車 帥,劉楚怡,王長偉,馮曉梅,杜 芬,李八方
(1.中國海洋大學 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室,山東 青島 266000;2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院,山東 青島 266000;3.中國海洋大學 醫(yī)藥學院,山東 青島 266000)
當今快節(jié)奏的生活方式使得各種壓力充斥著人們的生活,會使得人體產(chǎn)生一系列的以疲乏無力、精神不振為主要表現(xiàn)的疲勞癥狀[1-4]。世界衛(wèi)生組織調查顯示,全球目前有75%的人處于疲勞等“亞健康”狀態(tài),其中男性的比例占60%[5-7]。長期處于疲勞狀態(tài)會逐漸降低人體的免疫能力,甚至導致糖尿病、慢性肝病、腎臟疾病等多種慢性疾病的發(fā)生,嚴重影響人民的生活質量[8-10]。因此抗疲勞、增強免疫力的保健產(chǎn)品逐漸被人們重視。保健酒是指以白酒為酒基,選擇有治療滋補作用的中藥或者藥食同源物質,經(jīng)浸提等工藝生產(chǎn)出的具有一定保健功能的酒劑,中醫(yī)認為白酒具有舒筋活血,溫暖脾胃,祛風散寒等作用,而且白酒具有緩和藥性,增強藥物功效,促進酒中活性成分吸收等功效,因此以白酒作為酒基開發(fā)的保健酒產(chǎn)品有著特殊的活性功能[11-14]。
牡蠣俗稱海蠣子、生蠔,是一種味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富的海洋貝類。研究表明,牡蠣肉中含有豐富的糖原、蛋白質、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等營養(yǎng)物質[15-16]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織評定,牡蠣肉中的必需氨基酸組成評分優(yōu)于人乳和牛乳,因此牡蠣也被稱為“海洋牛奶”[17]。牡蠣中還含有豐富的?;撬?,含量可達到總氨基酸含量的約31%[16,18]。牡蠣作為第一批公布的藥食同源食品之一在保健品中到了廣泛的應用[19-20]。牡蠣肽是牡蠣經(jīng)酶解、分離、純化得到的寡肽混合物,具有顯著的抗疲勞和增強免疫力活性[21-22]。吉宏武等[23]的研究結果表明,牡蠣水解物中蛋白質含量豐富,氨基酸組成完善,通過動物實驗發(fā)現(xiàn)牡蠣原肉和牡蠣水解物均具有抗疲勞作用,且水解物的抗疲勞效果優(yōu)于原肉。張梅超[24]研究發(fā)現(xiàn),用牡蠣蛋白酶解物制成的運動飲料可以顯著地延長小鼠負重力竭游泳的時間,與對照組、陽性對照組相比,在運動前30 min飲用,牡蠣飲料能顯著減少血乳酸與骨骼肌丙二醛的產(chǎn)生,顯著增加肝糖原與肌糖原的含量,而血尿素氮含量無顯著性變化;運動后飲用,30 min內(nèi)小鼠丙二醛和肝糖原含量可快速恢復到安靜狀態(tài)。陶雅浩等[25]研究發(fā)現(xiàn),補充低劑量和中劑量牡蠣肽能延長小鼠力竭游泳時間,提高小鼠力竭運動時蛋白質分解供能能力,節(jié)省力竭運動時肝糖原和肌糖原的使用,減輕力竭運動時骨骼肌損傷程度。許丹等[26]研究表明,牡蠣肽可改善由環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)造成的免疫力低下小鼠的免疫器官結構,恢復小鼠T淋巴細胞比例,增強機體的免疫功能。陳曉文等[27]發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可有效增強小鼠的體液免疫功能。劉淑集等[28]研究表明,牡蠣肽能提高由CTX造成的免疫力低下小鼠的細胞免疫,體液免疫及非特異性免疫,且對小鼠的肝臟和脾臟無顯著影響。蔡冰娜等[29]研究表明,牡蠣肽腸內(nèi)營養(yǎng)制劑可明顯增強小鼠的細胞免疫和自然殺傷(natural killer,NK)細胞活性,并且低劑量組可增強小數(shù)的巨噬細胞吞噬功能。
本研究以實驗室自制低分子質量牡蠣肽為主要原料,輔以枸杞、黃芪、杜仲和西洋參等傳統(tǒng)中藥,經(jīng)浸提、粗濾、調配、冷藏、精濾等步驟研制出一種含有牡蠣肽的新型保健酒(novel health care wine,NHCW),并依據(jù)2003版《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[30]以小鼠為模型開展功能實驗,為開發(fā)緩解體力疲勞和增強免疫力的保健酒提供理論依據(jù)。
1.1.1 材料
含牡蠣肽的保健酒:選取本地濃香型白酒為酒基,輔以枸杞、黃芪、杜仲、西洋參,料液比1∶10(g∶mL),浸泡酒精度40%vol,浸泡時間為21 d,粗濾后加入牡蠣肽、冰糖溶解,完全溶解后于0 ℃冷庫中儲藏7 d,經(jīng)冷凍離心后,過0.45 μm微孔膜過濾后得到自制含牡蠣肽的保健酒。人體推薦攝入量為100 mL/d,每人按60 kg體質量計。
1.1.2 試劑
RPMI1640細胞培養(yǎng)基、小牛血清、β-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、Hank's液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(pH7.2~7.4)、綿羊紅細胞(sheep red blood cell,SRBC)、補體(豚鼠血清)、水楊酸緩沖液(salicylic acid buffer,SA)、Giemsa染液、雞紅細胞、肝糖原測定試劑盒:京索萊寶科技有限公司;都氏試劑:美國Sigma公司;鹽酸、異丙醇、丙酮、甲醇(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;血尿素氮測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。
1.1.3 實驗動物
BALB/c成年小鼠(無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,體質量18~22 g,全雄):濟南彭悅實驗動物有限公司。
Heracell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱:美國Thermo Fisher公司;VersaMax酶標儀:美國Molecular Devices公司;UV-5500分光光度計:上海元析儀器有限公司;SW-CJ-2D超凈工作臺:浙江蘇凈凈化設備有限公司;YXQ-LS-100A高壓滅菌鍋:上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;Centrifuge5418R離心機:德國Eppendorf公司;HWS-26恒溫水浴鍋:上海一恒科技有限公司;CX31顯微鏡:日本Olympus公司;BSA224S電子天平:德國Sartorius公司;PB100-SP10手持式勻漿機:英國Prima公司。
1.3.1 動物實驗
參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)。將實驗室自制含牡蠣肽保健酒,按照要求降低乙醇含量至15%。分別設置4個劑量組:陰性對照組(乙醇含量15%的基酒)、低劑量組(人體推薦攝入量的5倍,8.4 mL/kg)、中劑量組(人體推薦攝入量的10倍,16.7 mL/kg)、高劑量組(人體推薦攝入量的20倍,33.4 mL/kg),另外設一個空白對照組(經(jīng)口灌胃生理鹽水),每組BALB/c成年小鼠70只。實驗小鼠除每天給予基礎飼料和水外,每天經(jīng)口灌胃相應體積受試樣品一次,受試樣品給予時間為30 d。
1.3.2 緩解體力疲勞實驗
小鼠負重游泳實驗:實驗前1 h小鼠禁食不禁水,末次給予受試樣品30 min后,每組取10只小鼠將尾根部負荷5%體質量鉛皮,置于水深不少于30 cm,水溫(25±1.0)℃游泳桶內(nèi)進行負重游泳實驗(每次下水的小鼠不超過4只)。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間,即小鼠負重游泳時間。
小鼠運動后血清尿素含量的測定:實驗前1 h小鼠禁食不禁水,末次給予受試樣品30 min后,每組取10只小鼠置于水深不少于30 cm,水溫(25±1.0)℃游泳桶內(nèi)進行不負重游泳實驗(每次下水的小鼠不超過4只)90 min。休息60 min后采血。小鼠拔眼球采全血約0.5 mL(不加抗凝劑)。置于4 ℃冰箱約3 h,血凝固后2 000 r/min離心15 min,取血清備用。血清尿素含量通過二乙酰-肟法測定。測定步驟按血尿素氮含量測定試劑盒操作。
小鼠運動后肝糖原含量的測定:實驗前1 h小鼠禁食不禁水,末次給予受試樣品30 min后,每組取10只小鼠置于水深不少于30 cm,水溫(25±1.0)℃游泳桶內(nèi)進行不負重游泳實驗90 min。游泳結束后頸椎脫臼處死,取新鮮肝臟樣品,用生理鹽水漂洗后用濾紙吸干,稱質量。用手持式勻漿機充分勻漿后,離心取上清,按肝糖原含量測定試劑盒操作進行測定。
1.3.3 增強免疫力實驗
對小鼠體質量和脾臟器官的影響:實驗前1 h小鼠禁食不禁水,末次給予受試樣品30 min后,每組取10只小鼠稱質量,頸椎脫臼處死后立即取脾臟和肝臟,去凈筋膜,用濾紙吸干表面血污,稱量脾臟(肝臟)質量,按照下式計算脾臟(肝臟)指數(shù):
Con A誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗:實驗前1 h小鼠禁食不禁水,末次給予受試樣品30 min后,每組取10只小鼠無菌取脾。將脾臟去凈筋膜后置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中,制成細胞懸液,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾。用Hank's液洗2次,每次用離心機1 000 r/min離心10 min。將細胞懸浮于1 mL完全培養(yǎng)液中,計數(shù)活細胞數(shù),用RPMI1640培養(yǎng)液調整其細胞濃度至3×106個/mL。再將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,在其中一孔加入75 μL ConA液(相當于7.5 μg/mL),另一孔不加作為對照,培養(yǎng)板置于5%CO2條件下37 ℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7 mL,加入1 mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,同時向每孔中加入5 mg/mL的MTT 50 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后,每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打均勻,使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中,每個培養(yǎng)孔重復平行3次,使用酶標儀在波長570 nm處測定吸光度值A,參照下式計算淋巴細胞增值能力:
淋巴細胞的增殖能力=ODConA-OD空白
小鼠血清溶血素含量測定:受試樣品經(jīng)口灌胃3 d后每只小鼠經(jīng)腹腔注射2%(V/V,用生理鹽水配制)壓積綿羊紅細胞(SRBC)0.2 mL進行免疫。連續(xù)給藥7 d,于末次給予受試樣品30 min后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),4 ℃放置約1 h,使血清充分析出,2 000 r/min 離心10 min,收集血清。取血清用SA緩沖液稀釋200倍,取稀釋后血清1 mL置于試管內(nèi),依次加入0.5 mL用SA緩沖液配制的10%壓積SRBC和1 mL補體,混勻。另設不加血清的對照管(以SA緩沖液代替)。置于37 ℃恒溫水浴中保溫30 min 后,冰浴終止反應。用離心機2 000 r/min 離心10 min,取上清1mL,加都氏試劑3 mL。同時取0.25 mL 10%(V/V)壓積SRBC,加入都氏試劑至體積為4 mL于另一試管中,充分混勻,放置10 min 后,于540 nm 處以對照管作空白,分別測定各管吸光度值(A)。以半數(shù)溶血值(half value of hemolysin,HC50)表示溶血素水平,按下式計算:
小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗:實驗前4 d給每只小鼠腹腔注20%的壓積雞紅細胞懸液1 mL,間隔30 min,頸椎脫臼處死,仰位固定于鼠板上,正中剪開腹壁皮膚,經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL,轉動鼠板1 min。取腹腔巨噬細胞洗液1 mL,滴于載玻片上,放入墊有濕紗巾的搪瓷盒內(nèi),置于37 ℃孵箱溫育30 min。孵畢,于生理鹽水中漂洗以除去未貼片細胞。晾干,以甲醇∶丙酮(1∶1)固定,4%Giemsa-磷酸緩沖液染色,用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下每片計數(shù)100個巨噬細胞,按下式計算吞噬百分率:
1.3.4 統(tǒng)計分析
采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件包中多個樣本比較的方法進行統(tǒng)計學分析,計量數(shù)均用平均數(shù)±標準差(x±s)表示,以P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
2.1.1 含牡蠣肽保健酒對小鼠負重游泳時間的影響
含牡蠣肽保健酒對小鼠負重游泳時間的影響如圖1所示。由圖1可知,陰性對照組小鼠負重游泳時間為753 s,與空白對照組相比,無顯著差異(P>0.05);低劑量組與陰性對照組相比,小鼠負重游泳時間顯著提高(P<0.05),為1415s;中劑量組與陰性對照組相比,小鼠負重游泳時間有所增加,為1 230 s,但是差異并不顯著(P>0.05);高劑量組與陰性對照組相比,小鼠負重游泳時間有所降低,為736 s,差異不顯著(P>0.05)。綜上所述,低劑量含牡蠣肽保健酒可以顯著提高小鼠的負重游泳時間,具有緩解體力疲勞的效果。
圖1 含牡蠣肽保健酒對小鼠負重游泳時間的影響Fig.1 Effect of health care wine containing oyster peptide on the swimming periods of loading mice
2.1.2 含牡蠣肽保健酒對小鼠血清尿素含量的影響
機體在運動時,體內(nèi)能量平衡遭到破壞,糖原被消耗,蛋白質及氨基酸的分解代謝被加強。尿素氮是蛋白質代謝的產(chǎn)物,在長時間較大強度的運動時,尿素氮變化范圍明顯,因此尿素氮與機體運動適應能力、疲勞程度以及負荷量的大小密切相關。含牡蠣肽保健酒對小鼠血清尿素含量的影響見圖2。由圖2可知,陰性對照組與空白對照組相比,小鼠血清尿素含量稍有增加,為9.53 mmol/L,但差異不顯著(P>0.05);低劑量組和中劑量組與陰性對照組相比,小鼠血清尿素含量均顯著降低(P<0.05),分別為8.21 mmol/L和8.46 mmol/L;高劑量組與陰性對照組相比,小鼠血清尿素含量略有升高,平均為10.05 mmol/L,但差異不顯著(P>0.05)。綜上所述,低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒能減少疲勞小鼠血清尿素的產(chǎn)生。
圖2 含牡蠣肽保健酒對小鼠血清尿素含量的影響Fig.2 Effect of health care wine containing oyster peptide on blood urea nitrogen concentration in mice
2.1.3 含牡蠣肽保健酒對小鼠肝糖原含量的影響
糖是人體的主要供能物質,人體的糖主要是葡萄糖和糖原。糖原的耗竭會影響腦細胞功能,造成中樞疲勞、運動能力降低等,當體內(nèi)糖的貯藏量增加,可以延緩上述現(xiàn)象的出現(xiàn)。因此,肝糖原含量是反映疲勞程度的敏感指標。含牡蠣肽保健酒對小鼠肝糖原含量的影響見圖3。
圖3 含牡蠣肽保健酒對小鼠肝糖原含量的影響Fig.3 Effect of health care wine containing oyster peptide on liver glycogen concentration in mice
由圖3可知,陰性對照組與空白對照組相比,小鼠肝糖原的含量無顯著差異(P>0.05);低劑量組和中劑量組與陰性對照組相比,小鼠肝糖原的含量均有顯著提高(P<0.05),分別為4.31mg/g和3.62mg/g;高劑量組與陰性對照組相比,小鼠肝糖原的含量顯著降低(P<0.05),為2.91 mg/g。綜上所述,低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒對小鼠肝糖原的儲備有促進作用,高劑量的金牡蠣保健酒對小鼠肝糖原的儲備有抑制作用。
2.2.1 含牡蠣肽保健酒對小鼠體質量和臟器的影響
含牡蠣肽保健酒對小鼠體質量的影響見圖4。由圖4可知,實驗進行過程中,各劑量組小鼠精神狀態(tài)良好,未見異常反應??瞻讓φ战M,低、中、高各劑量組與陰性對照組相比,小鼠體質量無顯著差異(P>0.05),表明含牡蠣肽保健酒和基酒均對小鼠的體質量無顯著影響。
圖4 含牡蠣肽保健酒對小鼠體質量的影響Fig.4 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice body mass
脾臟指數(shù)是反映機體免疫功能的重要指標。脾臟是最大的外周免疫器官,是B淋巴細胞成熟發(fā)育的場所。含牡蠣肽保健酒對小鼠脾臟指數(shù)的影響見圖5。
圖5 含牡蠣肽保健酒對小鼠脾臟指數(shù)的影響Fig.5 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice spleen index
由圖5可知,陰性對照組與空白對照組相比,小鼠脾臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05),表明基酒不會對小鼠脾臟產(chǎn)生損害;低劑量組和中劑量組與陰性對照組相比,小鼠的脾臟指數(shù)升高,分別為0.005 6和0.005 4,但無顯著差異(P>0.05);高劑量組與陰性對照組相比,小鼠脾臟指數(shù)略有降低,但無顯著差異(P>0.05)。綜上所述,低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒可能對小鼠有提高免疫功能的作用。
肝臟是主要的酒精代謝器官,含牡蠣肽保健酒對小鼠肝臟指數(shù)的影響見圖6。
圖6 含牡蠣肽保健酒對小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.6 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice liver index
由圖6可知,空白對照組,低、中、高各劑量組與陰性對照組相比,肝臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05),綜上所述,含牡蠣肽保健酒對小鼠的肝臟無損害。
2.2.2 含牡蠣肽保健酒對小鼠細胞免疫的影響
T淋巴細胞是來源于骨髓多功能干細胞,該細胞進入胸腺以后,胸腺內(nèi)發(fā)育成熟。T細胞受抗原物質刺激后能分化增殖、發(fā)生特異性免疫應答,是機體最重要的免疫效應細胞,T淋巴細胞增殖能力是反映機體細胞免疫的重要指標。含牡蠣肽保健酒對小鼠細胞免疫的影響見圖7。
圖7 含牡蠣肽保健酒對小鼠細胞免疫的影響Fig.7 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice cellular immunity
由圖7可知,含牡蠣肽保健酒低劑量和中劑量組均能顯著增加小鼠脾淋巴細胞的轉化率(P<0.05),分別為0.325和0.263;高劑量組小鼠脾淋巴細胞有所降低,為0.151,但差異不顯著(P>0.05)。綜上所述,低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒對于小鼠細胞免疫力有一定的提高作用。
2.2.3 含牡蠣肽保健酒對小鼠體液免疫的影響
含牡蠣肽保健酒對小鼠體液免疫的影響見圖8。由圖8可知,陰性對照組與空白對照組相比,小鼠的半數(shù)溶血值(HC50)沒有顯著差異(P>0.05),為71.6;低劑量組和中劑量組與陰性對照組相比,均能顯著提高小鼠的半數(shù)溶血值(P<0.05),分別為100.2和85.6;高劑量組與陰性對照組相比,顯著降低小鼠的半數(shù)溶血值(P<0.05),為68.3。綜上所述,低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒對于小鼠體液免疫力有一定的提高作用,高劑量組對體液免疫有抑制作用。
圖8 含牡蠣肽保健酒對小鼠體液免疫的影響Fig.8 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice humoral immunity
2.2.4 含牡蠣肽保健酒對小鼠單核—巨噬細胞的影響
單核—巨噬細胞既是效應細胞,又是免疫調節(jié)細胞。它是機體非特異性免疫系統(tǒng)的主要組成部分,當有異體抗原性物質侵入時,可引起巨噬細胞的聚集并吞噬,反映了機體非特異性免疫功能;同時也是特異性免疫系統(tǒng)中極重要的輔佐和效應細胞,在特異性免疫應答中,巨噬細胞可分泌釋放多種細胞因子,參與免疫調節(jié)。含牡蠣肽保健酒對小鼠單核—巨噬細胞的影響見圖9。
圖9 含牡蠣肽保健酒對小鼠單核巨噬細胞的影響Fig.9 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice mononuclear macrophage
由圖9可知,陰性對照組和空白對照組相比,小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力稍有降低,為31.2%,但無顯著性差異(P>0.05);低、中劑量組與陰性對照組相比,小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力顯著升高(P<0.05),分別為57.2%和44.7%;高劑量組與陰性對照組相比,小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力顯著降低(P<0.05),為26.5%。綜上所述,低劑量和中劑量的金牡蠣保健酒對于小鼠單核—巨噬細胞功能提高有一定作用,高劑量組對單核—巨噬細胞功能有抑制作用。
本研究以實驗室自制含牡蠣肽的保健酒為原料,依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》2003版的要求,對其緩解體力疲勞和增強免疫力兩種功能進行評價。緩解體力疲勞功能實驗結果顯示,低劑量含牡蠣肽保健酒可以顯著提高小鼠的負重游泳時間(P<0.05);低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒能顯著減少疲勞小鼠血清尿素的產(chǎn)生(P<0.05);低劑量和中劑量的含牡蠣肽保健酒對小鼠肝糖原的儲備有顯著促進作用(P<0.05),高劑量的金牡蠣保健酒對小鼠肝糖原的儲備有顯著抑制作用(P<0.05)。根據(jù)具有緩解體力疲勞功能作用的結果判定標準:負重游泳實驗結果陽性,且血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原三項生化指標中任二項指標陽性,可判定受試具有緩解體力疲勞功能作用。由研究結果可判定含牡蠣肽保健酒具有緩解體力疲勞功能作用。增強免疫力功能試驗結果顯示,含牡蠣肽保健酒和基酒均對小鼠的體質量無顯著影響(P>0.05);低劑量組,中劑量組和高劑量組與陰性對照組相比,小鼠的脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05);低劑量和中劑量組均能顯著增加小鼠脾淋巴細胞的轉化率(P<0.05);低劑量組和中劑量組與陰性對照組相比均能顯著提高小鼠的半數(shù)溶血值(P<0.05),高劑量組顯著降低小鼠的半數(shù)溶血值(P<0.05)。根據(jù)具有增強免疫力功能作用的結果判定標準,在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結果陽性,可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用。由以上研究結果可判定含牡蠣肽保健酒具有增強免疫力功能作用。