氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定植物蛋白飲料中植物甾醇和膽固醇

周 蕾

（北京市朝陽區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100123）

植物蛋白飲料是以一種或多種含有一定蛋白質(zhì)的植物果實(shí)、種子或種仁等為原料，經(jīng)加工或發(fā)酵制成的一類飲品[1]，其保留了原料中所富含的營(yíng)養(yǎng)素、生物活性物質(zhì)和植物化學(xué)物質(zhì)，不僅可部分替代動(dòng)物奶，以滿足奶制品過敏者及乳糖不耐受者對(duì)蛋白質(zhì)的需求，還可作為植物源蛋白飲食中的組成部分來減少疾病和肥胖的發(fā)生[2-4]，因此近年來備受消費(fèi)者的青睞。目前，對(duì)植物蛋白飲料的技術(shù)研發(fā)多集中于生產(chǎn)工藝[5]、產(chǎn)品穩(wěn)定性[6]、理化指標(biāo)[2-3]和摻假鑒定方法[7]等，而對(duì)其生物活性成分的研究較少，尤其缺乏關(guān)于植物蛋白飲料中植物甾醇含量的測(cè)定和特征分析。

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷多氫菲為骨架、結(jié)構(gòu)類似于膽固醇的植物活性物質(zhì)，主要以游離、酯化或糖苷等形式天然存在于植物源食物中，尤以植物油、堅(jiān)果和豆類中含量最高，其植物甾醇總量分別可達(dá)1 055 mg/100 g（米糠油）、158 mg/100 g（腰果）、135 mg/100 g（豌豆）[8-9]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中雙鍵數(shù)量、雙鍵的位置及C24上烷基的差異，可將植物甾醇細(xì)分為不同的種類，如今已鑒定出超過250種植物甾醇及相關(guān)化合物，其中最為常見、含量比較高的為β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等[10-13]。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）研究表明，與安慰劑相比，人體每天攝入1.5～3.0 g植物甾醇和甾烷醇（以游離甾醇計(jì)），血液中的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）膽固醇水平可降低7.0%～12.5%[14-15]。因此，已有多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)植物甾醇及植物甾醇酯在多類食品中添加使用，我國(guó)也于2010年將植物甾醇及植物甾醇酯納入了新食品原料名錄[16]。

目前用精密儀器對(duì)植物甾醇和膽固醇進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定的方法有氣相色譜法[12]、液相色譜法[17-19]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[20-22]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-24]、液相色譜離子阱質(zhì)譜法[25]、超高壓液相色譜質(zhì)譜法[26]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[27-28]、近紅外法[29]等。液相色譜質(zhì)譜/串聯(lián)質(zhì)譜法具有無需衍生、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但儀器普及率較低、操作復(fù)雜、耗費(fèi)較大[25-26，30]。近紅外法無需樣品前處理，為食用油中植物甾醇的測(cè)定提供了一種在線、無損、快速的檢測(cè)方法，但低含量樣品中豆甾醇的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度欠佳[29]。氣相色譜質(zhì)譜法選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，日益成為測(cè)定食品中植物甾醇含量最常用的方法。

本研究擬采用氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)，以5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo)，建立同時(shí)測(cè)定植物蛋白飲料中β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾烷醇5種植物甾醇及膽固醇（動(dòng)物源奶標(biāo)記物）含量的方法，可評(píng)估植物蛋白飲料中植物甾醇含量的同時(shí)，對(duì)該產(chǎn)品中動(dòng)物源奶配料情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。旨在為植物蛋白飲料產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制、功能評(píng)價(jià)等研究提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5α-膽甾烷、豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇（純度均≥97.0%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；膽固醇、豆甾烷醇（純度均≥98.0%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；菜籽甾醇（純度≥98.0%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；正己烷（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；N,O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide∶trimethylchlorosilane，BSTFA∶TMCS=99∶1）衍生化試劑：美國(guó)REGIS Technology公司。無水乙醚（優(yōu)級(jí)純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚（30～60 ℃）、氫氧化鉀、無水乙醇、無水硫酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

植物蛋白飲料樣品，樣品包括2個(gè)豆奶（1#、2#）、2個(gè)椰子汁（3#、4#）、1個(gè)核桃乳（5#）和1個(gè)杏仁露（6#）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 600 Gas Chromatograph-Clarus 600T Mass Spectrometer氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備Clarus autosampler自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)PerkinElmer公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；Elmasonic P 300H數(shù)控超聲波清洗器：Elma-Hans Schmidbauer GmbH＆Co.KG；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)ThermoFisher公司；OA-SYS Heating System N-EVAP 112氮?dú)獯蹈蓛x：美國(guó)Organomation Associ ates，Jnc公司；TLE204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DH-101-2BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電驢有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取10 mg（精確至0.01 mg）5α-膽甾烷、膽固醇和植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，混勻后配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液和甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 樣品處理方法

按照參考文獻(xiàn)[21]中前處理方法并略有改動(dòng)：稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）植物蛋白飲料樣品于10 mL離心管中，依次加入5 μL 5α-膽甾烷內(nèi)標(biāo)使用液，3 mL 4 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，置于85 ℃恒溫箱中皂化1 h后冷卻至室溫。然后加入2 mL去離子水和3 mL正己烷，渦旋2 min后4 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相至另一離心管中，重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相，用去離子水洗至中性，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，氮吹濃縮至約1 mL，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中氮吹至近干，加入20 μL BSTFA：TMCS衍生化試劑，于室溫（25 ℃）條件下衍生40 min，用正己烷定容至1 mL，上機(jī)分析。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：Agilent J&W DB-5 MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%），初始?jí)毫?52.3 kPa，載氣流速16.2 mL/min，柱流速1.20 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL；升溫程序：初始溫度250 ℃，以20 ℃/min升至300 ℃，再以5 ℃/min升至320 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron impact ion source，EI）離子源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)譜接口溫度260 ℃；溶劑延遲時(shí)間3 min；掃描模式：全離子掃描（Full Scan，掃描范圍m/z 50.0～500.0）、選擇離子掃描（selected ions monitoring，SIM）。

表1 5種甾醇和膽固醇及5α-膽甾烷氣相色譜-質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of GC-MS of five phytosterols,cholesterol and 5α-cholestane

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用TurboMass工作站（配備美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST.14譜庫）采集譜圖及處理峰數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

針對(duì)氣相色譜的分流進(jìn)樣、進(jìn)樣口溫度、升溫程序等參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)樣口溫度250 ℃、分流比10∶1、柱流速1.2 mL/min、升溫速率5 ℃/min條件下5種植物甾醇和膽固醇及5α-膽甾烷（內(nèi)標(biāo)）定量離子色譜圖見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不分流進(jìn)樣時(shí)膽固醇和菜籽甾醇、菜油甾醇和豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇的定量離子峰無法有效分離，且峰型較差。分流進(jìn)樣時(shí)峰型好、分離度高，隨著分流比的增大，目標(biāo)峰響應(yīng)值變小，因此選擇分流比為10∶1的分流進(jìn)樣。對(duì)比不同進(jìn)樣口溫度，250 ℃時(shí)組分峰面積略大于220 ℃時(shí)組分峰面積，但隨著溫度從250 ℃提高至300 ℃時(shí)，除β-谷甾醇和豆甾烷醇峰面積先增后減外，其他組分均略微逐漸減小，因此選定進(jìn)樣口溫度為250 ℃。隨著柱流速的增加及升溫程序中升溫速率的提高，各組分峰的出峰時(shí)間逐漸提前，當(dāng)以2 ℃/min升溫至320 ℃時(shí)，目標(biāo)峰能夠與硅烷雜質(zhì)峰完全分開，而以5 ℃/min升溫時(shí)，兩者雖完全重合，但質(zhì)譜具有極高的選擇性，經(jīng)提取特征離子后，并不影響定性及定量，最終選擇柱流速為1.2 mL/min、升溫速率為5 ℃/min，此時(shí)單樣品分析時(shí)間僅需9.5 min，大大提高了檢測(cè)效率。

圖1 5種甾醇和膽固醇及5α-膽甾烷內(nèi)標(biāo)定量離子色譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatograms of five phytosterols,cholesterol and 5α-cholestane

2.2 皂化及提取前處理

取樣量為0.5 g，并參照文獻(xiàn)[18]提高氫氧化鉀-乙醇溶液濃度至4 mol/L，結(jié)果顯示皂化效果良好。對(duì)比正己烷和乙醚∶石油醚（1∶1）兩種提取溶劑，當(dāng)皂化完成，加2 mL去離子水后用乙醚∶石油醚提取時(shí)，出現(xiàn)乙醇共提現(xiàn)象，雖然在隨后用去離子水洗滌提取溶劑時(shí)隨水相與乙醚∶石油醚層分離，但會(huì)造成組分流失，而正己烷可與乙醇＋水相完全分層，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

2.3 甾醇組分衍生化方法

甾醇類組分沸點(diǎn)高、揮發(fā)性差、在高溫下容易失水或者分解，在質(zhì)譜中離子化能力差，因此信號(hào)相對(duì)較弱或不產(chǎn)生信號(hào)（見圖2A），導(dǎo)致分析靈敏度、重現(xiàn)性不理想。為解決這些問題，通常對(duì)其進(jìn)行衍生化處理，其中硅烷化試劑最為常用：BSTFA上甲基硅烷基和甾醇上的羥基發(fā)生氫交換，生成三甲基硅烷化甾醇，其極性降低，熱穩(wěn)定性更好，離子化能力增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度提高[26，30]（見圖2B）。

圖2 5種甾醇和膽固醇及5α-膽甾烷內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液未衍生化（A）和衍生化（B）全掃描色譜圖Fig.2 Full scan gas chromatograms of five phytosterols,cholesterol and mixed standards of 5α-cholestane after underivatization(A) and derivatization (B)

衍生化效率與試劑加入量、反應(yīng)溫度和衍生時(shí)間相關(guān)，以10 mg/L甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)象，以進(jìn)樣小瓶為反應(yīng)容器，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蠓謩e加入5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、100 μL試劑衍生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生組分峰面積并無明顯區(qū)別，為保證衍生充分，選定20 μL的衍生試劑加入量。為提高衍生化效率，通常采用保溫加速衍生化反應(yīng)[13，20-21，24]，以及通過靜置過夜來保證甾醇組分完全衍生化[20]，對(duì)比室溫（25 ℃）、60 ℃、80 ℃、105 ℃保溫條件下衍生化效果，以保溫時(shí)間為橫坐標(biāo)，以5α-膽甾烷內(nèi)標(biāo)校正后的各甾醇組分峰面積與最大值的比值為縱坐標(biāo)作二維坐標(biāo)圖，如圖3所示。

圖3 不同衍生溫度條件下甾醇衍生速率圖Fig.3 Derivatization rate of sterol at different derivation temperature

由圖3可知，隨著衍生時(shí)間延長(zhǎng)，衍生化率逐漸提高至穩(wěn)定，且保溫的溫度越高，其衍生速率越高，越快達(dá)到穩(wěn)定的最大值。但相比于常溫，經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的各保溫條件下衍生組分峰面積略小，可能是因?yàn)楦邷卮龠M(jìn)甾醇衍生化物揮發(fā)所致。而在TMCS的催化下，BSTFA即可在室溫常壓下對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行快速的衍生化反應(yīng)，同時(shí)為減少保溫的操作步驟，本試驗(yàn)選擇室溫（25 ℃）條件下衍生不少于40 min的衍生條件。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

分別取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL各甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，各加入50 μL內(nèi)標(biāo)使用液，用正己烷定容。準(zhǔn)確吸取1 mL各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液至進(jìn)樣小瓶中，經(jīng)氮?dú)獯蹈扇軇┖?，加?0 μL衍生化試劑，密封并靜置40 min后用正己烷定容至1 mL，得到質(zhì)量濃度為0.5～80.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。經(jīng)上機(jī)分析，以甾醇組分與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表2）。由表2可知，5種植物甾醇和膽固醇組分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.999 9）。逐級(jí)配制低濃度甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)衍生后上機(jī)分析，分別以3倍信噪比（S/N）和10倍S/N計(jì)算方法檢出限和定量限，結(jié)果表明，5種植物甾醇和膽固醇組分方法檢出限為0.032～0.058 mg/kg，定量限為0.104～0.190 mg/kg。

表2 5種甾醇和膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of the five phytosterols and cholesterol

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

采用低、中、高（以線性范圍最低點(diǎn)濃度折算到樣品中濃度的1倍、4倍、20倍）3水平加標(biāo)方式，分別選用經(jīng)確認(rèn)的植物甾醇空白樣品（牛奶）和膽固醇空白樣品（純大豆豆奶）作為加標(biāo)對(duì)象，對(duì)植物甾醇和膽固醇進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每一加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率結(jié)果見表3。

表3 膽固醇和植物甾醇的加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery and precision of cholesterol and phytosterols

由表3可知，在0.304～21.3 mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5種植物甾醇和膽固醇的加標(biāo)回收率為90.6%～101.2%，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.0%～5.3%。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可以滿足植物蛋白飲料樣品中5種植物甾醇和膽固醇的同時(shí)測(cè)定。

2.6 樣品測(cè)定與分析

由表4可知，6種樣品均含有β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇，且均以β-谷甾醇為主，杏仁露和核桃露中還含有一定的豆甾烷醇，所測(cè)6種樣品中膽固醇和菜籽甾醇含量均未檢出。豆奶樣品的植物甾醇總量相對(duì)較高，均大于60 mg/kg，而核桃露和杏仁露含量較低，這取決于原料自身植物甾醇的含量及原料的使用量?？傮w而言，植物蛋白飲料中植物甾醇含量雖遠(yuǎn)低于植物油中含量但其不含膽固醇，就日常飲用量計(jì)算得植物甾醇攝入量也遠(yuǎn)低于膳食推薦日攝入量（160～400 mg），但相比于其他飲料，植物蛋白飲料仍不失為日常飲食中植物甾醇的有效來源。

表4 實(shí)際樣品中植物甾醇和膽固醇含量Table 4 Contents of phytosterols and cholesterol in samples

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定植物蛋白飲料中膽固醇和5種常見植物甾醇的GC-MS方法，樣品經(jīng)皂化后對(duì)甾醇類化合物進(jìn)行提取和衍生化，經(jīng)質(zhì)譜SIM模式內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定，5種植物甾醇和膽固醇的方法檢出限為0.032～0.058 mg/kg，定量限為0.104～0.190mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（R2≥0.9999），在低、中、高添加濃度范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為90.6%～101.2%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～5.3%。采用該方法對(duì)市售植物蛋白飲料進(jìn)行分析，不同品種樣品間植物甾醇含量存在明顯差異。該方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高，適用于植物蛋白飲料中植物甾醇和膽固醇的測(cè)定。