不同百合樣品中13 種內(nèi)源性游離糖的含量分析

孔 瀅，王 歡，郎利新，竇曉瑩，白錦榮,*

（1.北京市輻射中心，北京 100875；2.北京市科學(xué)技術(shù)研究院，北京 100089；3.北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，射線束技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875）

百合是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物，地下部分具肉質(zhì)鱗莖，富含多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用品種[1-2]。百合用作藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“味甘，平。主邪氣腹張，心痛，利大小便，補(bǔ)中益氣”[3]?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版）中收錄了3 種藥用百合，包括卷丹（L.lancifolium）、百合（L.browniivar.viridulum）和細(xì)葉百合（又名山丹，L.pumilum），入藥部位為干燥肉質(zhì)鱗片，“味微苦”，有“養(yǎng)陰潤肺、清心安神”的功效[4]。食用百合有著悠久的栽培歷史，是當(dāng)前市場上熱銷的特種蔬菜類型[2,5]，主要為百合（商品名龍牙百合，為區(qū)分本實(shí)驗(yàn)中使用商品名）、卷丹（商品名宜興百合、龍山百合等）和蘭州百合（L.davidiivar.willmottiae）的鱗莖[6]。不同百合在營養(yǎng)成分含量、品質(zhì)和風(fēng)味上存在差異[7]，例如卷丹口感帶有苦味，被稱為“苦百合”[2]，而蘭州百合因口感甜美被稱為“甜百合”[8]。除新鮮鱗莖直接食用外，百合還常被做成百合干和百合粉等[9]，百合干既是中藥百合的主要制成品，也是蘭州百合的主要加工產(chǎn)品之一[6]。

百合鱗莖中富含糖類物質(zhì)，不僅有高含量的淀粉，還有內(nèi)源性游離態(tài)的單糖和二糖等。大部分游離態(tài)單糖和二糖易溶于水、有不同程度的甜味[10]，和百合的“甜味”品質(zhì)有關(guān)。糖類是生命體的基本組成部分和重要營養(yǎng)物質(zhì)，也是食品中的重要風(fēng)味成分和營養(yǎng)成分[11]。此外，糖作為滲透劑和信號(hào)分子還參與了植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)[12]，例如阿拉伯糖在耐鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用[13]；海藻糖可以在干旱、寒冷等極端條件下穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，是脅迫保護(hù)劑，被稱為“生命之糖”[14-15]；糖還作為碳源和代謝底物參與花青苷的生物合成[16]。目前糖含量的測定方法主要有化學(xué)法和儀器分析法[17]，化學(xué)法可以測定食品中的還原糖和可溶性糖總量，但無法確定糖的種類；用高效液相色譜法檢測則需要專用檢測器[18]。糖類化合物本身不具有揮發(fā)性，其硅醚化衍生物卻有著很好的揮發(fā)性，能夠通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用進(jìn)行定性定量分析，該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且具有高分辨率和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在棗（Zizyphusjujube）和甘薯（Ipomoeabatatas）等植物中開展了應(yīng)用[18-20]。

本研究對(duì)不同百合樣品中的13 種內(nèi)源性游離態(tài)單糖和二糖（以下簡稱游離糖）的含量進(jìn)行GC-MS聯(lián)用檢測，分析不同百合樣品間糖種類及含量的差異與原因，以期為百合資源評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇來自不同產(chǎn)地的食用藥用百合鮮鱗莖10 份（包括蘭州百合、山丹、卷丹和龍牙百合等）、百合干2 份（蘭州百合干和龍牙百合干），選擇岷江百合（L.regale）鱗莖、亞洲百合‘Tresor’鱗莖和卷丹珠芽為對(duì)照。百合鱗莖及珠芽先在冷藏箱中（4 ℃，相對(duì)濕度70%）貯藏2～3 周，然后剝?nèi)“俸削[莖的中層鱗片，沖洗干凈后吸干水分，快速切成1～2 cm的小塊，液氮速凍后保存；百合珠芽剝?nèi)プ钔鈱喻[片后置于液氮中速凍后保存。龍牙百合干購自北京同仁堂藥房，蘭州百合干購自臨洮雪源金正百合有限責(zé)任公司。具體信息見表1。

表1 百合樣品信息Table 1 Information on lily samples tested in this study

N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）（純度99%）、甲醇、正己烷和異丙醇（均為色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧胺鹽（純度99%）、吡啶（純度99%） 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)品D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-巖藻糖、乳糖和肌醇 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；木糖醇、D-果糖、葡萄糖、麥芽糖 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；D-半乳糖、D-山梨醇和海藻糖 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；蔗糖 北京索萊寶科技有限公司；內(nèi)標(biāo)核糖醇 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MM 400研磨儀 德國Retsch公司；7890B-7000D GC-MS聯(lián)用儀 安捷倫科技（中國）有限公司；SCIENTZ-50ND真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；5424R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品衍生化

將超低溫冷凍樣品進(jìn)行真空冷凍干燥后，用研磨儀研磨（1.5 min，30 Hz）成粉末狀。稱取20 mg的粉末溶解于500 μL甲醇-異丙醇-水（3∶3∶2，V/V）提取液中，渦旋3 min，冰水中超聲30 min；4 ℃、14 000 r/min離心3 min后，吸取50 μL上清液，加入20 μL內(nèi)標(biāo)，氮吹并凍干機(jī)凍干。加入100 μL甲氧銨鹽吡啶（15 mg/mL），37 ℃孵育2 h，隨后加入N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺100 μL，37 ℃孵育30 min得到衍生化溶液。用正己烷稀釋，保存于棕色進(jìn)樣瓶中用于GC-MS分析。每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 GC-MS測定

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣氦氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣模式分流，分流比3∶1；程序升溫：起始溫度70 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至112 ℃后保持3 min，以15 ℃/min升至175 ℃后保持1 min，以3 ℃/min升至190 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至240 ℃后保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃后并保持3 min；傳輸線溫度240 ℃。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；選擇離子掃描模式。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與樣品定量

配制核糖醇內(nèi)標(biāo)，衍生化后稀釋成50 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品為配制13 種糖類標(biāo)準(zhǔn)品的混合液，衍生化后得到150 μg/mL的混合液，稀釋成不同梯度進(jìn)行GC-MS檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)考察線性。得到的各物質(zhì)的線性回歸方程（表2）。將檢測到的所有樣本糖類的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，最終得到實(shí)際樣本中糖類的含量，公式如下：

式中：A為樣本中糖類的含量/（mg/g）；B為樣本中糖類積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；C為定容所用溶液的體積/μL；E為樣品提取過程中加入樣本提取液的體積/μL；D為樣品提取過程中收集上清液的體積/μL；F為稱取的樣本質(zhì)量/g。

甜度值計(jì)算參照文獻(xiàn)[21-22]的方法并略加修改，以蔗糖甜度值為1.00，葡萄糖為0.70，果糖為1.75（表2）。L-巖藻糖和D-阿拉伯糖甜度值未知，在各個(gè)樣品中含量較低，做缺失值處理。

表2 糖類標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及甜度值Table 2 Calibration equations, correlation coefficients and sweetness of sugar standards

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行方差分析（P＜0.05）。用Rstudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與圖片繪制，使用corrplot包進(jìn)行相關(guān)性分析[26]，使用ComplexHeatmap包進(jìn)行聚類分析和熱圖繪制[27]，使用factoextra包進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同百合的游離糖含量

如表3所示，在15 個(gè)百合樣品中共檢測到13 種游離糖。對(duì)游離糖總含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示蘭州百合和山丹（承德）中的總含量很高（111.772～143.432 mg/g）；山丹（延安）、卷丹、龍牙百合、蘭州百合干、岷江百合和卷丹珠芽中的總含量處于中等水平（47.302～83.515 mg/g）。龍牙百合干和‘Tresor’鱗莖的總含量最低（10.250～18.945 mg/g）。具體種類而言，蔗糖在各個(gè)樣品中的含量均為最高（9.290～135.000 mg/g），除岷江百合外占到游離糖總含量的86%以上，遠(yuǎn)高于其他糖類。葡萄糖（0.204～17.057 mg/g）和果糖（0.236～5.010 mg/g）的含量也較高；麥芽糖（NA～3.603 mg/g）、肌醇（0.065～1.275 mg/g）和海藻糖（0.035～0.976 mg/g）在一些樣品中的含量也較高，其他游離糖的含量處于極低水平。整體而言，所有百合樣品中含量最高的3 種游離糖為蔗糖、葡萄糖和果糖（圖1）。

表3 不同百合樣品中的13 種內(nèi)源性游離糖含量及甜度值Table 3 Contents of 13 intrinsic free sugars and sweetness in different lily samples

圖1 不同內(nèi)源性游離糖種類在百合樣品中的含量Fig.1 Contents of intrinsic free sugars in different lily samples

2.2 卷丹鱗莖和卷丹珠芽的游離糖含量

對(duì)不同產(chǎn)地的卷丹鱗莖中的游離糖含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)卷丹鱗莖樣品中游離糖種類和含量都很接近。卷丹（阿壩）為野生狀態(tài)，種球周徑最小，大部分游離糖含量都低于其他卷丹樣品（表3）。卷丹（宜興）中的蔗糖∶葡萄糖為52.72∶1，與其他卷丹鱗莖樣品差異較大（表3）。卷丹（龍山）中海藻糖含量是其他卷丹鱗莖的2～3 倍，顯著高于其他卷丹樣品（圖1），推測卷丹（龍山）可能有著更高的抗性。

卷丹珠芽中共檢測到10 種游離糖，比同產(chǎn)地的卷丹（阿壩）多1 種（乳糖），游離糖總含量是卷丹（阿壩）的1.5 倍，其中蔗糖、果糖和葡萄糖含量分別比卷丹（阿壩）高出48%、160%和168%。同時(shí)卷丹珠芽中游離糖總含量也略高于其他卷丹樣品（表3）。與其他卷丹樣品相比，卷丹珠芽中的果糖、葡萄糖和乳糖含量上有顯著優(yōu)勢。卷丹珠芽為紫黑色，是卷丹地上部分主要的淀粉貯藏器官，可入菜或熬湯，含有大量的花青苷[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)蔗糖、葡萄糖和果糖能促進(jìn)蘿卜（Raphanus sativus）下胚軸中花青苷和葡萄（Vitisvinifera）果肉花青苷的積累[30-31]，推測卷丹珠芽中的游離糖含量差異可能和花青苷積累有關(guān)。

2.3 百合干的游離糖含量

如表3所示，與同種的百合鱗莖相比，蘭州百合干和龍牙百合干中的游離糖總含量和3 種主要的游離糖含量有明顯降低，總含量分別下降36%和83%、蔗糖含量分別下降了36%和84%、葡萄糖含量分別下降了42%和38%、果糖含量分別下降了51%和63%。但是百合干中的游離糖種類有所增加，蘭州百合干同比增加了L-鼠李糖和乳糖，龍牙百合干同比增加了木糖醇，但是含量都比較低。未發(fā)現(xiàn)百合干中特有的游離糖物質(zhì)。

有研究發(fā)現(xiàn)中藥材澤瀉炮制成澤瀉飲片后，還原糖果糖和葡萄糖的含量有所下降，推測是由于炮制的熱加工過程中造成的[32]。百合干在加工過程中，用100 ℃熱水對(duì)清洗后的干凈鱗片短時(shí)間（2 min）燙漂，發(fā)生了游離糖的水解導(dǎo)致含量下降[6]。盡管百合鱗片中富含淀粉，由于熱加工時(shí)間短未發(fā)生完全水解，所以百合干中的游離糖含量沒有提高。

2.4 不同百合甜度值比較

對(duì)百合樣品的甜度值計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，百合樣品的甜度值與游離糖總含量水平基本一致（表3）。具體而言，山丹（承德）和蘭州百合的甜度值最高，亞洲百合‘Tresor’鱗莖和龍牙百合干的甜度值最低，其他百合樣品的甜度值為中等水平。蔗糖與甜度值的相關(guān)系數(shù)非常高（Pearson相關(guān)系數(shù)為0.99），這是由于蔗糖在百合游離糖中占絕對(duì)主導(dǎo)地位，說明蔗糖的含量多少可以體現(xiàn)百合中甜度值的高低（表4）。

“甜百合”蘭州百合鱗莖中的蔗糖含量和甜度值較高；“苦百合”卷丹蔗糖含量和甜度值較低，說明甜度值和百合口感正相關(guān)。藥用的龍牙百合干中的蔗糖含量和甜度值都很低，驗(yàn)證了藥典中描述的藥用百合鱗片“氣微，味微苦”。但是甜度值又不能完全反應(yīng)百合口感，因?yàn)榘俸献鳛樗幨硟捎弥参?，含有多種活性成分如酚類物質(zhì)、皂苷和生物堿等[33]，這些會(huì)導(dǎo)致口感發(fā)澀發(fā)苦。例如蘭州百合（蘭州）中未檢測到甾體皂苷[34]，而3 種藥用百合和藥用百合干中都含有較高的甾體皂苷含量[35]。有研究認(rèn)為岷江百合有著較高的營養(yǎng)品質(zhì)，但其口感苦澀[36]，這可能和岷江百合的紫色鱗莖中有高含量的多酚物質(zhì)有關(guān)[37]。

表4 百合樣品中內(nèi)源性游離糖含量及甜度值的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between contents of intrinsic free sugars and sweetness in different lily samples

2.5 不同百合間的游離糖含量差異

由于蔗糖含量和其他游離糖的含量差異較大，數(shù)據(jù)均一化處理后對(duì)不同百合樣品的游離糖含量進(jìn)行聚類分析和PCA。如圖2所示，聚類分析將本實(shí)驗(yàn)的15 個(gè)樣品被分為6 組：2 種百合干聚為組A；‘Tresor’聚為組B；大部分龍牙百合聚為組C且距離較近，同組中還有岷江百合；絕大部分的卷丹和卷丹珠芽聚為組D；大部分山丹樣品聚為組E；蘭州百合樣品聚為組F。盡管在龍牙百合（萬載）、卷丹（漫水河）和山丹（延安）的樣品中存在著種內(nèi)差異，但整體而言，百合鱗莖樣品在游離糖組成上是（品）種間差異大于（品）種內(nèi)差異。

如圖3所示，蘭州百合、山丹和岷江百合在多種游離糖的含量上較為突出。其中，山丹中除了蔗糖含量較高（80.300～135.000 mg/g），還有最高含量的麥芽糖（1.309～3.603 mg/g）；蘭州百合中的蔗糖含量很高（106.333～111.033 mg/g），還有較高含量的葡萄糖（1.870～2.600 mg/g）和果糖（1.394～2.010 mg/g）等；岷江百合中雖然蔗糖含量不高，但有最高含量的果糖（5.010 mg/g）和葡萄糖（17.057 mg/g），顯著高于其他百合樣品。

圖2 不同百合樣品中內(nèi)源性游離糖含量的聚類分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of the contents of intrinsic free sugars in different lily samples

圖3 不同百合樣品中內(nèi)源性游離糖含量的PCAFig.3 Principal component analysis of the contents of intrinsic free sugars in different lily samples

不同產(chǎn)地的卷丹差異不大，但不同產(chǎn)地的蘭州百合和山丹中有著較大差異。山丹（承德）中的所有游離糖含量都高于山丹（延安），這種差異除了生長環(huán)境不同，可能和種球大小有關(guān)，山丹（承德）的種球更大，能夠積累更多的糖類物質(zhì)，導(dǎo)致游離糖含量高于山丹（延安）。不同來源的蘭州百合種內(nèi)差異也較大，這可能受到冷藏時(shí)間的影響。蘭州百合（蘭州）為真空包裝的鮮百合，冷藏時(shí)間未知，而不同時(shí)間的低溫冷藏對(duì)蘭州百合的可溶性糖含量影響較大[38]。岷江百合有著紫色鱗莖，富含花青苷，游離糖含量與其他百合的白色鱗莖樣品有著明顯的差異，推測是由于葡萄糖和果糖等糖類參與了鱗莖中花青苷的合成與積累。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)百合中內(nèi)源性游離糖的種類和含量進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果顯示山丹和蘭州百合的鱗莖中蔗糖含量和游離糖總含量較高；卷丹和龍牙百合的鱗莖中蔗糖含量和游離糖總含量較低；岷江百合中的果糖和葡萄糖含量很高。不同產(chǎn)地的山丹和蘭州百合中游離糖含量差異較大。山丹、蘭州百合和岷江百合在多種游離糖上含量較高，有著很好的開發(fā)應(yīng)用潛力。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，鱗片中含有花青苷的岷江百合和卷丹珠芽中都有較高的果糖和葡萄糖含量，它們?cè)诨ㄇ嘬蘸铣珊头e累中的作用有待進(jìn)一步研究。