聯(lián)合篩查檢出HSIL及以上病變的價(jià)值 HPV、TCT、p16單獨(dú)及聯(lián)合診斷宮頸HSIL及以上病變的ROC曲線見圖3。由ROC曲線分析可知，HPV、TCT、p16、HPV+TCT、p16+HPV、p16+TCT診斷宮頸病變的曲線下面積分別為0.849、0.822、0.893、0.861、0.881、0.889，各指標(biāo)對(duì)宮頸病變的診斷價(jià)值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。

表3 HPV、TCT、p16單獨(dú)及聯(lián)合篩查診斷宮頸HSIL及以上病變的ROC曲線分析

3 討論

宮頸癌是世界范圍內(nèi)婦科常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)它也是世界上唯一病因明確，可通過早期篩查、治療消滅的惡性腫瘤。2019年WHO公共衛(wèi)生項(xiàng)目提出到2030年實(shí)現(xiàn)90%HPV疫苗接種覆蓋率、70%篩查覆蓋率和90%宮頸病變治療率的目標(biāo)，到本世紀(jì)末，在全球范圍內(nèi)消除宮頸癌戰(zhàn)略[3]。然而，目前宮頸癌篩查方式仍存在許多不足，有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)p16INK4a蛋白作為一種分子生物標(biāo)志物，對(duì)宮頸癌前病變和宮頸癌的診斷具有較高的靈敏度和特異度。在有HR-HPV感染的細(xì)胞中，病毒癌蛋白E7與宿主基因組整合并與pRb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白)結(jié)合，破壞其與E2F(轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合，從而加速細(xì)胞周期失調(diào)。pRb功能失活會(huì)通過負(fù)反饋?zhàn)饔脵C(jī)制導(dǎo)致p16蛋白過表達(dá)[6]。p16蛋白的高表達(dá)與E7蛋白的激活存在緊密的關(guān)系[7]。此外，PRIGENZI等[8]研究認(rèn)為p16高表達(dá)與HR-HPV持續(xù)感染密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，p16陽性率隨著宮頸病變的進(jìn)展呈上升趨勢(shì)，宮頸病變的程度越高，p16在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)越多，這與WENTZENSEN等[9]的研究結(jié)論相似。

MARIAM等[10]研究結(jié)果顯示，P16/Ki-67雙染檢測(cè)診斷CIN2+和CIN3+的靈敏度為80.7%和86.8%，低于HPV檢測(cè)(89.9%和92.3%)，但特異度明顯高于HPV檢測(cè)(64.0%&56.1%；54.0%&44.4%)。本研究顯示，在宮頸癌篩查中，在以宮頸HSIL和以上病變?yōu)榻K點(diǎn)時(shí)，p16檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確率和假陽性率分別為86.8%、91.9%、37.5%、99.2%、91.6%和8.1%，其特異度和準(zhǔn)確率明顯高于HPV檢測(cè)，假陽性率明顯低于HPV檢測(cè)，其ROC曲線下面積為0.893，提示具有較好的診斷HSIL及以上病變的價(jià)值。本研究中，單獨(dú)p16檢測(cè)對(duì)篩查HSIL及以上的特異度和準(zhǔn)確率均高于單獨(dú)HPV和TCT檢測(cè)，其敏感性近似于HPV與既往臨床認(rèn)知略有出入[5，10-11]，可能與研究樣本量偏少有關(guān)，有待更大范圍的研究驗(yàn)證。

HPV檢測(cè)對(duì)宮頸癌初篩非常敏感，但特異性較低，需要提高特異性但保持高敏感性的分流檢測(cè)。賈漫漫等[12]研究認(rèn)為p16/Ki67雙染檢測(cè)用于HPV陽性婦女分流措施的效果優(yōu)于HPV16/18檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。越來越多的研究[13-15]表明，p16在區(qū)分HSIL和LSIL以及從HR-HPV的一過性感染和持續(xù)感染中的區(qū)分起著重要作用。CUZICK等[16]對(duì)1 091例HPV陽性婦女同時(shí)進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)、p16和基因分型檢測(cè)，結(jié)果顯示p16或細(xì)胞學(xué)陽性(≥LSIL)的婦女診斷CIN2+的敏感度高達(dá)97.8%，而兩者均陰性的婦女，三年內(nèi)CIN3+的風(fēng)險(xiǎn)低至0.2%。表明p16結(jié)合細(xì)胞學(xué)用于HPV陽性婦女的分流在保持很高敏感性的同時(shí)，降低陰道鏡的轉(zhuǎn)診率，并使短期內(nèi)需要重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)的婦女人數(shù)大幅度降低。本文研究了p16聯(lián)合TCT檢測(cè)篩查CIN2+的靈敏度為92.1%，略低于HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)(94.7%)、p16聯(lián)合HPV檢測(cè)(97.4%)，但p16+TCT檢測(cè)的特異度為85.6%，顯著高于HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)(77.5%)、p16聯(lián)合HPV檢測(cè)(78.8%)。提示細(xì)胞學(xué)聯(lián)合p16檢測(cè)可能作為一種宮頸癌初篩的方法。

細(xì)胞學(xué)p16檢查作為一種新型宮頸癌篩查技術(shù)，操作簡單，陽性細(xì)胞在顯微鏡下易于辨認(rèn)，根據(jù)顏色差異即可快速識(shí)別異常細(xì)胞，受閱片醫(yī)生主觀因素影響小，具有更好的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，用于宮頸癌篩查兼具高靈敏度和高特異度，適合在各個(gè)層級(jí)的醫(yī)院開展，尤其適用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)、嚴(yán)重缺乏細(xì)胞學(xué)醫(yī)生的地區(qū)。WU等[17]報(bào)道，p16免疫化學(xué)染色在宮頸脫落細(xì)胞中不僅可以用作宮頸腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷的輔助工具，而且還有助于對(duì)在 LSIL以及良性反應(yīng)性改變的病例中鑒別診斷出HSIL病變的病例。本研究結(jié)果顯示，p16聯(lián)合TCT檢測(cè)在宮頸癌篩查中對(duì)于宮頸高級(jí)別病變及宮頸癌的診斷價(jià)值與HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)相比，具有相似的敏感性和更高的特異性。細(xì)胞學(xué)p16檢測(cè)不僅可以作為宮頸癌篩查的輔助診斷，與常規(guī)細(xì)胞學(xué)相結(jié)合，可彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)漏診這一弊端，優(yōu)化篩查策略，提高了篩查效率，降低陰道鏡的轉(zhuǎn)診率，實(shí)現(xiàn)CIN的精準(zhǔn)分級(jí)，具有在臨床上推廣使用的潛能。