基于代謝組學和轉錄組學分析工業(yè)面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）ABY3冷凍脅迫應答機制

孟 露，劉晗誠，劉雅涵，林 雪,*，劉四新，李從發(fā)

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 ?？?570228；2.海南大學理學院，海南 ?？?570228）

近年來，冷凍面團技術因具有簡化面團發(fā)酵產品生產流程、降低生產成本及減少人力資源浪費等優(yōu)點被廣泛應用[1-3]。在我國，饅頭、包子等不加糖面團發(fā)酵面食更為豐富，且在提倡低糖低脂健康飲食的大環(huán)境下，不加糖或低糖（加糖量低于6%）面包受到眾人的偏愛。然而，經冷凍儲藏的面團品質會大大降低，如面團內部形成的冰晶和冰晶重結晶不僅破壞面筋蛋白的網絡結構，還使酵母活性受到極大的損傷[4-6]。酵母的生存能力是影響冷凍面團質量的關鍵因素，酵母存活率與發(fā)酵力的下降使面團發(fā)酵時間延長，面團內部不能形成良好的海綿狀結構，導致面團一系列品質問題，如外觀出現裂痕、色澤暗淡、口感不佳和異味等[7-9]。

代謝組學與轉錄組學是系統(tǒng)生物學研究中的重要技術手段，通過檢測環(huán)境變化中生物體代謝產物的變化及相關基因的差異表達，揭示生命活動的調控途徑[10]。近年來，越來越多的研究者通過多組學結合的方法探究酵母胞內外代謝體系及細胞自身的調控機制，使其更好地發(fā)揮模式生物的價值，并促進其在工業(yè)生產上的應用。多組學方法被廣泛應用于酵母耐性機理的研究，如Santos等[11]通過基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學分析了釀酒酵母耐藥性；Geng Peng等[12]通過基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學分析了釀酒酵母在乙酸脅迫下的應答機制；Strucko等[13]通過轉錄組學、蛋白組學和代謝組學分析了釀酒酵母在不同脅迫條件下磷酸甘油代謝的調節(jié)方式；Xia Zhengchao等[14]通過轉錄組學、蛋白組學和代謝組學分析了釀酒酵母低氧脅迫下的應激調節(jié)機制。而以組學的分析方法研究酵母冷凍應答機制的報道較少，如羅煜等[15]通過代謝組學分析了異常威克漢姆酵母冷凍脅迫下糖代謝變化及冷凍脅迫相關的特征代謝物。目前，以多組學分析方法探究酵母冷凍應答機制的相關研究鮮見報道，本研究通過代謝組學與轉錄組學分析，從代謝物水平和mRNA水平揭示面包酵母冷凍脅迫應答機制，旨在為酵母耐性調節(jié)機制的研究提供思路，為冷凍面團優(yōu)化及技術發(fā)展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

工業(yè)面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）ABY3由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉20 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min。

葡萄糖模擬面團培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，硫酸銨2.5 g/L，尿素5 g/L，磷酸二氫鉀16 g/L，磷酸氫二鈉5 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，煙酸22.5 mg/L，泛酸5.0 mg/L，VB12.5 mg/L，VB61.25 mg/L，VB21.0 mg/L，葉酸0.5 mg/L，蒸餾水配制，100 ℃滅菌30 min備用。

1.2 儀器與設備

Exion UPLC-QTOF 5600 PLUS液相色譜-質譜聯用儀（配有電噴霧離子源） 美國AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；純水機 臺灣艾科有限公司；高速冷凍離心機 日本日立科奇有限公司；自動壓力蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱上海旻泉有限公司；電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱 鶴壁市科奧儀器儀表制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍脅迫下存活率測定

挑取1 環(huán)酵母細胞于YEPD培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h；以10%（V/V）的接種量轉YEPD培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期（OD600nm為1.5左右）；4 000 r/min離心5 min，無菌水洗滌2 次后收集菌體備用。將上述離心收集得到的酵母（含水量73%左右）按2.0 g/100 mL的接種量接到葡萄糖模擬面團培養(yǎng)基中，30 ℃預發(fā)酵30 min，取樣稀釋適當倍數點板并涂板計數為u1，剩余樣品-20 ℃冷凍7 d后，30 ℃發(fā)酵30 min，取樣稀釋適當倍數點板并涂板計數為u2。冷凍細胞存活率/%=（u2/u1）×100。實驗設置3 個重復。

1.3.2 冷凍脅迫下發(fā)酵力測定

稱取上述離心收集得到的酵母4.5 g，與2.0 g NaCl、72.5 mL水、140 g標準面粉混合，30 ℃預發(fā)酵30 min后，稱取50 g面團放入250 mL量筒中發(fā)酵，記錄未經冷凍面團2 h CO2產氣量；同時稱取50 g面團于-20 ℃冷凍，7 d后，于30 ℃解凍30 min后放入250 mL量筒中繼續(xù)發(fā)酵，記錄2 h CO2產氣量。計算單位干質量菌體在60 min的產氣量作為發(fā)酵力。實驗設置3 個重復。

1.3.3 非靶向代謝組學分析

將葡萄糖模擬面團培養(yǎng)液中，冷凍前和冷凍后發(fā)酵30 min的細胞培養(yǎng)液（菌量約4 mg）轉移到1.5 mL的離心管中，4～8 ℃離心5 min，在Milli-Q水（4 ℃）中洗滌2 次。用低溫甲醇提取法提取細胞內代謝物，冷凍干燥成顆粒，無需加熱。在液相色譜-串聯質譜分析前，加入100 μL的色譜級水，使每個標準樣品和每個生物樣品重新懸浮。使用自動取樣器將大約2 μL的樣品注入液相色譜-串聯質譜系統(tǒng)[16]。色譜柱選用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），使用Exion UPLC-QTOF 5600 PLUS液相色譜-質譜聯用儀，以電噴霧電離模式進行所有分析，條件如下：氣簾氣壓力：35 psi；正離子噴霧電壓：5 500 V；負離子噴霧電壓：-4 500 V；溫度：450 ℃；離子源氣體1壓力：50 psi；離子源氣體2壓力：50 psi。實驗設置4 個重復。

1.3.4 轉錄組學分析

將葡萄糖模擬面團培養(yǎng)液中，冷凍前和冷凍后發(fā)酵30 min的細胞培養(yǎng)液（菌量約4 mg）轉移到1.5 mL的離心管中，4～8 ℃離心5 min，在Milli-Q水（4 ℃）中洗滌2 次。通過Trizol提取試劑盒進行RNA提取，利用Nanodrop檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。檢測合格的RNA用于后續(xù)測序。將提取后的RNA送入基迪奧生物公司進行轉錄組測序分析。實驗設置3 個重復。

1.4 數據分析

實驗中各組數據均以平均值±標準誤差表示，結合Studentt檢驗和最小顯著性差異法方法證實菌株間差異，P＜0.05，差異顯著。代謝組學中，以P＜0.05且差異倍數（fold change，FC）＞1作為差異代謝物的鑒別標準，對P＜0.05差異代謝物進行KEGG通路的富集分析。使用R語言軟件包進行主成分分析。轉錄組學中，以錯誤發(fā)現率（false discovery rate，FDR）＜0.05且FC＞1作為差異基因，并對差異基因進行KEGG通路的富集分析。

2 結果與分析

2.1 面包酵母ABY3冷凍脅迫存活率及不加糖面團發(fā)酵性能

圖1 面包酵母ABY3冷凍前后生長性能差異Fig.1 Comparison of the growth performance of ABY3 before and after freezing

為了研究低溫對面包酵母細胞的影響，從存活率及發(fā)酵性能2 個指標進行判定。將冷凍前預發(fā)酵30 min的培養(yǎng)液與冷凍處理7 d后發(fā)酵30 min的培養(yǎng)液，分別稀釋4 個梯度濃度進行點板，如圖1所示，組內3 組平行樣品菌落數基本一致，而冷凍前與冷凍后的樣品組間表現出菌落數差異，冷凍后的酵母存活數量明顯少于冷凍前。為計算ABY3冷凍脅迫存活率及驗證圖1現象，將相同條件處理的發(fā)酵液適當稀釋后涂板計數，統(tǒng)計得出冷凍后的存活率為（43±2.0）%，該存活率與圖1表現出的組間菌落差異數量基本一致，表明超過半數的酵母細胞在低溫脅迫下死亡。

圖2 面包酵母ABY3冷凍前后在不加糖面團中的發(fā)酵性能Fig.2 Fermentation properties of frozen and non-frozen baker’s yeast ABY3 in dough without added sugar

通過不加糖面團發(fā)酵實驗，記錄面團冷凍7 d前后的產氣量變化，可以體現面包酵母ABY3冷凍前后的發(fā)酵性能。如圖2a所示，在90 min菌株ABY3冷凍前的面團發(fā)酵基本達到終點并趨于穩(wěn)定，50 g面團累計產氣量約為67 mL，而菌株ABY3冷凍后的面團在相同時間的產氣量只有26 mL，且在120 min仍處于緩慢發(fā)酵的狀態(tài)。在實際應用中，酵母的發(fā)酵效率是影響面團發(fā)酵產品品質和生產效率的關鍵因素，過長的發(fā)酵時間是導致面團外觀差、口感欠佳的重要原因之一。發(fā)酵力可以有效反映面包酵母發(fā)酵效率。如圖2b所示，冷凍后ABY3的發(fā)酵力較冷凍前下降42%（P＜0.05）。

綜上結果表明，冷凍脅迫不僅影響面包酵母生長性能，對面包酵母細胞具有致死性，還會影響面包酵母代謝性能，從而降低面團發(fā)酵效率。冷凍脅迫下面包酵母應答機制牽涉到復雜多變的生理調節(jié)，采用代謝組學與轉錄組學分析，從代謝物水平和mRNA水平揭示面包酵母冷凍脅迫應答機制。

2.2 面包酵母ABY3冷凍脅迫下的代謝組學分析

為探究低溫脅迫對面包酵母胞內代謝物質的影響，對冷凍前后模擬面團培養(yǎng)液預發(fā)酵的面包酵母ABY3進行胞內代謝組學分析。代謝組學定性的代謝物共77 種，圖3a主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示，處理組間有較明顯差異及組間重復性，具有分析價值。將冷凍前后的顯著差異代謝物（P＜0.05且FC＞1）相對含量以z-score標準化方式進行數據處理并制作熱圖，如圖3b所示，顯著差異代謝物共24 種，其中上調7 種，下調17 種。

酵母在低溫發(fā)酵中表現出對有機氮源氨基酸的偏好，冷凍處理后，酵母胞內氨基酸的含量普遍下調，該結果與Tai等[17]研究結果一致。Takagi等[18]發(fā)現釀酒酵母中脯氨酸以及帶電荷氨基酸如谷氨酸、精氨酸、賴氨酸等會有明顯的低溫保護劑作用。另外，酵母胞內氨基酸的積累對其他環(huán)境脅迫同樣起到細胞保護劑作用[19-22]，可見氨基酸是維持細胞生長代謝平衡的重要物質。而冷凍脅迫下，面包酵母胞內氨基酸的匱乏可能是導致酵母存活率下調的原因之一。

上調的物質中涉及到3 種脂肪酸：棕櫚酸、油酸和十三烷酸。脂肪酸是微生物細胞膜中含量豐富且穩(wěn)定的化學組分，因此該類物質在脅迫條件下變化被人們所關注[23]。細胞膜作為細胞的保護屏障，在環(huán)境適應中通過脂質變化，維持細胞形態(tài)、實現信號傳導及調節(jié)滲透壓[24]。溫度降低會嚴重降低細胞膜的流動性和通透性，影響跨膜蛋白活性[25]。酵母細胞可通過多種調節(jié)方式保持細胞膜適當的流動性，其中較為主要、研究較多的調節(jié)方式涉及增加脂肪酸的不飽和度和減少平均鏈長[26]。實驗結果表明，脂代謝響應于冷凍脅迫，冷凍脅迫下面包酵母中不飽和脂肪酸油酸含量有所升高，從而有利于保持細胞膜流動性，而長鏈脂肪酸棕櫚酸和中鏈脂肪酸十三烷酸含量的增加可能是脂代謝響應于酵母細胞冷凍脅迫的另一調節(jié)方式。

圖3 面包酵母響應于冷凍脅迫下的代謝組學分析Fig.3 Metabolomic analysis of baker’s yeast in response to freezing stress

在上調的冷凍差異代謝物中，海藻糖一直被認為是影響酵母冷凍耐受性的一個重要因素，在保護酵母蛋白質和質膜穩(wěn)定性方面起到重要作用[27-29]。在脅迫條件下，胞內海藻糖通過“水替代”“玻璃態(tài)”或“優(yōu)先排阻”多種機制保護細胞免受惡劣環(huán)境對細胞的損傷[30]。在保護酵母細胞的同時海藻糖還作為重要的能源物質儲存于胞內，以維持細胞的存活和發(fā)酵[31]。實驗結果表明，海藻糖代謝途徑響應于冷凍脅迫，使面包酵母在發(fā)酵過程中積累海藻糖以應對環(huán)境脅迫，該結果與Aguilera等[32]研究結果相符。

此外，進一步對差異代謝物（P＜0.05）進行KEGG通路分析，如圖3c所示，在影響力排名前20的差異代謝通路中，主要的差異代謝通路都與氨基酸代謝相關。綜上推測，冷凍脅迫致使面包酵母細胞積累海藻糖和不飽和脂肪酸，對細胞起到了一定程度的保護作用，但冷凍條件下冰晶對細胞膜的損傷不可忽視，其中長鏈脂肪酸的增多及冷凍對跨膜蛋白活性的影響極有可能一定程度影響了營養(yǎng)物質的跨膜運輸，導致胞內營養(yǎng)物質氨基酸匱乏，致使氨酰-tRNA生物合成底物不足，氮代謝減緩，從而影響細胞生長代謝。

2.3 面包酵母ABY3冷凍脅迫下的轉錄組學分析

圖4 面包酵母響應于冷凍脅迫下的轉錄組學分析Fig.4 Transcriptomic analysis of baker’s yeast in response to freezing stress

為進一步探究冷凍脅迫下，面包酵母ABY3胞內代謝調控途徑，對冷凍前后模擬面團培養(yǎng)液預發(fā)酵的面包酵母ABY3進行胞內的轉錄組學分析。如圖4a所示，冷凍前后的面包酵母相比，顯著差異基因（FDR＜0.05且FC＞1）共494 個，其中上調246 個，下調248 個。對顯著差異基因進行代謝通路分析（圖4b），并對差異通路所涉及到的差異基因進行匯總（表1），發(fā)現在排名前20的差異代謝通路中，氮代謝、氨基酸代謝、氨酰-tRNA生物合成、脂肪酸代謝和海藻糖代謝相關調控基因的表達表現出顯著差異，該結果與代謝組所涉及的差異代謝通路基本相符。

表1 面包酵母響應冷凍脅迫的顯著差異基因Table 1 Significantly differentially expressed genes in baker’s yeast in response to freezing stress

冷凍后，面包酵母細胞中與氮代謝和氨基酸代謝相關的基因普遍上調，該結果與Schade等[33]報道一致。在氮代謝中，細胞對氮的吸收通過氮分解代謝阻遏機制調節(jié)[34]，與解除氮代謝阻遏相關的谷氨酸脫氫酶編碼基因GDH1[35]在冷凍脅迫后顯著上調（圖5a），該阻遏機制的解除促進氮代謝。在氮源利用上，低溫環(huán)境下酵母細胞更偏好于利用氨基酸而不是銨，而氨基酸的利用致使氨基酸代謝活躍[36]。因此推測冷凍脅迫可能使酵母細胞實現氮分解代謝的去阻遏，加強了有機氮源氨基酸的應用。冷凍后，氨酰-tRNA生物合成途徑中，可用于tRNA連接的L-氨基酸普遍下調，而不同氨基酸與tRNA連接酶的相關調控基因呈現上調。已有文獻表明，氨酰-tRNA合成途徑中相關酶活性響應于胞內氨基酸的匱乏，且與細胞的生長速率相關[37]。因氨酰-tRNA合成途徑在蛋白質合成中起到至關重要的作用，所以該途徑與細胞生長代謝調節(jié)密切相關。目前，還未有研究表明氨酰-tRNA合成途徑響應于環(huán)境脅迫，其中的應激調節(jié)機制未知。綜上，冷凍脅迫下氨酰-tRNA生物合途徑中相關調控基因響應于胞內氨基酸的匱乏普遍上調，推測氨酰-tRNA的合成途徑是被冷凍的脅迫環(huán)境激活，具體的作用機理有待研究。

圖5 面包酵母冷凍前后差異基因表達量Fig.5 Differential gene expression in baker’s yeast before and after freezing

低溫條件下，脂質成分變化是酵母細胞響應低溫環(huán)境的重要調節(jié)方式。轉錄組數據中，與脂肪酸代謝相關的脂肪酸延長酶編碼基因ELO2和ELO3[38]，在冷凍脅迫后呈現上調（圖5b）。脂肪酸延長酶參與脂肪酸代謝，與膜脂的代謝密切相關[39]。酵母中含有3 種脂肪酸延長酶：Elo1延長C14-FA到C16-FA；Elo2延長C16-FA和C18-FA到C24-FA；Elo3延長C18-FA到C26-FA[40]。ELO2和ELO3作為合成極長鏈脂肪酸其中的關鍵基因，對脂肪酸在細胞中的代謝平衡有重要作用[41]。有相關研究表明，過表達脂肪酸延長酶的編碼基因，可以使不飽和脂肪酸與中、長鏈脂肪酸相對含量增加[42]?；谝陨戏治鐾茰y，冷凍脅迫誘導酵母ELO2和ELO3基因表達，使酵母胞內油酸、棕櫚酸和十三烷酸相對含量增加，從而間接調節(jié)脂代謝在環(huán)境適應中的平衡。

對海藻糖代謝相關基因進行分析，發(fā)現冷凍后，海藻糖合成酶編碼基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1呈現不同幅度上調，其中TPS1基因的表達量較冷凍前上調1 倍，而海藻糖分解相關中性海藻糖酶編碼基因NTH1和NTH2以及酸性海藻糖酶編碼基因ATH1并未表現出顯著差異（圖5c）。以上結果表明，冷凍脅迫增強海藻糖合成酶編碼基因表達，促進胞內海藻糖積累，從而有利于保護細胞維持機體正常生長代謝。

通過轉錄組學分析得出，受冷凍脅迫影響，酵母氮分解代謝阻遏被解除，作為酵母的低溫偏好有機氮源氨基酸被大量消耗并活躍氨基酸代謝。而氮分解代謝阻遏被解除的情況下，細胞生長仍被明顯遏制的主要原因極有可能是胞內氨基酸的匱乏。胞內氨基酸作為蛋白質和酶的合成原料，是細胞生長代謝的重要物質。代謝組學數據顯示，冷凍脅迫后，胞內氨基酸的匱乏并沒有因活躍的氨基酸代謝得到及時補充；轉錄組學數據顯示，31 個與氨基酸轉運相關的調節(jié)基因在冷凍脅迫后雖未表現出顯著差異，但其中25 個基因凍后呈現不同程度的下調（表2）。推測冷凍脅迫后胞內氨基酸匱乏的原因為：胞內外的氨基酸在氮代謝與氨基酸代謝中被大量消耗，而氨基酸合成所需的碳源，在低溫條件下部分流入糖酵解途徑，部分作為貯藏性碳源被積累[43]，致使合成氨基酸的碳架不足；另一方面，可能受質膜損傷和氨基酸轉運相關基因下調的影響，一定程度限制了氨基酸的跨膜運輸與轉運效率。綜上，面包酵母在冷凍脅迫后加強有機氮源氨基酸的利用，極有可能加劇胞內氨基酸匱乏，致使細胞生長被遏制。

此外，冷凍脅迫下中長鏈脂肪酸增多，致使質膜僵硬化，對細胞活性有嚴重影響。而膜蛋白同樣是影響細胞活性的重要物質，其參與細胞多種生理調節(jié)過程，涉及物質運輸，細胞的存活、增殖、分化，形態(tài)的發(fā)生與器官的形成以及各種信號的傳遞[44]。轉錄組學數據表明，與細胞膜蛋白表達相關的19 個基因較冷凍前表現出顯著差異，其中9 個基因上調，10 個基因下調（表3）。值得關注的是，滲透壓傳感器SHO1的編碼基因SHO1在冷凍后顯著下調，該基因既是膜蛋白的相關調節(jié)基因，還對細胞的滲透壓調節(jié)起到關鍵作用[45]。由此可見，冷凍脅迫下，膜蛋白相關基因的調節(jié)同樣是影響細胞活性的原因。

表2 面包酵母冷凍脅迫后與氨基酸轉運相關基因的表達情況Table 2 Expression of genes related to amino acid transport in baker’s yeast after freezing stress

表3 面包酵母冷凍脅迫后與細胞膜上蛋白相關的顯著差異基因表達情況Table 3 Significant differential gene expression related to cell membrane proteins in baker’s yeast after freezing stress

3 結 論

面包酵母ABY3在-20 ℃冷凍7 d的條件下，細胞存活率為43%，面團發(fā)酵力下降42%，表明冷凍脅迫極大損傷面包酵母生長和發(fā)酵性能。代謝組和轉錄組學分析結果表明，冷凍脅迫下，胞內氨基酸的匱乏與質膜僵硬化可能是影響細胞生長和發(fā)酵性能的主要原因，海藻糖積累作為細胞脅迫下的應激保護行為，并不能從根源解決冷凍脅迫對細胞的損傷，對細胞的保護有限。氨基酸的匱乏不僅使細胞應對脅迫環(huán)境的能力下降，還使蛋白質合成缺少原料，即便與蛋白質合成相關的氨酰-tRNA生物合成途徑被激活，也不足以完全解除蛋白質的合成阻礙，從而致使脅迫后酶的合成不足，影響酵母細胞生長代謝。另外，低溫培養(yǎng)通過質膜僵硬化增加膜脂分子的需求[32]，雖然冷凍脅迫誘導脂肪酸延長酶編碼基因ELO2、ELO3表達，積累不飽和脂肪酸，維護脂質代謝平衡，但不飽和脂肪酸相對含量增多的同時長鏈脂肪酸相對含量同樣增多，并不能完全緩解質膜僵硬化，從而影響細胞生長。本實驗研究初步推測了面包酵母對冷凍脅迫的應答機制，在后續(xù)研究中，為證實結論，將對相關通路的調控基因進行表達驗證，完善酵母細胞自身調節(jié)機制。