植物乳桿菌p-8轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的分析

趙 微，張 峰，張和平，趙國芬,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸（linoleic acid，LA）代謝產(chǎn)生的不同位置和幾何異構(gòu)體的統(tǒng)稱，也是細菌解除LA毒性的一種機制。其中cis9,trans11-CLA（c9,t11-CLA）、trans10,cis12-CLA（t10,c12-CLA）和trans9,trans11-CLA（t9,t11-CLA）是3 種主要發(fā)揮益生功能的異構(gòu)體[1]。目前，CLA以具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和降脂等生理功能，在食品和藥學(xué)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用[2-6]。CLA的天然來源是反芻動物食品[7]，但含量低，不能滿足人們的需求。CLA也可化學(xué)異構(gòu)法、微生物轉(zhuǎn)化和重組酶法生產(chǎn)?；瘜W(xué)異構(gòu)法生產(chǎn)的CLA產(chǎn)量高，但異構(gòu)體多樣，分離純化困難，副產(chǎn)物殘留，應(yīng)用不安全[8]。微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)CLA，存在發(fā)酵成本高、條件不易控制和CLA產(chǎn)量不足而難以商品化的問題。酶催化得到的CLA活性異構(gòu)體單一，條件易控制，產(chǎn)量高，并且重組酶更是產(chǎn)量高、純度高和效率高，不失為一個很好的途徑。而要想獲得重組酶，高產(chǎn)CLA的細菌是其很好的基因來源。

圖1 L. plantarum轉(zhuǎn)化CLA途徑Fig.1 Pathway for the conversion of LA to CLA in L. plantarum

許多細菌可以轉(zhuǎn)化LA為CLA，主要包含瘤胃細菌[9-10]、乳酸菌[11-12]和丙酸桿菌[13-14]三類。不同微生物轉(zhuǎn)化LA生成CLA的機制和異構(gòu)體不同。目前，有關(guān)LA生成CLA途徑主要有5 種：第一，如反芻動物瘤胃溶纖維丁酸菌由c12,t11-LA異構(gòu)酶催化LA異構(gòu)為c9,t11-CLA[15]，該酶活性不受輔助因子和氧氣的影響；第二，如痤瘡丙酸桿菌由c12,t11-LA異構(gòu)酶催化LA異構(gòu)化為t10,c12-CLA[16]；第三，由一個亞油酸異構(gòu)酶系催化LA轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA，異構(gòu)酶系包括脂肪酸水合酶（CLA-HY）、羥基脂肪酸脫氫酶（CLA-DH）、乙酰乙酸脫羧酶（CLA-DC）（圖1A），如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）AKU1009a[17]；第四，也是由CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC共同催化完成，但轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是c9,t11-CLA和t9,t11-CLA（圖1B），如L. plantarumZS2058[18]；第五，最近報道一些乳酸桿菌將LA經(jīng)CLA-HY催化為10-羥基-順12-十八碳烯酸（10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid，10-HOE），然后在多功能烯醇化酶的作用下將10-HOE轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA，如L. plantarumATCC8014[19-20]。

L. plantarump-8是實驗室前期從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離得到。臨床研究表明，該菌可提高奶牛產(chǎn)奶量、提高肉雞免疫能力、緩解成年人壓力和焦慮等[21]，其發(fā)酵豆乳和葵花籽油后用紫外法檢測到有CLA的生成[22]，但L. plantarump-8催化LA轉(zhuǎn)化為CLA的機制目前尚不清楚。本實驗研究L. plantarump-8菌體、菌體破碎液（天然粗酶）和重組亞油酸異構(gòu)酶系轉(zhuǎn)化CLA的能力與機制，旨在為利用重組酶催化生產(chǎn)CLA提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

本實驗所用L. plantarump-8菌株和重組質(zhì)粒pET-28a（+）-CLA-HY、pET-28a（+）-CLA-DH、pET-28a（+）-CLA-DC由本實驗室構(gòu)建和保藏，E. coliTransetta（DE3）和E. coliBL21（DE3）Chemically Competent Cells購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

LA（≥99%）、c9,t11-CLA（≥96%）、t10,c12-CLA（≥96%）、t9,t11-CLA（≥98%） 美國Sigma公司；一抗（Rabbit Anti-His tag antibody） 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二抗（Goat anti-Rabbit IRDye?800CW） 美國LI-COR公司；總RNA提取試劑盒北京天根生化有限公司；PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit 大連TaKaRa公司；Power SYBR Green PCR Master Mix 美國Invitrogen公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純；氣相色譜溶劑均為國產(chǎn)色譜純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS乳酸菌培養(yǎng)基和LB大腸桿菌培養(yǎng)基配制參考文獻[23]。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫搖床 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；低溫高速離心機 美國Sigma公司；JY92-2D超聲波細胞破碎機 寧波新芝科技股份有限公司；高溫高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；垂直板電泳槽 北京百晶公司；W-CJ-2FD單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；450氣相色譜儀 美國瓦里安公司；DSQ II氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司；qTOWER384G實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 德國耶拿公司；ODYSSEY 9120紅外激光掃描成像系統(tǒng) 美國LI-COR公司。

1.3 方法

1.3.1L. plantarump-8菌體催化LA轉(zhuǎn)化CLA

挑取L. plantarump-8單菌落在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2 代后，按1%接種量接種于含有0.5 mg/mL LA的MRS培養(yǎng)基中，對照組不添加LA，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d。6 000 r/min、4 ℃離心10 min收集上清液和菌體。上清液用于CLA分析。菌體重懸于KPB緩沖液（20 mmol/L，pH 6.5）中，清洗2 次，在冰浴中進行超聲破碎后（功率400 W；間歇4 s，破碎2 s，共30 min），進行兩種處理，一部分菌體破碎液用于CLA分析；為了比較菌體直接催化和天然粗酶催化的效果，一部分用作天然粗酶液體外再催化LA轉(zhuǎn)化CLA。每組3 個重復(fù)。

1.3.2L. plantarump-8天然酶催化LA轉(zhuǎn)化CLA

體外反應(yīng)總體系為1 mL，在KPB緩沖液（20 mmol/L，pH 6.5）中包含35 μmol/L LA、0.2%吐溫80、0.1 mmol/L黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin denine dinucleotide，F(xiàn)AD）、5 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)（nicotinamide adenine dinucleotide reduction，NADH）和5 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)（nicotinamide adenine dinucleotide oxidation，NAD+），實驗組為200 μL 1.3.1節(jié)的菌體破碎液，對照組為200 μL煮沸15 min滅活的菌體破碎液。將反應(yīng)體系放置于150 r/min的搖床中37 ℃反應(yīng)1、3、5 d和7 d。取上清液進行CLA分析。

1.3.3L. plantarump-8菌體催化LA轉(zhuǎn)化CLA關(guān)鍵酶的mRNA表達量分析

楊波[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生CLA相關(guān)酶基因的表達量在10 h最大，所以本實驗在L. plantarump-8在培養(yǎng)10 h菌體進行各酶轉(zhuǎn)錄水平分析[24]。挑取L. plantarump-8單菌落在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2 代后，按1%的接種量接種于含有LA（0.05 mg/mL）的MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 h。離心收集菌體，使用總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。取1 μg RNA按照PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進行反轉(zhuǎn)錄。將所得的cDNA參照Power SYBR Green PCR Master Mix的說明書準備real-time PCR體系，用real-time PCR儀進行分析，引物見表1。

real-time PCR數(shù)據(jù)分析：以16S rRNA為內(nèi)參基因，根據(jù)real-time PCR所得Ct值，按照2-ΔΔCt法分析每個基因相較于對照組的相對表達量[18]。

表1 用于real-time PCR的引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.4 重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒pET-28a（+）-CLA-HY和pET-28a（+）-CLA-DC分別轉(zhuǎn)化入E. coliBL21（DE3）中，重組質(zhì)粒pET-28a（+）-CLA-DH轉(zhuǎn)化入E. coliTransetta（DE3）中，用于表達重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC。分別挑取轉(zhuǎn)化后單菌落于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中37 ℃培養(yǎng)過夜。按2%接種量接種于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中37 ℃培養(yǎng)至菌體濃度在OD600nm為0.6～0.8之間。隨后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至終濃度為0.1 mmol/L，在轉(zhuǎn)速130 r/min搖床中16 ℃誘導(dǎo)14 h表達重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC，收集菌體并破碎，12 000 r/min離心1 h取上清液。上清液經(jīng)12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后，進行Western Blot鑒定。

1.3.5 重組亞油酸異構(gòu)酶系催化LA轉(zhuǎn)化CLA

分別含有等濕質(zhì)量的重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC的菌體破碎液（粗酶液）進行體外LA轉(zhuǎn)化CLA的能力測定。對重組酶活性的體外檢測采用兩種方法：一步法和分步法。每一種方法分3 組，即對照組、無輔助因子和輔助因子組，每組3 個重復(fù)。

一步法即將3 個酶混合后催化法。為了比較輔助因子對酶催化的影響，無輔助因子組的反應(yīng)總體系為1 mL，在KPB緩沖液（20 mmol/L，pH 6.5）中包含35 μmol亞油酸、0.2%吐溫80和重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC的粗酶液各200 μL。有輔助因子組的反應(yīng)體系在無輔助因子體系基礎(chǔ)中含0.1 μmol/mL FAD、5 μmol/mL NADH和5 μmol/mL NAD+。對照組除酶為煮沸15 min滅活的菌體破碎液外，其他成分與無輔助因子組相同。將反應(yīng)體系放置于150 r/min的搖床中37 ℃反應(yīng)1、3、5 d和7 d。取上清液進行CLA分析。

分步法即分5 步依次加入含重組CLA-HY、CLADH、CLA-DC、CLA-DH和CLA-HY的菌體破碎催化反應(yīng)。無輔助因子組和有輔助因子的每一步反應(yīng)體系為KPB緩沖液（20 mmol/L，pH 6.5）中包含表2中各成分（終含量）。對照組除酶為煮沸15 min滅活的菌體破碎液外，其他成分與無輔助因子組相同。每一步反應(yīng)條件：在150 r/min的搖床中37 ℃反應(yīng)2 d。每一步反應(yīng)結(jié)束后，取上清液進行CLA分析。

表2 分步法各反應(yīng)體系成分Table 2 Reaction system components for each step in the stepwise method

1.3.6 樣品中CLA甲酯化及氣相色譜檢測條件

取各待測樣品1 mL，分別加入1 mL異丙醇和5 mL正己烷，充分振蕩30 s萃取脂肪酸，4 500 r/min離心5 min，吸取上層正己烷相，用N2吹干。加入2 mL 4%鹽酸-甲醇溶液，50 ℃水浴20 min進行甲酯化，加入1 mL H2O，再加入5 mL正己烷萃取甲酯化后的脂肪酸，N2吹干后回溶于500 μL正己烷中。使用Varian 450氣相色譜儀對甲酯化后的脂肪酸和各CLA甲酯標準品進行分析。色譜柱：SP2560（100 m×0.25 mm， 0.2 μm）；檢測器：火焰離子化檢測儀；升溫條件：120 ℃保持5 min后以3 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min，再以1.5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持13 min；檢測器溫度：260 ℃；氣體流速：H230.0 mL/min，Air 300.0 mL/min，N21.0 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：1∶10。檢測后采用面積歸一化法分析CLA占總脂肪酸（total fatty acid，TFA）的百分比[25]。

1.3.7 來源于7 株乳酸菌的CLA-HY的結(jié)構(gòu)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得來源于動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）BB-12（GenBank：ADC85468.1）、L. plantarumZS2058（GenBank：ALF15778.1）、L. plantarumST-III（GenBank：ADN97339.1）、L. plantarumATCC8014（GenBank：CBY45494.1）、L. plantarumWCFS1（GenBank：NP_783979.1）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM（GenBank：AAV42528.1）和L. plantarump-8（GenBank：AGL62865.2）的CLA-HY氨基酸序列，使用DNAMAN軟件對各氨基酸序列進行比對分析。進一步使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，分析各個氨基酸的三維結(jié)構(gòu)及活性中心。使用Pymol軟件顯示蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum p-8及菌體破碎液催化LA轉(zhuǎn)化CLA

圖2 c9,t1 1-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA甲酯化標準品氣相色譜分析Fig.2 GC chromatograms of c9,t11-CLA, t10,c12-CLA and t9,t11-CLA standards

c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA甲酯化標準品的出峰時間分別在44.42、44.74 min和45.60 min處（圖2）。對L. plantarump-8菌體催化LA 3 d后的發(fā)酵上清液和菌體破碎液用氣相色譜進行脂肪酸組成分析。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不添加LA時，無論發(fā)酵上清液還是菌體均無CLA產(chǎn)生，而添加LA的發(fā)酵上清液中c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA占TFA比例分別為（1.079±0.103）%（轉(zhuǎn)化率2.0%）、（0.928±0.054）%（轉(zhuǎn)化率1.7%）和（0.475±0.063）%（轉(zhuǎn)化率0.9%）（圖3），轉(zhuǎn)化率并不高；菌體中只有c9,t11-CLA，占TFA比例為（0.096±0.034）%。說明L. plantarump-8菌體在有LA存在時可催化LA轉(zhuǎn)化CLA，并主要被轉(zhuǎn)運到胞外。據(jù)報道，亞油酸異構(gòu)酶是誘導(dǎo)酶[26]，無底物L(fēng)A時不表達；添加底物L(fēng)A后，酶被誘導(dǎo)表達，進而催化LA轉(zhuǎn)化CLA。

圖3 L. plantarum p-8菌體發(fā)酵上清液CLA氣相色譜分析Fig.3 GC chromatogram of CLA present in fermentation supernatant of L. plantarum p-8

為了比較菌體直接催化和酶催化的效果，一部分培養(yǎng)基中添加LA培養(yǎng)3 d的菌體破碎液用作天然粗酶液體外再催化LA轉(zhuǎn)化CLA，發(fā)現(xiàn)天然酶催化1、3、5 d和7 d后均有c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA產(chǎn)生，其不同時間段的3 種CLA占TFA比例見圖4。隨著反應(yīng)時間的延長，3 種CLA占TFA比例呈增加趨勢，反應(yīng)至7 d，c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA占TFA比例分別為（2.415±0.276）%、（2.675±0.176）%和（1.902±0.086）%。顯然，用粗酶液和菌體催化，都有CLA產(chǎn)生，但粗酶液催化能力高于菌體催化，是因為細胞催化時細胞膜阻礙了反應(yīng)順利進行，粗酶液經(jīng)細胞破碎后細胞膜屏障去除，使得酶與底物更加充分接觸所致；另外，天然酶催化時有輔助因子添加，增加了輔助因子總濃度使得酶活性增加[19]。此外，粗酶液催化出現(xiàn)t10,c12-CLA占TFA比例超過c9,t11-CLA的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可能與氧濃度有關(guān)，菌體催化和天然酶催化環(huán)境的氧濃度不同，菌體催化是酶在細胞內(nèi)催化，氧濃度低，與缺氧會影響菌體產(chǎn)各CLA異構(gòu)體占TFA比例的報道吻合[27]；也有可能是CLA-HY構(gòu)象有一定柔性，在細胞內(nèi)和暴露于細胞外活性中心的構(gòu)象發(fā)生一些變化，影響了酶與底物的親和力或?qū)Φ孜锏倪x擇性，使得CLA-HY更易與LA結(jié)合，利于10-HOE積累，也使得逆反應(yīng)CLA-HY與底物10-HOE的結(jié)合力提高，且超過了10-HOE與CLADH的結(jié)合力所致。

圖4 L. plantarum p-8的天然酶體外轉(zhuǎn)化不同時間的CLA含量Fig.4 Contents of CLA converted by natural enzyme of L. plantarum p-8 on different days in vitro

2.2 L. plantarum p-8催化LA轉(zhuǎn)化CLA關(guān)鍵酶的mRNA表達量分析

亞油酸異構(gòu)酶系的表達量直接影響LA轉(zhuǎn)化CLA的效率，其含量高低取決于其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平高低。為了探究L. plantarump-8 LA轉(zhuǎn)化為CLA的能力較低是否與CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)系，利用real-time PCR以16S rRNA基因為內(nèi)參分析了在0.05 mg/mL LA誘導(dǎo)下3 個基因mRNA的相對表達量。結(jié)果表明，3 個基因mRNA的相對表達量都較低，CLAHY基因的mRNA相對表達量是CLA-DH和CLA-DC的2.5 倍，且CLA-DH和CLA-DC的mRNA相對表達量接近（圖5）。

圖5 亞油酸異構(gòu)酶系各基因mRNA的相對表達量Fig.5 Relative mRNA expression of CLA genes

2.3 重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒p ET-28a（+）-CLA-HY和p ET-28a（+）-CLA-DC分別轉(zhuǎn)化入E. coliBL21（DE3）中，重組質(zhì)粒p ET-28a（+）-CLA-DH轉(zhuǎn)化入E. coliTransetta（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。結(jié)果表明，3 個重組菌的菌體破碎液分別在約68（CLA-HY）、38 k Da（CLA-DH）和35 kDa（CLA-DC）處各有1 條含量明顯很高的蛋白條帶（圖6），與根據(jù)氨基酸分子質(zhì)量計算的3 個蛋白分子質(zhì)量基本一致。所表達目的蛋白的N端和C端均保留了原核載體自身的6×His標簽，旨在用于與His-tag抗體進行特異性相互作用[18]。因此本研究利用His-tag抗體與目的蛋白進行Western Blot檢驗，在相應(yīng)大小位置處有雜交條帶，說明3 個重組酶均成功表達（圖7）。

圖6 SDS-PAGE檢測重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DCFig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant CLA-HY,CLA-DH and CLA-DC

圖 7Western Blot鑒定重組蛋白CLA-HY、CLA-DH和CLA-DCFig.7 Identification of recombinant CLA-HY, CLA-DH and CLA-DC by Western blot

2.4 重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC混合（一步法）催化LA轉(zhuǎn)化CLA

為考察重組亞油酸異構(gòu)酶系是否有活性，將分別含重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC的菌體破碎液混合加入反應(yīng)體系中，進行體外LA轉(zhuǎn)化CLA反應(yīng)1、3、5 d和7 d，對照組由于酶滅活，各時間點產(chǎn)物均無CLA產(chǎn)生；無輔助因子各時間點產(chǎn)物均無CLA產(chǎn)生，說明工程菌表達的重組酶缺乏輔助因子或輔助因子水平較低，不能催化LA轉(zhuǎn)化CLA；有輔助因子組各時間點產(chǎn)物均檢測到3 種CLA的產(chǎn)生，且c9,t11-CLA占TFA比例高于t10,c12-CLA和t9,t11-CLA（圖8）。隨著反應(yīng)時間的延長，c9,t11-CLA占TFA比例呈現(xiàn)上升趨勢，在反應(yīng)7 d可達（5.819±0.345）%，比天然酶轉(zhuǎn)化c9,t11-CLA的含量提高2.7 倍。但是t10,c12-CLA含量呈下降趨勢。顯然，等濕質(zhì)量體外單獨高效表達的3 個重組酶的菌體破碎液混合，CLA-DH和CLA-DC占TFA比例提高，比天然混合酶的占比高，促進反應(yīng)向生成c9,t11-CLA和t9,t11-CLA的方向進行。同時發(fā)現(xiàn)底物中混有的油酸含量減少，c9-十八碳烯酸和t11-十八碳烯酸的含量增加，說明亞油酸異構(gòu)酶系也能催化油酸轉(zhuǎn)化（圖9）。

圖8 重組酶體外催化反應(yīng)不同時間的CLA含量（一步法）Fig.8 Contents of CLA catalyzed by one-step method using recombinant enzymes in vitro on different days

圖9 重組酶催化反應(yīng)7 d氣相色譜分析CLA（一步法）Fig.9 GC chromatogram of CLA converted by one-step method using recombinant enzymes on day 7

2.5 重組CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC分步法催化LA轉(zhuǎn)化CLA

亞油酸異構(gòu)酶催化的反應(yīng)是有序進行的，且每一步反應(yīng)的酶和需要的輔助因子不同。為了探究每步反應(yīng)需要的條件和產(chǎn)物，反應(yīng)體系中分5 步依次加入含重組CLA-HY、CLA-DH、CLA-DC、CLA-DH和CLA-HY的菌體破碎液并每次加入的輔助因子不同，進行體外催化LA轉(zhuǎn)化CLA的研究，結(jié)果見表3。發(fā)現(xiàn)對照組由于酶滅活，5 步反應(yīng)產(chǎn)物中均無CLA產(chǎn)生。無輔助因子組的5 步反應(yīng)產(chǎn)物均沒有檢測到3 種CLA。輔助因子組第1步中加入CLA-HY和FAD有少量的10-HOE和t10,c12-CLA產(chǎn)生，說明CLA-HY即可催化LA向10-HOE方向，也可使得生成的10-HOE被CLA-HY催化生成t10,c12-CLA；第2步中加入CLA-DH和NAD+后除10-HOE和t10,c12-CLA，又出現(xiàn)了10-氧代-順12-十八碳烯酸，可能是CLA-DH脫氫產(chǎn)生NADH使得FAD轉(zhuǎn)化為FADH2，增強了CLA-HY轉(zhuǎn)化10-氧代-順12-十八碳烯酸為t10,c12-CLA的能力[28]；第3步再加入CLA-DC、NADH和第4步再加入CLA-DH、NADH、NAD+和FAD，產(chǎn)物中均出現(xiàn)了10-羥基-順11-十八碳烯酸和3 種CLA異構(gòu)體，CLA按占TFA比例從多到少依次為c9,t11-CLA、t9,t11-CLA、t10,c12-CLA。第5步再加入CLA-HY、NADH、NAD+和FAD，產(chǎn)物中t10,c12-CLA的含量增加。說明3 個重組酶混合加入（一步法）和按催化順序依次加入（分步法）需有輔助因子存在才能催化LA轉(zhuǎn)化CLA，因為重組酶自身缺乏輔助因子或輔助因子含量少。第4步的反應(yīng)產(chǎn)物中c9,t11-CLA占TFA比例達（4.780±0.321）%，t9,t11-CLA為（1.069±0.015）%，比第3步和第5步都高，可能是CLADH再加入，提高了CLA-DH/（CLA-DH+CLA-HY）使得LA轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA和t9,t11-CLA效率提升。第5步中加入CLA-HY后，c9,t11-CLA和t9,t11-CLA占TFA比例下降，而t10,c12-CLA占TFA比例增高，可能是由于提高CLA-HY占比，促使反應(yīng)向10-HOE轉(zhuǎn)化為t10,c12-CLA方向進行。

表3 重組亞油酸異構(gòu)酶系分步催化LA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物占TFA比例Table 3 Percentages of LA transformation products catalyzed by stepwise method using recombinant linoleate isomerase%

2.6 7 株乳酸菌CLA-HY 的結(jié)構(gòu)分析

在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)不同L. plantarum所產(chǎn)生的共軛亞油酸的異構(gòu)體類型不同，主要區(qū)別在于有無t10,c12-CLA，L. plantarump-8轉(zhuǎn)化亞油酸生成的t10,c12-CLA占比最高，推測不同的乳酸菌產(chǎn)t10,c12-CLA的能力差別可能與這些菌CLA-HY結(jié)構(gòu)有關(guān)系。所以研究7 株乳桿菌的CLA-HY的結(jié)構(gòu)，為后續(xù)通過酶改造提高重組酶催化LA轉(zhuǎn)化為CLA的能力奠定基礎(chǔ)。采用生物信息學(xué)的方法分析了L. plantarump-8、L. plantarumZS2058、L. plantarumST-III、L. plantarumATCC8014、L. plantarumWCFS1、B. animalisBB-12和L. acidophilusNCFM的CLAHY的一級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。利用DNAMAN軟件比對7 個菌株的氨基酸序列，序列比對結(jié)果見圖10，發(fā)現(xiàn)5 株L. plantarum的CLA-HY的氨基酸序列同源性高達99.97%；只有第25位和第286位氨基酸不同。L. plantarump-8第25位是谷氨酸（E），而其他4 株L. plantarum為天冬氨酸（D）；L. plantarumATCC8014在第286位是天冬氨酸（D），其他4 株為谷氨酸（E）。天冬氨酸和谷氨酸都是側(cè)鏈帶負電的氨基酸，只是天冬氨酸的側(cè)鏈比谷氨酸少1 個碳原子，推測其不影響蛋白的三維結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)揮。L. plantarump-8的CLA-HY與B. animalisBB-12和L. acidophilusNCFM的CLA-HY的序列同源性較低，分別為22.05%和26.81%，有多處位點的氨基酸不同。

圖10 氨基酸序列比對分析Fig.10 Alignment analysis of amino acid sequences

圖11 L. plantarump-8的CLA-HY與LAH的三維結(jié)構(gòu)比對Fig.11 Structural comparison of CLA-HY from L. plantarum p-8 and LAH

基于序列一致性較高的前提下同源建模，L. plantarump-8的CLA-HY與L. acidophilus的水合酶（L. acidophilushydratase，LAH，PDB ID：4IA5）的序列同源性為26.81%，以LAH為模板建模后，與LAH相比多了1 個Loop，少了1 個結(jié)構(gòu)域（圖11）。L. plantarump-8的CLA-HY的序列與已獲得晶體結(jié)構(gòu)的紅串紅球菌油酸水合酶（Rhodococcus erythropolisoleate hydratase，OhyRe）序列同一性高達54.83%，可信度相較更高，所以用OhyRe建模更好。以O(shè)hyRe的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：5ODO）為模板，對L. plantarump-8的CLA-HY進行同源建模并對兩者的三維結(jié)構(gòu)進行比對，經(jīng)Pymol軟件分析的疊圖（圖12）顯示，CLA-HY和OhyRe均有3 個結(jié)構(gòu)域，比對后共有5 處不同，分別是2 處α-螺旋和3 處Loop。由于不同之處位于蛋白質(zhì)的表面，所以推測其主要與蛋白質(zhì)的疏水性有關(guān)，但疏水性會影響到酶分子的溶解性、聚合體形式以及與底物的靠近難易度，進而影響到催化的效率。根據(jù)模型推測兩個酶的活性中心一致，可能催化機制相同。初步序列分析揭示了與OhyRe相同，都有1 個FAD結(jié)合的特征基序GXGXXGX21E/D存在，同樣反映在Rossmann折疊上；FAD結(jié)合位點是一個大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，足夠結(jié)合底物，用聚乙二醇模擬底物與OhyRe的結(jié)合，也證實了這一點。說明FAD與酶的功能緊密相關(guān)，底物結(jié)合位點與FAD位點位于3 個結(jié)構(gòu)域連接處的疏水空腔中。M77和Y205是OhyRe的兩個必需基團[29]，對應(yīng)于L. plantarump-8 CLA-HY的M76和Y180。實際底物與酶分子的結(jié)合與必需基團以及預(yù)測出5 處不同區(qū)域的確切功能還需要進一步通過蛋白質(zhì)突變技術(shù)、蛋白質(zhì)結(jié)晶或分子對接的方式探索。另外，B. animalisBB-12與L. acidophilusNCFM沒有高同源性模板，暫時無法利用服務(wù)器比較同源建模。

圖12 L. plantarum p-8的CLA-HY與OhyRe的三維結(jié)構(gòu)的比對Fig.12 Structural comparison of CLA-HY from L. plantarum p-8 and OhyRe

3 討 論

L. plantarump-8的重組CLA-HY有FAD時可催化LA轉(zhuǎn)化為10-HOE，然后加入重組CLA-DH和NAD+產(chǎn)物中又出現(xiàn)了10-氧代-順12-十八碳烯酸，這與實驗室前期報道的結(jié)果吻合[30]，而再加入重組CLA-DC和NADH后產(chǎn)物中主要有c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA三種異構(gòu)體。無論用菌體催化還是天然酶催化LA，都能產(chǎn)生c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA三種異構(gòu)體。所以，L. plantarump-8的亞油酸異構(gòu)酶系具有完整的生物轉(zhuǎn)化CLA的酶系和活性，但轉(zhuǎn)化能力不高，且根據(jù)產(chǎn)物可以推測L. plantarump-8與Kinsino等[17]報道的L. plantarumAUK1009 LA轉(zhuǎn)化CLA途徑一致（圖1A），包括水合、脫氫、雙鍵異構(gòu)、加氫和脫水反應(yīng)。即LA由CLA-HY催化水合生成10-HOE，產(chǎn)物10-HOE有兩種去向，一種直接經(jīng)CLA-HY催化脫水生成t10,c12-CLA；另一種由CLADH催化脫氫生成10-氧代-順12-十八碳烯酸，然后由CLA-DC催化生成10-氧代-反11-十八碳烯酸，經(jīng)CLA-DH催化加氫生成10-羥基-反11-十八碳烯酸，最后經(jīng)CLA-HY催化脫水生成c9,t11-CLA和t9,t11-CLA。同時，該轉(zhuǎn)化過程需要FAD、NAD+和NADH。

不同乳酸菌轉(zhuǎn)化LA為CLA的能力取決于亞油酸異構(gòu)酶系完整性、蛋白結(jié)構(gòu)、表達量以及酶系中3 個酶的表達量之比。無完整的酶系，則不具備催化功能。異構(gòu)酶系各酶的結(jié)構(gòu)不同，催化能力則不同。3 個酶的表達量不同致使CLA各異構(gòu)體產(chǎn)量不同，同時CLA-DH含量增加使得CLA產(chǎn)量增加。楊波[18]對88 株L. plantarum催化LA轉(zhuǎn)化CLA的能力進行了研究，發(fā)現(xiàn)部分L. plantarum可以轉(zhuǎn)化LA生成CLA，也有部分菌株不能轉(zhuǎn)化。L. plantarump-8轉(zhuǎn)化LA生成的c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA的轉(zhuǎn)化率分別2.0%、1.7%和0.9%，與楊波[18]報道的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）CCFM29、L. plantarumCCFM192、L. plantarumCCFM238、L. plantarumCCFM169等的轉(zhuǎn)化率及CLA異構(gòu)體組成相近。對L. plantarump-8轉(zhuǎn)化LA為CLA途徑中的3 個必需酶的mRNA表達量分析發(fā)現(xiàn)，在0.05 mg/mL LA誘導(dǎo)下CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC的mRNA相對表達量分別為2.357、0.969和0.872，都處于相對較低的狀態(tài)，從而使得總體CLA產(chǎn)量較低，這與楊波[18]報道的L. plantarumZS2058等高產(chǎn)CLA乳酸菌的CLA-HY亞油酸異構(gòu)酶系各酶表達量高，而L. plantarumST-III等低產(chǎn)CLA的亞油酸異構(gòu)酶系各基因轉(zhuǎn)錄水平較低相吻合。另外，在分步加入重組酶催化LA轉(zhuǎn)化CLA時，第4步反應(yīng)即在已經(jīng)加入3 個酶后再加入CLA-DH，CLA的生成量增加，也說明增加CLA-DH在3 個酶中的占比，可使CLA增產(chǎn)。

基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，L. plantarump-8的CLA-DH和CLA-DC基因為一個基因簇，即一個轉(zhuǎn)錄單位，中間間隔一個短序列，受一個啟動子控制，而CLA-HY為另一個基因簇成員，有另外的調(diào)控機制。L. plantarump-8CLADH和CLA-DC的mRNA轉(zhuǎn)錄量基本相同，而CLA-HY的mRNA轉(zhuǎn)錄量卻比之高出2.5 倍也證明了這一點。LA對細菌有一定毒性，LA轉(zhuǎn)化為CLA是細菌的一種脫毒機制。對LA抑制越敏感的菌株，其將LA轉(zhuǎn)化為CLA的能力也越強[31]。L. plantarump-8的CLA-HY的表達強于CLA-DH和CLA-DC，可能是由于CLA-HY受LA誘導(dǎo)才能表達，當(dāng)其產(chǎn)物10-HOE積累到一定程度才能進一步誘導(dǎo)CLA-DH和CLA-DC表達；也有可能是2 個啟動子的強弱不等。在無LA時L. plantarump-8菌體發(fā)酵不能催化CLA的生成，進一步說明CLA-HY基因受LA的誘導(dǎo)才表達，與Bischoff等[32]報道的肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原基因，也就是CLA-HY基因受脅迫響應(yīng)替代轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，是一個誘導(dǎo)表達型基因相吻合。

L. plantarump-8催化LA轉(zhuǎn)化CLA的檢測方法不同，測得結(jié)果偏差較大，分辨力也有差異。用SP2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）柱氣相色譜法測得L. plantarump-8菌體催化3 d時發(fā)酵上清液LA轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA的轉(zhuǎn)化率分別為2.0%、1.7%和0.9%，CLA總轉(zhuǎn)化率為4.6%。而劉勇[22]報道用230 nm波長處吸光度檢得L. plantarump-8發(fā)酵葵花油時LA轉(zhuǎn)化CLA的轉(zhuǎn)化率最高為4.7%，發(fā)酵豆乳中LA轉(zhuǎn)化CLA的轉(zhuǎn)化率為10.9%，PEG-20 m柱氣相色譜測得CLA只占TFA的0.33%（折算LA轉(zhuǎn)化CLA的轉(zhuǎn)化率為0.6%），轉(zhuǎn)化率非常低，且沒有分析出CLA異構(gòu)體類型和組成。杜美婷等[24]報道用230 nm波長處吸光度法，得到L. plantarump-8添加0.9 mg/mL LA轉(zhuǎn)化CLA量為69.2 μg/mL，轉(zhuǎn)化率為6.92%。這些結(jié)果不同的原因是CLA和LA在230 nm波長處都有最強吸收值，必然會對CLA的吸光度有很大干擾，影響CLA精確定量，而是否能分開CLA異構(gòu)體類型在于氣相色譜的分辨力，劉勇[22]用20 m長的PEG色譜柱，只能測出總CLA，不能將CLA各種異構(gòu)體分開。同時這些不同之處也與測試的時間點、萃取條件等有關(guān)。

不同乳酸菌轉(zhuǎn)化LA為CLA的異構(gòu)體組成與CLA-HY對底物與產(chǎn)物結(jié)合力有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)催化LA轉(zhuǎn)化為CLA的途徑符合Kishino等[17]推測的模型，說明L. plantarump-8的CLA-HY脫水活性的底物可以是10-HOE、10-羥基-反11-十八碳烯脂肪酸和10-羥基-十八碳脂肪酸，L. plantarump-8轉(zhuǎn)化LA為CLA的異構(gòu)體類型比L. plantarumZS2058多樣，可能相較L. plantarump-8的CLA-HY對底物的選擇性更寬。酶與產(chǎn)物的親和力越小，即生成的產(chǎn)物越容易從酶分子上脫落，推動反應(yīng)向這個方向進行，進而這種產(chǎn)物的比例越高。L. plantarump-8的CLA-HY以任何物質(zhì)為底物，催化的脫水反應(yīng)可產(chǎn)生t10雙鍵和c9雙鍵兩種，且與兩種產(chǎn)物的親和力相近，所以，各異構(gòu)體比例差異不大。另外，既然符合Kishino等[17]推測的模型，那么CLA-HY對LA和10-羥基-反11-十八碳烯脂肪酸親和力比對10-HOE的親和力大，生成CLA的量才越大。Kishino等[17]推測的模型也說明CLA-DH有相對專一性，既可以催化脫氫，也可催化加氫反應(yīng)。

L. plantarump-8的重組CLA-HY、CLA-DH和CLADC在有輔助因子幫助下無論混合加入催化還是分步依次加入催化均提高了LA轉(zhuǎn)化CLA的效率。對照組和無FAD、NAD+和NADH組中均未檢測到CLA，而添加輔助因子的3 個重組酶混合催化反應(yīng)7 d時，c9,t11-CLA占TFA比例可高達（5.819±0.345）%，比經(jīng)LA誘導(dǎo)后的L. plantarump-8菌體破碎液轉(zhuǎn)化能力提高了約2.7 倍，是由于重組酶催化時重組CLA-HY和CLA-DH占比和3 個酶的總濃度都有所提高。其中分步法的催化效率低于一步法，可能是由于L. plantarump-8的CLA-DH和CLA-DC是同一個啟動子，3 個酶可能在胞內(nèi)是以酶復(fù)合體催化反應(yīng)，在體外用重組酶催化反應(yīng)時，分步反應(yīng)中在第3步才加入CLA-DC，所以導(dǎo)致CLA產(chǎn)量低于一步法，并且在第4步中加入CLA-DH后，產(chǎn)物含量確有提高，這也進一步證實了酶復(fù)合物催化能力高的可能性。另外，經(jīng)分析催化反應(yīng)過程中酶系中各酶在反應(yīng)體系中的比例對各CLA異構(gòu)體的產(chǎn)量至關(guān)重要，在第5步再加入CLA-HY后，反應(yīng)向生成t10,c12-CLA的方向進行，則降低了其他CLA異構(gòu)體的含量。

同一菌株的CLA-HY催化LA轉(zhuǎn)化為CLA的能力與異構(gòu)體的組成與環(huán)境中的氧濃度、NADH濃度、NAD+濃度和CLA-DH/（CLA-HY+CLA-DH+CLA-DC）有關(guān)。實驗證明，L. plantarump-8全細胞催化和細胞破碎催化不同在于酶在破碎前后接觸的氧濃度顯然不同，3 種CLA異構(gòu)體的比例發(fā)生了很大變化。重組酶分步催化反應(yīng)時，在第4步和第3步中CLA異構(gòu)體的比例較其他階段發(fā)生了很大的變化，說明添加CLA-DH和輔助因子可以改變各CLA異構(gòu)體產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

本研究中L. plantarump-8在含有LA的MRS上清液和菌體破碎液體外催化LA時，都可以低效產(chǎn)生c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA，但菌體中只有很少的t10,c12-CLA。影響CLA低產(chǎn)的原因可能是亞油酸異構(gòu)酶系（CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC）的表達量都較低，且彼此之間存在差異，CLA-HY的表達量高于CLA-DH和CLA-DC。獨立表達的重組亞油酸異構(gòu)酶系在FAD和NAD+的輔助作用下才可完成LA轉(zhuǎn)化為CLA，一步法催化反應(yīng)7 d，c9,t11-CLA含量高于L. plantarump-8菌體粗酶催化，但是t10,c12-CLA含量卻低于L. plantarump-8菌體粗酶催化。L. plantarump-8轉(zhuǎn)化LA生成CLA的過程包含水合、脫氫、雙鍵移位、氧化和脫水反應(yīng)多步反應(yīng)，轉(zhuǎn)化途徑與L. plantarumAUK1009一致。亞油酸異構(gòu)酶系中的關(guān)鍵酶CLA-HY成功同源建模后，發(fā)現(xiàn)其有3 個結(jié)構(gòu)域，底物結(jié)合位點與FAD位點位于3 個結(jié)構(gòu)域連接處疏水空腔中，M76和Y180是2 個必需基團。