草魚胰蛋白酶的親和純化及酶學性質

李 晨，高柳芳，崔曉東，韓宇航，朱丹旭，李 嬌,*

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，是目前應用最廣泛的蛋白酶之一，其應用范圍遍布于食品（面包烘烤業(yè)、果品加工業(yè)、面粉深加工等）、紡織、飼料、發(fā)酵、洗滌劑、皮革、醫(yī)藥以及能源開發(fā)、環(huán)境保護等行業(yè)[1]。然而傳統(tǒng)的分離蛋白酶方法主要依據(jù)目的分子的大小、溶解度及帶電荷情況等，特異性很差，不僅純化過程費時費力，而且酶的比活力和總活力回收不理想[2]，難以滿足市場需求。親和層析具有特異性強、高效、操作簡單等多種優(yōu)勢，是目前純化生物酶的首選方法。

目前雖然有牛和豬來源的胰蛋白酶已經商業(yè)化，然而，胰蛋白酶在自然界很多物種中普遍存在，其性質不盡相同，可用于不同領域。近些年來魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，漁業(yè)生產方式已經由傳統(tǒng)的捕撈轉變成以養(yǎng)殖為主，我國水產品總產量多年以來一直居于世界首位[3]，魚類加工規(guī)模不斷擴大。然而魚的內臟目前還沒有得到充分利用，很多時候被當作廢棄物扔掉，這樣既不利于環(huán)境保護，又使得漁業(yè)資源大量浪費[4]。魚內臟是魚加工的主要副產品之一，其中含有豐富的油脂、蛋白質、復合酶等物質，且具有很高的生理活性和營養(yǎng)價值[5]。目前，魚內臟的利用途徑主要包括魚油的精制（提取DHA和EPA），如魚子用于制成保健品或美容護膚品，魚肝用于治療惡性貧血，魚腸內的大量消化酶制成酶制劑等[6]。除此之外，近年來對魚內臟中的多種酶類（如脂肪酶）、多糖（如糖醛酸多糖）等也進行了研究[7-8]。胰蛋白酶來源于魚類的肝胰臟、腸道和幽門盲囊，是魚內臟主要的內源性蛋白水解酶，對其研究在國內外已有報道，如深海金槍魚、彈丸魚以及淡水鱸魚、羅非魚等[9]。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國淡水養(yǎng)殖產量最高的魚類[10]，2018年產量高達550.4萬 t。本實驗用親和層析法從草魚肝胰腺粗酶液中一步純化得到胰蛋白酶，進一步研究其理化性質及穩(wěn)定性等，旨在為魚類的綜合開發(fā)、提高魚產品附加值等提供一定的理論依據(jù)，在提高資源利用率和環(huán)境保護等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚購于山西太原市田和活鮮水產市場。

牛胰蛋白酶、CNBr活化瓊脂糖凝膠（CNBr-Sepharose CL-4B）、蛋白質分子質量標準品 生工生物工程（上海）股份有限公司；考馬斯亮藍R-250 北京索萊寶科技有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-對硝基苯氨（benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide，BApNA） 美國Sigma公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4型恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司；Biologic-LP型蛋白質純化系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；TU-1810型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HC-2518R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；FA-25型高速組織勻漿機 上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；BSA224S型精密電子天平、PB-10型精密pH計 德國Sartorius公司；THZ-C-1型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；DYCZ-24DN型電泳儀北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚胰蛋白酶粗酶液的制備

選用新鮮的草魚肝胰腺、魚腸，將魚腸縱向劃開，用4 ℃水沖洗干凈后再用濾紙吸干表面的水分，向肝胰腺中加入一部分腸后稱質量。每克肝胰腺濕組織加3 mL pH 7.5、20 mmol/L預冷Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L CaCl2），用高速組織勻漿機將肝胰腺研磨成勻漿，于4 ℃靜置激活5 h后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，用紗布和濾紙過濾去除脂肪。向上清液中加入硫酸銨粉末，使其飽和度達到80%，在4 ℃鹽析6 h后冰浴靜置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集沉淀。用pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L CaCl2）溶解沉淀，離心取上清液，將上清液置于透析袋中，pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液磁力攪拌下于4 ℃透析脫鹽，每1 h換一次透析液，共換3 次，得到草魚胰蛋白酶粗酶液[11]。

1.3.2 BTI-Sepharose親和材料的制備

本實驗所用的BTI-Sepharose親和層析柱是以課題組純化的重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（buckwheat trypsin inhibitor，BTI）為配基，CNBr-Sepharose CL-4B為載體自制的親和材料。

用pH 9.0、250 mmol/L碳酸鈉緩沖液溶解BTI，并調整BTI質量濃度為5 mg/mL。用去離子水清洗CNBr活化瓊脂糖凝膠表面的溶劑后，繼續(xù)用碳酸鈉緩沖液浸泡并洗滌。將凝膠與BTI溶液混合，搖床振蕩，25 ℃偶聯(lián)6 h。然后加入pH 8.3、250 mmol/L Tris-HCl緩沖液，繼續(xù)反應6 h封閉剩余的活性基團。將偶聯(lián)了BTI的凝膠填料裝于柱中，分別用1 mol/L NaCl溶液和蒸餾水清洗10 個柱床體積，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 草魚胰蛋白酶的親和層析純化

取3 mL粗酶液上樣于用緩沖液（pH 7.5，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl）平衡好的BTI-瓊脂糖親和層析柱，流速控制為1 mL/min，充分洗去未結合蛋白后，分別用pH 5、4、3.5的100 mmol/L HAc-NaAc緩沖液依次進行洗脫。檢測280 nm波長處吸光度，收集蛋白峰，測定胰蛋白酶活力并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定。

1.3.4 草魚胰蛋白酶活力測定

按照文獻[12-13]的方法進行，并稍加改動。以BApNA為底物，在3.2 mL測活體系（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含10 mmol/L CaCl2）中加入0.5 mL待測樣品，37 ℃預熱5 min后，加入17 μL 150 mmol/L底物BapNA溶液（溶劑為二甲基亞砜），繼續(xù)保溫10 min后，加入0.5 mL 33%醋酸溶液終止反應，在410 nm波長處測定反應體系中由產物對硝基苯胺（p-nitroaniline，pNA）所產生的吸光度?？瞻左w系加樣順序為先加入反應終止液33%醋酸，再加入相同體積的樣品溶液。

1.3.5 蛋白含量的測定

采用福林-酚法測定蛋白含量，以牛血清白蛋白為標準品，按照福林-酚蛋白濃度測定試劑盒說明書進行[14]。

1.3.6 草魚胰蛋白酶分子質量的SDS-PAGE分析

用SDS-PAGE測定胰蛋白酶的分子質量及純度，以低分子質量蛋白質Marker（14.4～97.4 kDa）為對照，采用4%濃縮膠，12%分離膠，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V，采用考馬斯亮藍R-250染色液。用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）鑒定純化酶活力，以市售牛胰蛋白酶為對照，采用4%濃縮膠，7.5%分離膠，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。電泳后用底物酶譜法檢測胰蛋白酶活力，通過對底物BApNA的水解，得到黃色對硝基苯胺產物，凝膠上顯示出黃色條帶。將凝膠浸入顯色反應液（100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，7.5 mmol/L BApNA，pH 8.0）中，37 ℃微搖30 min，至凝膠中出現(xiàn)清晰的黃色條帶，立即掃描凝膠[12]。

1.3.7 草魚胰蛋白酶催化BApNA反應米氏常數(shù)（Km）的測定

測定37 ℃時不同BApNA濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）下酶催化反應的反應初速率V，并以1/V對1/[S]作圖，得到Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖[15]。圖中橫軸截距為1/Km的絕對值，縱軸截距為1/Vmax，進一步計算出動力學參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大速率Vmax。

1.3.8 草魚胰蛋白酶最適溫度及熱穩(wěn)定性分析

以BApNA為底物，按照1.3.3節(jié)方法分別測定30、40、50、60、70、80、90 ℃時的酶活力，分析草魚胰蛋白酶的最適溫度。將草魚胰蛋白酶液分別于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃保溫1 h后，冰浴冷卻。按照1.3.3節(jié)方法測定胰蛋白酶的剩余活力，分析酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.9 草魚胰蛋白酶最適pH值及酸堿穩(wěn)定性測定

以BApNA為底物，測定37 ℃不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11）條件下酶活力，分析酶的最適pH值。所用緩沖液為：Na2HPO4-NaH2PO4（100 mmol/L，pH 6.0～7.5），Tris-HCl（100 mmol/L，pH 8.0～9.0），Gly-NaOH（100 mmol/L，pH 9.5～10.0），NaHCO3-NaOH（100 mmol/L，pH 10.5～11.0）。

在室溫下將胰蛋白酶液分別用不同pH值（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0）的緩沖液處理1 h后，測定酶活力，分析酶的酸堿穩(wěn)定性。所用緩沖液為pH 2.0（20 mmol/L Gly-HCl）、4.0（20 mmol/L NaAc-HAc）、6.0（20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4）、8.0（20 mmol/L Tris-HCl）、10.0（20 mmol/L Gly-NaOH）、12.0（20 mmol/L NaHCO3-NaOH）。

1.3.10 金屬離子及EDTA對草魚胰蛋白酶活力的影響

向測活體系中加入不同量的K+、Ba2+、Mg2+、Fe2+、EDTA，使其離子終濃度為2～10 mmol/L，按照1.3.3節(jié)測定胰蛋白酶活力。以不加金屬離子的酶活力為100%，分別計算加入不同濃度金屬離子及EDTA后酶活力的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結果采用Excel進行作圖及數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 草魚胰蛋白酶的分離純化

圖1 草魚胰蛋白酶的BTI-Sepharose柱親和層析圖譜Fig.1 Elution profile of trypsin from C. idellus loaded on BTI-Sepharose column

如圖1所示，峰1為上樣穿透峰。上樣并充分洗去未結合蛋白后，分別用pH 5、4和pH 3.5的100 mmol/L HAc-NaAc緩沖液依次洗脫層析柱，發(fā)現(xiàn)只有用pH 3.5的緩沖液洗脫時出現(xiàn)明顯的A280nm蛋白峰（峰2）。胰蛋白酶活力鑒定結果表明穿透峰沒有胰蛋白酶活力，而pH 3.5的緩沖液洗脫得到的峰2有活性。

圖2a顯示，峰2樣品為單一條帶（泳道2），以標準蛋白質分子質量的負對數(shù)對相對遷移率作圖，根據(jù)相對遷移率計算得到草魚胰蛋白酶的分子質量為27 kDa。

Native-PAGE活性染色結果（圖2b泳道1）顯示有黃色產物pNA生成，表明圖1中峰2為胰蛋白酶，且達到了電泳純。Native-PAGE中草魚胰蛋白酶（圖2b泳道1）的相對遷移率小于牛胰蛋白酶（圖2b泳道2），分析與其分子質量大于牛胰蛋白酶（24 kDa）有關[16]。據(jù)報道，魚類來源的胰蛋白酶分子質量一般在20.0～30.0 kDa范圍內[11]，如日本鰻鱺、金槍魚、鳀魚、白姑魚胰蛋白酶的分子質量分別為21.5、24、25.6、28 kDa[17-21]。

圖2 草魚胰蛋白酶的SDS-PAGE（a）和Native-PAGE（b）圖譜Fig.2 SDS-PAGE (a) and Native-PAGE (b) analysis of C. idellus trypsin

表1 草魚胰蛋白酶純化參數(shù)Table 1 Purification of trypsin from C. idellus

如表1所示，粗酶液經硫酸銨沉淀透析后，僅通過親和層析一步純化就得到胰蛋白酶純酶，得率為29.03%，純化倍數(shù)達到131.21 倍。由此可見，用BTI-Sepharose親和柱僅需一步層析便可從粗酶液中純化得到高純度的胰蛋白酶，操作簡單、效率高。

2.2 胰蛋白酶催化BApNA反應米氏常數(shù)（Km）分析

圖3 草魚胰蛋白酶的米氏常數(shù)雙倒數(shù)圖（以BApNA為底物）Fig.3 Kinetic properties of trypsin from C. idellus using BApNA as the substrate

如圖3所示，以BApNA為底物，通過雙倒數(shù)圖可計算草魚胰蛋白酶的Km為3.4×10-5mol/L，Vmax值為40.57 s-1，高于日本鰻鱺胰蛋白酶（3.1×10-6mol/L）和鱸魚胰蛋白酶（1.12×10-6mol/L）的Km值[22]，低于鯽魚胰蛋白酶（3.6×10-2mol/L）和青魚胰蛋白酶（2.7×10-2mol/L）的Km值[23]，說明草魚胰蛋白酶對BApNA的親和力顯著低于日本鰻鱺胰蛋白酶和鱸魚胰蛋白酶，而明顯高于鯽魚胰蛋白酶和青魚胰蛋白酶。

2.3 草魚胰蛋白酶最適反應溫度與熱穩(wěn)定性

圖4 草魚胰蛋白酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.4 Optimum reaction temperature and thermal stability of trypsin from C. idellus

由圖4可知，草魚胰蛋白酶的最適溫度為60 ℃。草魚胰蛋白酶的最適溫度與已報道的金槍魚[18]和笛鯛[24]（Lutjanidae）等胰蛋白酶相似；高于鯉魚（Cyprinus carpio，40 ℃）、鱸魚（Lateolabrax japonicus，40 ℃）和鳳尾魚（Coilia mystus，45 ℃）等已報道的大部分魚類胰蛋白酶[25]；低于大西洋狐鰹魚（Atlantic bonito）胰蛋白酶，該酶的最適溫度為65 ℃[26]。

在30～60 ℃水浴中加熱60 min后，草魚胰蛋白酶的剩余酶活均能保持在88%以上。當溫度高于60 ℃時，其相對酶活力急劇下降到9%以下。草魚胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性與報道的鱸魚、金槍魚等胰蛋白酶類似。哺乳動物體內胰蛋白酶則具有較好的熱穩(wěn)定性，如牛胰蛋白酶在80 ℃高溫條件下仍能保持較高的活性。魚類胰蛋白酶與哺乳動物胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的差異可能是由于不同物種生活環(huán)境和胰蛋白酶肽鏈結構的不同造成的。

2.4 草魚胰蛋白酶的最適pH值和酸堿穩(wěn)定性

圖5 草魚胰蛋白酶的最適pH值Fig.5 Optimum reaction pH of trypsin from C. idellus

如圖5所示，pH 9.5時草魚胰蛋白酶表現(xiàn)出最大酶活力。當pH值為11.5時，草魚胰蛋白酶仍然能夠保持50%的酶活力。魚類胰蛋白酶屬于堿性蛋白系，在酸性條件由于活性位點電荷改變，酶不能有效與底物結合[27]。草魚胰蛋白酶的最適pH值與白姑魚（Argyrosomus argentatus）以及金槍魚（Thunnus tonggol）等體內的胰蛋白酶一致，高于鰱魚的最適pH 8.3，略高于鯉魚（Cyprinus carpio，pH 9.0）和鳀魚（Anchovy，pH 9.0）胰蛋白酶。

圖6 草魚胰蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of trypsin from C. idellus

如圖6所示，當草魚胰蛋白酶在pH 6～12的條件下常溫孵育60 min后，其相對酶活力仍能很好地保持在80%以上，當pH值小于4時，其酶活力急劇下降，表明草魚胰蛋白酶的pH值穩(wěn)定范圍為6～12。該酶的pH值穩(wěn)定性與鯽魚、狹鱈魚、金槍魚等的胰蛋白酶相似。與魚類來源的胰蛋白酶不同，哺乳動物如牛來源的胰蛋白酶在pH 2～3的酸性環(huán)境下仍能保持較好的穩(wěn)定性。

2.5 金屬離子、EDTA對草魚胰蛋白酶活力的影響

圖7 金屬離子與EDTA對草魚胰蛋白酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ion and EDTA on trypsin activity from C. idellus

如圖7所示，隨著Mg2+濃度的不斷增加，草魚胰蛋白酶活力呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，當Mg2+濃度達到10 mmol/L時，草魚胰蛋白酶活力較未加Mg2+的對照組提高到135.79%。由此可見，Mg2+在一定濃度范圍內可激活草魚胰蛋白酶活力。據(jù)報道，Mg2+對鱖魚、鳀魚、青魚和鯽魚胰蛋白酶活力均有一定激活作用。其原因是Mg2+與胰蛋白酶分子中的側鏈氨基酸殘基結合后可以穩(wěn)定胰蛋白酶的分子構象，從而調節(jié)胰蛋白酶活力[28]。

隨著Ba2+濃度的不斷增加，草魚胰蛋白酶活力呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，當Ba2+濃度達到10 mmol/L時，草魚胰蛋白酶活力提高到122.72%。據(jù)報道Ba2+對日本鰻鱺胰蛋白酶活力具有激活作用，而對中國明對蝦胰蛋白酶活力具有強烈的抑制作用[29]。

草魚胰蛋白酶活力隨Fe2+濃度的不斷增加而增強，當Fe2+濃度達到10 mmol/L時，草魚胰蛋白酶活力提高到158.04%。楊麗媛[30]報道低濃度的Fe2+會增加堿性蛋白酶活力；5 mmol/L Fe2+可使中國明對蝦胰蛋白酶活力提高到155.68%；Fe2+對菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶活力也有不同程度的激活作用[31]。

隨著K+濃度的不斷增加，草魚胰蛋白酶活力呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢，當K+濃度達到10 mmol/L時，草魚胰蛋白酶保持92%活力。研究表明K+對鯽魚，青魚胰蛋白酶也均有一定的抑制作用。

草魚胰蛋白酶活力隨EDTA濃度的增加而降低，當EDTA濃度達到10 mmol/L時，草魚胰蛋白酶活力降低到71%。Castillo-Yá?ez等[32]報道0.25 mg/mL EDTA可抑制14%的沙丁魚胰蛋白酶活力。EDTA對青魚、鯽魚、大眼鯛等胰蛋白酶活力都具有很強的抑制作用，而對鳀魚、白姑魚、鱸魚胰蛋白酶的抑制作用較輕。

3 結 論

本研究通過緩沖液浸提、硫酸銨沉淀和BTISepharose親和層析，從草魚肝胰腺中純化得到一種分子質量為27 kDa的胰蛋白酶。魚內臟常被作為廢棄物處理，沒有價值又污染環(huán)境。本實驗純化方法簡單，經過常規(guī)浸提和沉淀后，只需一步層析便從草魚肝胰腺提取液中純化得到了電泳純的草魚胰蛋白酶。目前報道酶的提取純化方法中，為了達到高的比活力，通常需要多步純化（如離子交換色譜和凝膠色譜聯(lián)合使用），每一次純化步驟都會不可避免造成酶活力的損失。親和層析基于親和材料中配體分子與酶的高度特異性結合作用，操作簡單，快速高效，僅需一步操作便可獲得高純度高活性的酶，在保證了高比活力的前提下，提高了酶總活力的回收。因此，本研究采用親和層析技術制備胰蛋白酶不僅能夠極大地降低生產成本，提高經濟效益，而且也能為工業(yè)提取純化其他蛋白提供參考。

草魚胰蛋白酶與底物BApNA有較強的親和力，最適反應溫度為60 ℃，最適pH值為9.5，并有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，材料來源豐富，成本低廉，具有潛在的應用價值。Ba2+、Mg2+、Fe2+在0～10 mmol/L濃度范圍內對該酶都具有一定程度的激活作用，而EDTA對酶有顯著抑制作用。以上結果可為草魚的貯藏、加工以及運輸條件的改進，內源性水解酶的應用等提供理論依據(jù)。