基于高通量測序的窖泥原核微生物群落多樣性在退化窖池中的空間異質(zhì)性

胡曉龍，余 苗，曹振華，王康麗，田瑞杰，韓素娜，李 華，李建民，曾 田，李 紅

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477200；3.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后研發(fā)基地，河南 澠池 472000；4.五糧液集團(tuán)有限公司，四川 宜賓 644000）

中國濃香型白酒是我國四大基本香型（濃、醬、清、米）之一，其綿甜爽凈和窖香濃郁為主的獨(dú)特風(fēng)格，深受國人青睞。窖泥是濃香型白酒生產(chǎn)的重要微生物來源之一，其微生物群落α及β多樣性是決定窖泥質(zhì)量優(yōu)劣（老熟或退化）及白酒品質(zhì)的主要內(nèi)因[1-3]，因此，窖泥微生物一直是國內(nèi)學(xué)者研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

近年來，隨著高通量測序等分子生物學(xué)手段在窖泥研究中的廣泛應(yīng)用，不同時(shí)間（窖齡）、空間（產(chǎn)區(qū)之間及窖池內(nèi)部）及質(zhì)量等級(jí)（退化、正常及優(yōu)質(zhì)）窖泥的微生物群落α及β多樣性、理化性質(zhì)以及兩者之間的相關(guān)性越來越清晰。其中窖泥物種多樣性（Shannon指數(shù)）及豐度（Chao1指數(shù)）隨窖泥窖齡（≤25 a）[4]、質(zhì)量[1-2,5]及窖池深度（窖壁和窖底）[6]增加整體上呈上升趨勢。窖泥微生物群落β多樣性研究表明，我國十余個(gè)濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)（四川、河南等）窖泥中的優(yōu)勢微生物主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），但其組成因窖泥窖齡、質(zhì)量及窖池空間位置及地域不同而呈現(xiàn)差異[1,6-14]。例如，隨著窖齡和質(zhì)量增加，F(xiàn)irmicutes呈下降趨勢，而Bacteroidetes和Euryarchaeota呈增加趨勢[1,4]；四川與安徽兩個(gè)產(chǎn)區(qū)窖泥的優(yōu)勢古菌種類不盡相同[14]；新窖窖底泥Bacteroidetes含量高于新窖窖壁泥[6]。Hu Xiaolong等[1]研究指出窖泥中菌群網(wǎng)絡(luò)樞紐主要隸屬于梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、甲烷桿菌綱（Methanobacteria）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia），與乳酸菌屬（Lactobacillus、Pediococcus和Streptococcus）呈極顯著負(fù)相關(guān)。窖泥理化性質(zhì)是影響窖泥微生物群落的主要因素，如含水量、pH值、銨態(tài)氮及有效磷與微生物群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，且被推薦為用于初步判斷窖泥質(zhì)量或老熟程度的簡便指標(biāo)[1,4,6,15]。

如前所述，窖泥退化作為窖泥研究的熱點(diǎn)之一，其微生物群落及理化特征已經(jīng)較為清晰[1-2]。但是窖泥原核微生物群落α和β多樣性在退化窖池中的空間分布規(guī)律、退化程度與窖池空間位置的關(guān)聯(lián)性等鮮見報(bào)道。因此，本研究以退化窖池為對(duì)象，采用高通量測序技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法解析退化窖池中窖壁上、中、下層及窖底窖泥中原核微生物群落多樣性及其空間分布規(guī)律，找出影響微生物群落的生物和理化因素，以期為深入揭示窖泥退化機(jī)理、預(yù)防窖泥退化及定向提升窖泥質(zhì)量技術(shù)的開發(fā)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品由河南某知名濃香型白酒企業(yè)（WGC酒業(yè)）提供，窖齡30 a。

氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、濃硫酸、鹽酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、亞硝基鐵氰化鉀、高氯酸鈉、氯化銨、酒石酸銻鉀北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；鉬酸銨 上海源葉生物科技有限公司；氟化銨、硼酸 上海麥克林生化科技有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV BlueStar A紫外分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PB-10 pH計(jì) 德國Sartorius公司；MP200A精密電子天平 上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋 金壇市中大儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 窖泥樣品采集

根據(jù)退化窖泥的感官特征（黃色、窖泥松散干燥、酯香和酒香弱等）選取退化窖池[1,15]。本研究隨機(jī)選取兩口窖齡30 a的退化窖池，每口退化窖池選取窖壁上的兩個(gè)（T1和T2）上層窖泥樣品，混合后作為該窖池的上層（PW-T）代表樣；選取窖壁中層M1和M2混合樣品作為中層（PW-M）代表樣；選取窖壁下層U1和U2混合樣品作為下層（PW-U）代表樣；選取窖底B1和B2混合樣品作為窖底泥（PB）代表樣（圖1），共計(jì)8 個(gè)代表樣品。每份混合樣品采集300 g，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 窖泥取樣位置Fig.1 Sampling locations of pit muds in the fermentation pit for Chinese strong-flavor Baijiu

1.3.2 理化指標(biāo)測定

參照李俊輝等[12]的烘干法和電位法分別測定窖泥含水量及pH值。采用酸、堿中和法滴定法測定總酸含量[16]。采用重鉻酸鉀氧化分光光度法測定乙醇含量[17]。采用靛酚藍(lán)比色法測定窖泥中銨態(tài)氮含量[18]。參照NY/T 1121.7—2014《土壤檢測第7部分 土壤有效磷的測定》測定窖泥中有效磷含量。

1.3.3 窖泥宏基因組提取及Illumina MiSeq測序

利用Magen HiPure Soil DNA Kit試劑盒并參照說明書對(duì)窖泥樣品總DNA進(jìn)行提取，然后用Qubit 2.0熒光定量儀測定其濃度和純度。將合格的DNA委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成建庫及Illumina MiSeq雙端測序。其中16S rDNA擴(kuò)增子引物對(duì)為F（5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′）和R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′），擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rDNA的V3-V4區(qū)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）及Qiime（1.9.1）軟件對(duì)高通量測序序列進(jìn)行質(zhì)控，包括序列拼接，以及去除含有N的序列、引物和接頭、質(zhì)量值低于20的堿基、長度低于200 bp的序列及嵌合體序列得到有效序列。使用VSEARCH（1.9.6）將有效序列進(jìn)行聚類，其中相似性不低于97%的序列歸為1 個(gè)可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。然后利用貝葉斯算法對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成?；贠TU得到分析結(jié)果，采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽平的方法，分別計(jì)算Shannon、Chao1等α多樣性指數(shù)反映群落的物種豐度和多樣性。采用HemI軟件繪制熱圖；采用軟件Canoco 5繪制冗余分析圖譜；采用SPSS 20軟件（IBM Corp., Armonk, NY）完成Pearson和Spearman相關(guān)分析。本研究挑選平均含量超過0.1%屬用于Spearman相關(guān)分析，共35 個(gè)屬，占每個(gè)樣品的83.9%～99.8%，表明其涵蓋了每個(gè)樣品中大部分微生物信息。將Spearman相關(guān)系數(shù)ρ≥0.8或ρ≤-0.8且呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）的屬采用Gephi進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 退化窖池不同位置窖泥原核微生物群落α多樣性分析

經(jīng)序列質(zhì)控，共得到478 518 條有效序列，平均長度為457 bp，每個(gè)窖泥樣品序列數(shù)在49 625～68 972 條之間，其中PW-U序列數(shù)量最多，PB最少，但其在不同位置窖泥之間不存在顯著差異（P＜0.05，表1）。窖泥樣品物種豐度（Observed OTU和Chao1指數(shù)）、多樣性（Shannon指數(shù)）及均勻度（Simpson指數(shù)）大小依次為PW-U或PB＞PW-M＞PW-T（P＜0.05，表1），表明窖泥原核微生物群落α多樣性存在顯著的空間異質(zhì)性，且隨著窖池深度增加呈顯著增加趨勢。其中Shannon指數(shù)與窖泥質(zhì)量呈正相關(guān)，能很好地反映窖泥老熟和退化程度[1,5-6,19]。由表1可知，所有窖泥原核微生物群落Shannon指數(shù)在0.33～3.38之間，遠(yuǎn)低于已報(bào)道同樣基于高通量測序得到的優(yōu)質(zhì)及老熟窖泥（5.5～6.45）[1,5-6,19]，說明窖池整體出現(xiàn)了退化。Shannon指數(shù)由大到小依次為PW-U＞PB＞PW-M＞PW-T（P＜0.05），反映窖泥退化嚴(yán)重程度PW-T＞PW-M＞PB＞PW-U，這也與窖池中窖泥自上而下退化的生產(chǎn)實(shí)踐一致。其中上層退化最為嚴(yán)重，這主要是由于上層窖泥最易受酒醅下沉或開窖影響[3]，暴露于空氣頻次高，水分散失大，導(dǎo)致其含水量下降快且厭氧微生物種類及含量減少，進(jìn)而導(dǎo)致窖泥微生物物種多樣性下降。

表1 退化窖池中不同位置窖泥樣品原核微生物群落α多樣性及其理化性質(zhì)Table 1 α-Diversity index of prokaryotic microbial community and physicochemical properties of pit muds from different locations of degraded pit

2.2 退化窖池不同位置窖泥的理化因子分析

由表1可以看出，窖泥理化因子可以分為兩大類，一類是不隨窖泥空間位置改變而呈顯著差異的因子（P＜0.05），包括乙醇、總酸及銨態(tài)氮。其中銨態(tài)氮含量與窖泥質(zhì)量及窖齡呈正相關(guān)，與酸含量呈負(fù)相關(guān)[1,4,15,20]，PW-T窖泥銨態(tài)氮含量最低且總酸含量最高（表1），再次表明PW-T窖泥退化最為嚴(yán)重，與上述微生物群落α多樣性結(jié)果一致。一類是在退化窖池不同空間位置呈顯著差異（P＜0.05）的因子，包括含水量（27.95%～38.70%，平均值32.7%）、pH值（3.92～4.88，平均值4.42）及有效磷含量（114.60～338.92 mg/kg，平均值259.27 mg/kg），幾乎均遠(yuǎn)低于已報(bào)道的優(yōu)質(zhì)窖泥及老熟（≥25 a）窖泥的含水量（38.1%～45.3%）、pH值（4.8～7.5）及有效磷含量（0.5～10 g/kg）[2,4,10,15,21]，符合退化窖泥低含水量、低pH值及低有效磷的“三低”理化特征[3,15]。其中PW-U窖泥含水量及pH值顯著高于其他位置，表明PW-U退化程度最低。但是，窖池其他位置（如PW-T和PW-M）窖泥之間的理化性質(zhì)（如含水量和pH值）沒有顯著差異，與能靈敏地反映出窖池空間異質(zhì)性，以及窖泥退化或者老熟程度的微生物指標(biāo)（如Shannon指數(shù)）相比，理化指標(biāo)的變化具有滯后性。

2.3 退化窖池不同位置窖泥微生物群落β多樣性分析

2.3.1 窖泥微生物群落組成門/綱水平分析

基于OTU注釋，共得到12 個(gè)門，其中11 個(gè)細(xì)菌門，1 個(gè)古菌門。共發(fā)現(xiàn)6 個(gè)優(yōu)勢（所有窖泥樣品中平均相對(duì)含量＞0.1%）菌門（圖2a），由高到低依次為Firmicutes（88.1%）＞Bacteroidetes（6.2%）＞Proteobacteria（3.9%）＞Euryarchaeota（0.8%）＞Actinobacteria（0.5%）＞Synergistetes（0.4%），其占每個(gè)樣品的99%以上。與我國南方和北方十余個(gè)濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)窖泥中的優(yōu)勢菌門種類基本沒有地域性差異[1,6-13]，這可能與我國窖泥具有高酸度、高乙醇、微氧和高水分等共性特征有關(guān)[22]。隨著窖池深度增加，窖泥優(yōu)勢菌門由單一的Firmicutes（PW-T和PW-M），逐漸變?yōu)? 個(gè)菌門（PW-U）和4 個(gè)菌門（PB）；Firmicutes呈下降趨勢，其他優(yōu)勢菌門呈不同程度的增加。其中PW-T、PW-M及PB中Bacteroidetes（0.03%～1.3%）和Euryarchaeota（0%～0.05%）相對(duì)含量均很低，與已報(bào)道的退化窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)更為接近[1]，而PW-U與老熟窖泥及優(yōu)質(zhì)窖泥存在一定的相似度，再次表明了本研究中的PW-U窖泥退化速度最慢。

在綱水平，共檢測到20 個(gè)可鑒定的綱及未分類的綱，共包括Clostridia、Bacteroidia及γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）等10 個(gè)優(yōu)勢菌綱（所有窖泥樣品中平均相對(duì)含量高于0.1%，圖2b），其在每個(gè)樣品的總相對(duì)含量均高達(dá)99%以上。隨著窖池深度增加，窖泥優(yōu)勢菌綱數(shù)量呈增加趨勢，PW-U（8 種）＞PB（6 種）＞PW-M（4 種）＞PW-T（2 種）；結(jié)構(gòu)上，芽孢桿菌綱（Bacilli）呈下降趨勢，其余9 種優(yōu)勢菌綱含量均呈增加趨勢，尤其是Clostrdia和Bacteroidia增長明顯，分別占PW-U窖泥的52.9%和23.1%。此外，甲烷菌含量的升高是判定窖泥老熟的重要指標(biāo)[1,6]，不同位置甲烷菌（Methanobacteria及Methanomicrobia）總相對(duì)含量為PW-U（2.94%）＞PB（0.06%）＞PW-M（0.04%）＞PW-T（0.005%）；Clostrdia和Bacteroidia相對(duì)含量一般隨著窖泥的窖齡和質(zhì)量增加而增加[1,4,7,19,23]，其總相對(duì)含量大小順序?yàn)镻W-U（75.9%）＞PB（20.3%）＞PW-M（20.2%）＞PW-T（2.3%），這也在一定程度上反映了不同位置窖泥的退化程度，即PW-T＞PW-M＞PW-U和PB。

群落β多樣性研究結(jié)果表明窖泥微生物群落組成在退化窖池中具有明顯的空間異質(zhì)性；且窖池上部退化程度比窖池下部嚴(yán)重，與前面窖泥微生物群落α多樣性及其理化分析結(jié)果吻合。

2.3.2 窖泥微生物群落組成屬水平分析

所有窖泥中共檢測到149 個(gè)可鑒定屬及未分類的屬，可鑒定屬在各位置樣品中的相對(duì)含量分別為99.98%（PW-T）、96.20%（PW-M）、89.02%（PW-U）及99.01%（PB），其中PW-U未分類屬相對(duì)含量最多為10.98%，這也表明該位置窖泥微生物復(fù)雜性可能更高[6]。Venn分析表明窖池中每個(gè)位置特有屬數(shù)量及其總相對(duì)含量分別為31 個(gè)和4.91%（PW-U）、21 個(gè)和0.56%（PB）、1 個(gè)和0.004%（PW-M）、1 個(gè)和0.003%（PW-T），表明PW-M和PW-T窖泥在退化過程中物種及含量最容易消失和減少，其物種幾乎均可在PW-U和PB窖泥中找到（圖3a）。此外，盡管PW-U（44 個(gè)）和PB（35 個(gè)）均存在數(shù)量較多的特有物種，但其含量僅分別占相應(yīng)窖泥的5.29%和1.05%（圖3b），表明共有屬是兩類樣品的主體微生物（平均相對(duì)含量＞94%）。

圖3 不同位置窖泥樣品（a）及PW-U與PB（b）中屬水平Venn圖Fig.3 Venn diagram showing unique and shared microbial community compositon between pit muds from different positions of the pit (a) and between PW-U and PB (b)

為了進(jìn)一步分析原核微生物群落在退化窖池中的空間異質(zhì)性，選取每個(gè)窖泥中含量前10的屬進(jìn)行熱圖分析，共33 個(gè)屬，其占PW-U的80.7%，占其他窖泥的93.7%～99.9%，再次反映了PW-U窖泥微生物菌群復(fù)雜性最高[6]。上述33 個(gè)屬分別隸屬于7 個(gè)綱，且主要集中在Bacilli（67.6%）、Clostridia（17.4%）、Bacteroidia（5.7%）和Gammaproteobacteria（1.0%）4 個(gè)綱（圖4）。其中乳桿菌屬（Lactobacillus，66.9%）＞己酸菌屬（Caproiciproducens，11.7%）＞嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum，3.1%）＞梭菌屬（Clostridiumsensu stricto12，1.1%）＞佩特里單胞菌屬（Petrimonas，1.1%）為窖泥中的優(yōu)勢屬，盡管與已報(bào)道的四川、安徽等濃香型白酒產(chǎn)區(qū)窖泥的優(yōu)勢屬種類一致性較高，但組成差異較大[4,6,8,24]。

圖4 所有窖泥樣品中含量前10屬熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis of the top 10 more dominant microbial genera in all pit mud samples

由圖4可知，不同位置的窖泥樣品清晰地聚成I和II兩個(gè)大簇，其中PW-U單獨(dú)聚為一簇（II），第I簇又可清晰地分為3 個(gè)亞簇，即PW-T、PW-M和PB，再次表明退化窖池中微生物群落具有明顯的空間異質(zhì)性。單因素方差分析結(jié)果表明，Lactobacillus相對(duì)含量PW-T（97.7%）＞PB（71.7%）＞PW-U（18.7%）（P＜0.05），PW-M介于PW-T和PB之間，但無顯著差異（P＞0.05）。而Caproiciproducens相對(duì)含量PW-U（28.8%）＞PW-M（14.3%）＞PB（3.4%）和PW-T（0.1%）（P＜0.05）。Proteiniphilum和Petrimonas相對(duì)含量PW-U（11.92%和4.19%）＞PB（0.38%和0.14%）＞PW-M（0.14%和0.11%）＞PW-T（0.09%和0.04%）。匯總文獻(xiàn)可知[1,2,4,8,14,24-25]，Lactobacillus是新窖泥（≤1 a）及退化窖泥中第一優(yōu)勢屬（≥55%），在老窖（≥20 a）、正常及優(yōu)質(zhì)窖泥中其含量相對(duì)較低（＜14%）；Clostridium和Caproiciproducens一般在老窖泥含量較高；Proteiniphilum和Petrimonas是一類能產(chǎn)乙酸的細(xì)菌，能與標(biāo)志窖泥老熟的甲烷菌共生。綜上，窖池下部（PW-U和PB）窖泥較窖池上部窖泥更為接近老窖及優(yōu)質(zhì)窖泥微生物群落組成，尤其PW-U，再次表明了窖池退化整體上是一個(gè)自上而下的過程。但PB退化程度高于PW-U，這可能是由于PB含水量（27.95%）顯著低于PW-U窖泥（38.7%，表1）導(dǎo)致，因?yàn)楹颗c窖泥老熟可能呈顯著正相關(guān)[6]。

2.4 退化窖池微生物群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

圖5 窖泥樣品中基于相對(duì)含量≥0.1%屬的同現(xiàn)相關(guān)（a）及負(fù)相關(guān)（b）網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Co-occurrence network (a) and negative correlation network (b)analysis for genera accounting for higher than 0.1% in pit muds

由圖5a可知，同現(xiàn)（正相關(guān)）網(wǎng)絡(luò)圖中共有32 個(gè)節(jié)點(diǎn)（實(shí)心圓點(diǎn)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)屬），127 條邊（兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的連線，粗細(xì)程度代表相關(guān)性強(qiáng)弱）。所有節(jié)點(diǎn)分別隸屬于8 個(gè)可鑒定綱及1 個(gè)unclassified，主要集中在Clostridia（占總節(jié)點(diǎn)數(shù)量50%）、Bacteroidia（18.75%）、Gammaproteobacteria（9.38%）及Methanobacteria（6.25%）。同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性主要為綱間微生物相關(guān)性（78.74%），綱內(nèi)相關(guān)性僅占21.26%，表明物種多樣性低可能是導(dǎo)致窖泥菌群網(wǎng)絡(luò)失衡的主要原因。

同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共存在9 個(gè)樞紐（多于11 條邊的節(jié)點(diǎn)為樞紐），分別為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、Proteiniphilum、沉積菌屬（Sedimentibacter）、泰氏菌屬（Tissierella）、氨基桿菌屬（Aminobacterium）、Petrimonas、黏膠微菌屬（Lentimicrobium）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）和互營單胞菌屬（Syntrophomonas）（圖5a），其分別隸屬于Methanomicrobia（1 個(gè)）、Bacteroidia（3 個(gè)）、Clostridia（3 個(gè)）、Synergistia（1 個(gè)）和Methanobacteria（1 個(gè)）5 個(gè)綱。樞紐總含量隨著窖池深度增加呈上升趨勢，即PW-T（0.00%）＜PW-M（0.05%）＜PB（0.14%）＜PW-U（2.84%），但遠(yuǎn)低于其在已報(bào)道的老窖（如僅Petrimonas一個(gè)屬相對(duì)含量就高于11.1%）[4]及優(yōu)質(zhì)窖泥（如僅Methanosarcina一個(gè)屬相對(duì)含量就高于4.2%）[1]中的含量。同時(shí)同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)立的模塊（圖5a），這可能是由于能鏈接兩個(gè)模塊的節(jié)點(diǎn)或樞紐含量極少或消失，如缺少能鏈接假單胞菌屬（Pseudomonas）的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）節(jié)點(diǎn)[1]，表明了整個(gè)窖池處于退化狀態(tài)，且退化程度由強(qiáng)到弱為PW-T＞PW-M＞PB＞PW-U。這主要是由于樞紐是影響整個(gè)環(huán)境微生物菌群網(wǎng)絡(luò)的重要因素，其種類及含量的減少將會(huì)導(dǎo)致整個(gè)菌群網(wǎng)絡(luò)碎片化[26-27]，進(jìn)而導(dǎo)致窖泥微生態(tài)穩(wěn)定性變差和窖泥菌群退化。

負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中，共15 個(gè)節(jié)點(diǎn)隸屬于7 個(gè)綱，13 條邊。負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)同樣是綱間相關(guān)性（92.31%）大于綱內(nèi)相關(guān)性（7.69%）。由圖5b可以看出，窖泥中呈負(fù)相關(guān)的微生物主要發(fā)生在Lactobacillus屬與其他屬之間，且與正相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中多數(shù)樞紐呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這與Hu Xiaolong[1]和Wang Xueshan[7]等研究結(jié)果一致。這主要是由于：1）Lactobacillus代謝物乳酸大量積累造成窖泥pH值下降，進(jìn)而導(dǎo)致窖泥中包括正相關(guān)網(wǎng)絡(luò)樞紐在內(nèi)的大量微生物（多數(shù)最適生長pH值為近中性）減少甚至消失[28-30]；2）其代謝的Nisin、Lactacin及Pediocin等抑菌素能抑制Clostridia及Bacillus等革蘭氏陽性細(xì)菌的生長繁殖[1,19]。因此，推測Lactobacillus含量激增是加速窖泥微生物群落失衡、菌群魯棒性降低及窖泥退化的主要生物原因。

2.5 退化窖池微生物群落與理化因子之間相關(guān)性分析

圖6 微生物群落與理化因子之間相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between microbial community and physicochemical factors

冗余分析展示了窖泥微生物群落β多樣性與理化因子之間的關(guān)系，圖6a中2 個(gè)主成分的總解釋度81%，主要集中在Axis1（60.1%）。理化因子對(duì)兩者之間相關(guān)性解釋度由大到小依次為含水量（51.4%）＞有效磷（16.4%）＞pH值（9.8%）＞總酸（6.6%）＞銨態(tài)氮（4.0%）＞乙醇含量（2.3%），其中含水量與微生物群落結(jié)構(gòu)呈極顯著關(guān)系（P＜0.01），這與張會(huì)敏等[6]研究結(jié)果一致。不同位置窖泥能被有效區(qū)分（圖6a），再次說明退化窖池中微生物群落具有明顯的空間異質(zhì)性。以Axis1軸0點(diǎn)垂直線為界，僅退化程度最低的PW-U在右側(cè)，與含水量、有效磷、pH值及銨態(tài)氮呈較強(qiáng)的正相關(guān)；而退化明顯的PW-T、PW-M和PB在左側(cè)，與總酸和乙醇呈較強(qiáng)的正相關(guān)，表明含水量、有效磷、pH值及銨態(tài)氮是促進(jìn)窖泥老熟及質(zhì)量提升的主要驅(qū)動(dòng)力，這主要是由于含水量過低將會(huì)導(dǎo)致窖泥中微生物能利用的自由水下降[6]、作為速效營養(yǎng)物質(zhì)的有效磷及銨態(tài)氮減少[15,31]，以及pH值降低均會(huì)影響窖泥微生物的生長繁殖[1]，進(jìn)而導(dǎo)致窖泥微生物群落失衡、魯棒性降低，加速窖泥退化。

Pearson相關(guān)性分析表明窖泥理化因子與其微生物群落α多樣性之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），但僅存在于pH值與Simpson指數(shù)之間（圖6b）。與之前報(bào)道的研究結(jié)果存在一定的異同性，如pH值與Shannon指數(shù)之間存在顯著相關(guān)性在本研究中未發(fā)現(xiàn)[1]，這可能是由于本研究所取窖泥樣品均處在退化階段，其pH（3.92～4.88）與Shannon指數(shù)（0.33～3.38）的跨度小且數(shù)值較低，在此范圍內(nèi)兩者相關(guān)性不顯著。理化因子之間Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，pH值與多種理化因子均呈顯著正（銨態(tài)氮）、負(fù)（總酸和乙醇）相關(guān)性，尤其是銨態(tài)氮，表明pH值可以作為一個(gè)綜合指標(biāo)反映窖泥整體的理化特征，這與胡曉龍[19]及Pietri等[32]的研究結(jié)果一致。

表2 窖泥理化因子與同現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)樞紐Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation analysis between physicochemical factors and hubs of co-occurrence network of pit muds

如前所述，同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的樞紐（共9 個(gè)屬）是維持窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素（圖5），且集中Clostridia和Bacteroidia，其與窖泥理化因子相關(guān)性見表2。上述樞紐中的5 個(gè)和7 個(gè)分別與窖泥pH值和含水量呈顯著（P＜0.05）或極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這也與之前報(bào)道的結(jié)果相似[1,6]，如pH值與Clostridia和Bacteroidia呈正相關(guān)。但上述樞紐與其他理化因子的正、負(fù)相關(guān)性均不顯著，例如，總酸和乙醇與6 個(gè)樞紐呈負(fù)相關(guān)，有效磷與所有樞紐呈正相關(guān)（P＞0.05）。盡管這種相關(guān)性在退化窖泥樣品不顯著，但其相關(guān)性的正、負(fù)狀態(tài)與已有報(bào)道一致，如有效磷與Methanobacteria中的屬呈顯著正相關(guān)性[1]。綜上，通過明晰菌群網(wǎng)絡(luò)樞紐與理化因子相關(guān)性，有助于為進(jìn)一步通過定向調(diào)整或控制窖泥的理化因子（如含水量、pH值等）以提升退化窖泥中樞紐屬的含量，進(jìn)而為窖泥微生物菌群的穩(wěn)定提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明窖泥微生物群落多樣性在供試退化窖池中存在明顯的空間異質(zhì)性，主要結(jié)果或結(jié)論有：1）窖池退化是一個(gè)自上而下的退化過程；2）微生物群落α多樣性指數(shù)（如Shannon指數(shù)等）能靈敏地反映窖泥退化程度及其在窖池中的空間異質(zhì)性，其隨窖池的深度增加呈顯著上升趨勢，但其在PB的值顯著低于PW-U窖泥；3）退化窖池窖泥理化因子具有低pH值、低含水量及低有效磷的“三低”特征，但其隨窖池深度增加的變化規(guī)律不明顯，表明其反映窖泥退化程度具有滯后性；4）微生物群落β多樣性具有明顯的窖池空間異質(zhì)性，且窖池下部（PB及PW-U）窖泥的微生物物種幾乎全部涵蓋了上部（PW-T和PW-M）窖泥的所有物種；5）退化窖池窖泥中作為菌群正相關(guān)網(wǎng)絡(luò)樞紐的屬總含量很低，主要集中在Clostridia和Bacteroidia，推測Lactobacillus激增是打破窖泥菌群網(wǎng)絡(luò)平衡的主要微生物；6）含水量及pH值是影響窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)主要驅(qū)動(dòng)力，其與菌群網(wǎng)絡(luò)樞紐呈顯著的正相關(guān)；7）窖泥pH值與多種理化因子呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，且與菌群α多樣性Simpson指數(shù)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，表明pH值作為一個(gè)綜合的指標(biāo)可用于窖泥質(zhì)量的初步判斷。