基于UPLC-MS/MS分析刺梨種子萌發(fā)過(guò)程中幾種內(nèi)源激素含量變化

李健健，尹廣鹍，葉雙全，鄧志軍，盧新雄*

(1.湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，北京 100080； 3.貴州山珍寶綠色科技開(kāi)發(fā)有限公司，貴州 遵義 563000)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)多年生落葉叢生灌木，是我國(guó)特有的野生植物資源.主要分布在云貴高原和湖北、陜西等地，其中以貴州省為主要生產(chǎn)地.刺梨具有很高的藥用價(jià)值、食用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3].目前我國(guó)刺梨的繁殖主要是扦插、嫁接、組織培養(yǎng)[4]等無(wú)性繁殖的方式，這種長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖會(huì)對(duì)刺梨這種依靠種子繁殖的植物造成嚴(yán)重影響，如繁殖體根系不完整、壽命短等，且不利于品種的進(jìn)化.由于刺梨種子難以萌發(fā)等因素，制約了刺梨的商業(yè)化利用.目前對(duì)于刺梨種子的研究多在其低極性化學(xué)成分分析[5-7]，尚未見(jiàn)種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素變化的研究，了解刺梨種子休眠與萌發(fā)的激素調(diào)控機(jī)制，可為提高刺梨的繁殖效率提供理論依據(jù).

植物內(nèi)源激素是指在植物體內(nèi)合成的，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起顯著調(diào)節(jié)作用的有機(jī)物質(zhì)[8].種子的休眠和萌發(fā)主要受內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化的影響，特別是萌發(fā)促進(jìn)類和萌發(fā)抑制類激素之間比值的動(dòng)態(tài)變化.掌握刺梨種子在萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素的含量變化對(duì)解除其休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)提供理論依據(jù).但是植物體內(nèi)的內(nèi)源激素含量甚微，而且由于植物體內(nèi)的組成復(fù)雜，相互共存的干擾組分多，對(duì)溫度等條件敏感，因此對(duì)植物激素的測(cè)定非常困難，定量分析的精度也較低[9].

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)是理想的測(cè)定分析植物內(nèi)源激素的一種方法，但是由于在測(cè)定植物組織抽提液中的多種內(nèi)源激素時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)分離差、峰型不良及嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，因此選擇合適的內(nèi)源激素提取方法和色譜條件尤為重要.本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了同時(shí)測(cè)定刺梨種子中多種內(nèi)源激素的方法，通過(guò)各激素含量變化分析刺梨種子萌發(fā)過(guò)程中休眠與萌發(fā)的激素調(diào)控機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 研究材料

刺梨種子于2019年8月下旬采自貴州省貴陽(yáng)市，將采集后的種子洗凈置于室溫下陰干.

1.2 種子萌發(fā)處理

參照前人對(duì)刺梨種子萌發(fā)最適溫度的研究[10]，將種子均勻播于墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次并加入適量蒸餾水以保持濾紙濕潤(rùn)，分別在培養(yǎng)10、20、30 d后取樣，去除種皮，將胚和胚乳磨成液氮粉，對(duì)于已萌發(fā)的種子切除胚根胚芽，留取剩余胚的部分進(jìn)行激素測(cè)定，樣品液氮粉在-70 ℃超低溫冰箱中保存，直至激素含量測(cè)定.各個(gè)處理均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.3 激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取脫落酸(abscisic acid,ABA)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、吲哚-3-乙酸甲酯(methyl-indole-3-acetic acid,Me-IAA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、茉莉酸-異亮氨酸(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile)、二氫茉莉酸(dihydrojasmonic acid,H2JA)和水楊酸(salicylic acid,SA)標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確到0.01 mg)，用100%甲醇定容到100 mL，配制100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并置于-20 ℃冰箱中避光密封保存.質(zhì)譜分析前用乙腈稀釋成不同梯度濃度.激素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司.

1.4 樣品激素提取

樣品激素提取參照Kojima的研究[11]，取出超低溫保存的不同萌發(fā)天數(shù)的刺梨種子胚，用研磨儀(MM 400,Retsch)研磨(30 Hz,1 min)至粉末狀，準(zhǔn)確稱取50 mg(精確至0.001 g)加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用V甲醇∶V水∶V甲酸=15∶4∶1進(jìn)行提取.提取液濃縮后用100 μL 80%甲醇-水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析.

1.5 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

1) 超高效液相色譜條件.Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：水相為超純水(含0.05%的甲酸)，有機(jī)相為乙腈(含0.05%的甲酸).洗脫梯度：0 min水/乙腈(體積比為95∶5)，1 min水/乙腈(體積比為95∶5)，8 min為5∶95(體積比)，9 min為5∶95(體積比)，12 min為95∶5(體積比).進(jìn)樣量為2 μL，柱溫40 ℃，流速0.35 mL/min.

2) 質(zhì)譜條件.采用電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)，溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓4 500 V，簾氣(CUR)35 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(CAD)參數(shù)設(shè)置為medium.在Q-Trap 6500+中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進(jìn)行掃描檢測(cè).

1.6 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析和作圖均通過(guò)R軟件(v3.7.0)完成.采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)方法(P<0.05)比較不同萌發(fā)時(shí)間內(nèi)刺梨種子內(nèi)源激素ABA、IAA、Me-IAA、JA、JA-Ile、H2JA、SA的變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 激素定性分析

為了將樣品的激素進(jìn)行定性分析，利用不同激素的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，為后續(xù)樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析提供基礎(chǔ).圖1所示為激素標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)質(zhì)譜圖，由圖1可看出各激素的峰型對(duì)稱性和響應(yīng)均良好，適用于本研究的檢測(cè)分析.圖2所示為全部樣品混樣的總離子流圖，各激素的保留時(shí)間不同，無(wú)重疊.

圖1 激素標(biāo)準(zhǔn)品MRM質(zhì)譜圖Fig.1 MRM chromatogram of standard hormone samples

圖2 總離子流圖Fig.2 Total ion flow chart

在對(duì)各激素進(jìn)行定性后，通過(guò)不同濃度的激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液獲取對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)，得到各激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法可對(duì)樣品激素進(jìn)行定量分析.表1所示為激素標(biāo)準(zhǔn)品曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)均在0.996以上.將全部樣品激素的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算，最終可得到樣品激素的絕對(duì)含量數(shù)據(jù).

表1 激素標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量上下限Tab.1 Linear equation,correlation coefficient,upper and lower limit of quantification of hormone standard samples

2.2 激素含量變化分析

2.2.1 脫落酸含量變化 脫落酸(ABA)在維持種子休眠過(guò)程中起著重要的作用.從圖3可以看出在刺梨種子萌發(fā)過(guò)程中ABA的含量總體呈下降趨勢(shì).萌發(fā)10、 20、30 d的刺梨種子ABA含量分別為91.50、65.85、54.70 ng/g，相鄰萌發(fā)階段ABA含量差異均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05).第10 d到20 d含量下降28.03%，到第30 d時(shí)含量共下降了40.21%.

2.2.2 生長(zhǎng)素類含量變化 吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)在植物體內(nèi)普遍存在，IAA可以促進(jìn)種子的萌發(fā).如圖4A 所示刺梨種子在萌發(fā)30 d內(nèi)IAA含量總體呈下降趨勢(shì)，萌發(fā)10、20、30 d刺梨種子IAA的含量分別為111.40、84.23、73.47 ng/g，相鄰萌發(fā)階段IAA含量均差異顯著(P<0.05).IAA含量從第10 d到20 d下降24.39%，到第30 d時(shí)下降了34.05%.

不同小寫(xiě)英文字母表示在P=0.05水平上存在顯著差異,下同.圖3 刺梨種子內(nèi)源ABA含量隨萌發(fā)時(shí)間的變化Fig.3 Changes of endogenous ABA content in Rosa roxburghii Tratt.seeds with germination time

吲哚-3-乙酸甲酯(methyl-indole-3-acetic acid,Me-IAA)是一種植物內(nèi)源性生長(zhǎng)素，和生長(zhǎng)素類協(xié)同調(diào)控種子萌發(fā).如圖4B所示刺梨種子在萌發(fā)30 d內(nèi)其含量總體呈上升趨勢(shì)，萌發(fā)10、20、30 d的Me-IAA含量分別為3.95、5.10、9.43 ng/g，相鄰萌發(fā)階段之間含量差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05).第10 d到第20 d含量上升25.93%，到第30 d時(shí)Me-IAA含量總體上升了138.55%.

圖5所示為刺梨種子內(nèi)IAA/Me-IAA的比值隨萌發(fā)時(shí)間的變化，從圖5可以看出IAA/Me-IAA的變化趨勢(shì)與IAA含量的變化趨勢(shì)一致，在萌發(fā)30 d內(nèi)一直呈顯著下降.

2.2.3 茉莉酸類含量變化 大量研究表明茉莉酸類激素也是促進(jìn)種子休眠的重要激素，且可能與ABA存在互作作用.如圖6A-B所示，茉莉酸(jasmonic acid,JA)和茉莉酸-異亮氨酸(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile)含量均無(wú)顯著性變化(P>0.05).圖6C所示二氫茉莉酸(dihydrojasmonic acid,H2JA)總體呈上升趨勢(shì).萌發(fā)10、20、30 d的H2JA含量分別為2.03、2.46、4.80 ng/g.第10 d到第20 d的H2JA含量上升了21.18%，到第30 d上升了136.29%，每個(gè)萌發(fā)階段之間含量差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05).

圖6 刺梨種子中JA (A)、JA-Ile (B)和H2JA (C)含量隨萌發(fā)時(shí)間的變化Fig.6 The changes of endogenous JA (A),JA-Ile (B) and H2JA (C) contents in Rosa roxburghii Tratt.seeds with germination time

2.2.4 水楊酸含量變化 水楊酸(salicylic acid,SA)是一種萌發(fā)促進(jìn)類激素，圖7可以看出刺梨種子在萌發(fā)30 d內(nèi)SA含量均無(wú)顯著性變化(P>0.05).萌發(fā)10 、20 、30 d的SA含量分別為266.3、241.0、237.7 ng/g.

2.2.5 各激素比值變化 種子的萌發(fā)受到激素間平衡關(guān)系的影響，主要是促進(jìn)類和抑制類激素之間的平衡.由圖8可知，萌發(fā)30 d內(nèi)刺梨種子IAA/ABA 、SA/ABA的比值呈緩慢上升趨勢(shì)，但上升不顯著(P>0.05).SA/JA的比值在第10 d到20 d時(shí)由19.795 4下降至18.978 9，第30 d時(shí)比值下降為17.073 7.

3 討論與結(jié)論

種子的休眠與萌發(fā)并非是單一激素促進(jìn)或抑制的，而是多種激素共同作用的結(jié)果.ABA主要是促進(jìn)種子休眠、抑制萌發(fā)的激素，赤霉素(GA3)是解除種子休眠而促進(jìn)種子萌發(fā)的激素，這兩種激素對(duì)彼此的生物合成和信號(hào)通路產(chǎn)生拮抗作用[12].ABA是在種子成熟過(guò)程中積累的，在種子成熟后達(dá)到最高含量，Andrade[13]在研究番茄種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)種子解除休眠后，ABA的代謝加劇，含量隨著種子萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低.付長(zhǎng)麗[14]在研究成熟玫瑰種子無(wú)菌催芽時(shí)其ABA含量出現(xiàn)波動(dòng)下降現(xiàn)象，這與本研究刺梨種子ABA含量隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低相符合.

除了GA和ABA之外，種子的休眠和萌發(fā)還受到7類激素的調(diào)控，包括生長(zhǎng)素(auxin)、乙烯(ET)、SA、油菜素內(nèi)酯(BRs)、JA、細(xì)胞分裂素(CTKs)[15].其中生長(zhǎng)素類是參與細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂的植物激素，生長(zhǎng)素類也是抑制種子萌發(fā)的激素.IAA是主要的生長(zhǎng)素類之一，植物通過(guò)IAA、Me-IAA、吲哚-3-丁酸(IBA)和IAA衍生物之間互相轉(zhuǎn)化維持生長(zhǎng)素梯度和穩(wěn)態(tài)[16-17].Me-IAA是由IAA羧甲基轉(zhuǎn)移酶IAMT1酯化而成，IAA從酸性轉(zhuǎn)化為非極性，可以促進(jìn)其在細(xì)胞膜之間的運(yùn)輸.甲基脂酶17(MES17)水解Me-IAA生成游離的IAA，使其恢復(fù)生物活性[18-19].Liu等[20]發(fā)現(xiàn)在對(duì)野生型水稻單獨(dú)施加外源IAA時(shí)不能降低其發(fā)芽率，而同時(shí)施用ABA和IAA顯著的抑制了種子萌發(fā)，表明ABA可能通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑抑制種子發(fā)芽.在本研究中，ABA和IAA的含量都呈同一下降趨勢(shì)，說(shuō)明種子休眠在緩慢解除.而Me-IAA含量增多，但是IAA/Me-IAA的比值呈下降趨勢(shì)，猜測(cè)可能是種子在萌發(fā)過(guò)程中有一小部分IAA逐漸被酯化為Me-IAA來(lái)維持生長(zhǎng)素梯度和穩(wěn)態(tài)，從而IAA含量降低，Me-IAA含量上升.

JA及其衍生物通過(guò)干擾過(guò)氧化酶體的三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體和β氧化過(guò)程來(lái)抑制種子萌發(fā)[21-22].Wang等[23]發(fā)現(xiàn)ABA通過(guò)促進(jìn)JA的生物合成來(lái)協(xié)同抑制水稻種子萌發(fā).但韓錦峰[24]發(fā)現(xiàn)施加低濃度的外源JA可以促進(jìn)煙草種子萌發(fā)，也有研究發(fā)現(xiàn)植物在抗逆境中ABA與JA表現(xiàn)出拮抗作用[25].本研究中，JA和JA-Ile含量無(wú)顯著性變化，但是H2JA含量在第20 d至30 d時(shí)快速上升，猜測(cè)在促進(jìn)種子萌發(fā)時(shí)H2JA和ABA呈拮抗作用，且較低濃度的H2JA促進(jìn)種子萌發(fā).

SA是調(diào)節(jié)植物滲透能力的激素，可以誘導(dǎo)植物抵抗生物和非生物脅迫[26].SA是一種促進(jìn)種子萌發(fā)的激素，通過(guò)SA引發(fā)技術(shù)可以顯著促進(jìn)豆類[27]、玉米[28]和水稻[29]的萌發(fā).大量的研究發(fā)現(xiàn)SA對(duì)鹽脅迫下草本種子具有一定促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用因植物種類已經(jīng)脅迫程度不同存在差異[30].Nazari等[31]發(fā)現(xiàn)SA通過(guò)提高甜椒種子萌發(fā)相關(guān)的抗氧化酶活性和降低丙二醛(MDA)含量，減輕種子老化對(duì)發(fā)芽相關(guān)性狀的影響.彭浩[32]發(fā)現(xiàn)ABA與SA在提高玉米種子和幼苗抗鹽能力方面有相互促進(jìn)的效果.在本研究中，刺梨種子在適宜萌發(fā)條件且無(wú)生物或非生物脅迫下，內(nèi)源SA的含量并無(wú)顯著性改變，對(duì)刺梨種子萌發(fā)作用仍需進(jìn)一步研究.

在種子解除休眠和萌發(fā)的開(kāi)始，起關(guān)鍵作用的是激素間的比例[33]，且主要是萌發(fā)促進(jìn)類和抑制類激素的比例.在本研究中，IAA/ABA、SA/ABA呈緩慢上升的趨勢(shì)，但是變化并不顯著.而SA和JA這兩種激素變化并不顯著，但由于種子中SA含量較高，JA含量較低，導(dǎo)致了SA/JA呈下降的趨勢(shì)，且20 d到30 d時(shí)下降較多，推測(cè)隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，種胚中水分的累積在一定程度上抑制了種子的萌發(fā).

綜上所述，刺梨種子的萌發(fā)是ABA、IAA、Me-IAA、JA、JA-Ile、H2JA、SA等多種激素共同作用的結(jié)果，仍需進(jìn)一步研究各激素調(diào)控刺梨種子萌發(fā)的分子機(jī)制，以期為更好地解決刺梨生產(chǎn)中的問(wèn)題提供科學(xué)依據(jù).