高效液相色譜法測定水果和蔬菜中維生素C含量的不確定度評定

王 霞 張維誼 韓奕奕 陳美蓮 豐東升

(上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708)

維生素C(Vitamin C)，又叫抗壞血酸，水溶性維生素的一種，是維持人體正?；顒硬豢扇鄙俚臓I養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。從結(jié)構(gòu)上，維生素C分為左式(L型)和右式(D型)，左式維生素C包括還原型和脫氫型兩種，其中還原型抗壞血酸極不穩(wěn)定，易被氧化成脫氫抗壞血酸；脫氫L-抗壞血酸經(jīng)L-半胱氨酸溶液還原后，采用紫外檢測器測定L(+)-抗壞血酸總量[3-4]。維生素C廣泛存在于新鮮水果和蔬菜中，其含量是評定蔬菜和水果營養(yǎng)價值的重要指標。

目前，維生素C含量的測定方法主要有滴定法、紫外分光光度法、熒光光譜法、高效液相色譜法等[5-8]。其中，高效液相色譜法因分離效果好、操作步驟簡單、靈敏度高、準確度高等被廣泛用于蔬菜水果中維生素C含量的測定。不確定度反映了測量值的分散性，是表征測量結(jié)果質(zhì)量的指標，其數(shù)值大小反映了測量結(jié)果質(zhì)量的高低，并影響檢驗結(jié)果的符合性判定[9-10]。關(guān)于熒光光譜法和紫外—分光光度法測定維生素C含量的不確定度評定的報道較多，而關(guān)于液相色譜法測定蔬菜和水果中維生素C含量的不確定度報告尚未見報道。文章擬依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS-GL 006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》，對高效液相色譜法測定蔬菜和水果中維生素C含量進行不確定度評定，分析不確定度的主要原因，為科學評價測量結(jié)果的準確性和可靠性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-抗壞血酸：純度98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

L-半胱氨酸：優(yōu)級純，國藥集團化學有限公司；

偏磷酸、磷酸三鈉、磷酸：分析純，國藥集團化學有限公司。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配有紫外檢測器，美國Agilent公司；

天平：ML204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

天平：MS105型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：S220型，精度±0.01，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速冷凍離心機：Heraeus X1R型，美國Thermo公司；

超純水儀：Mill-Q型，德國 Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 根據(jù)GB 5009.86—2016中第一法，修改如下：稱取樣品約1.000 0 g于50 mL燒杯中，加入適量20 g/L的偏磷酸溶液進行攪拌、提取，重復2～3次，將試樣轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容；將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min。準確吸取20 mL上清液于另一50 mL離心管中，加入10 mL 40 g/L的L-半胱氨酸溶液，加入100 g/L磷酸三鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，渦旋、振蕩，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5～2.8，用蒸餾水將試液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容。混勻，樣品溶液過0.45 μm水相濾膜后，供高效液相色譜儀檢測分析。

1.3.2 色譜條件 色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫(25.0±0.5) ℃；紫外檢測器波長245 nm；流動相為甲醇和20 g/L偏磷酸溶液(V甲醇∶V偏磷酸為3∶97)；流速0.7 mL/min；進樣量10 μL。

2 試驗與結(jié)果分析

2.1 數(shù)字模型

試樣中維生素C含量按照標準曲線法計算，保留3位有效數(shù)字，其數(shù)學模型為：

(1)

式中：

X——試樣中維生素C含量，mg/100 g；

Ci——從標準曲線得到的樣品待測液中維生素C的質(zhì)量濃度，mg/L；

V1——樣品提取液總體積，mL；

V2——樣品提取液V1中分取的溶液體積，mL；

V3——試樣溶液最終體積，mL；

m——樣品稱樣質(zhì)量，g；

f——稀釋倍數(shù)；

100、1 000——換算系數(shù)。

2.2 不確定度來源分析

測定過程中，水果、蔬菜中維生素C含量測定的不確定度來源如圖1所示。

圖1 高效液相色譜法測定水果和蔬菜中維生素C含量的不確定度來源Figure l Uncertainty source for the determination of vitamin C in fruits and vegetables with HPLC

(1) 標準品引入的不確定度。主要包括稱量引入的不確定度，純度引入的不確定度，標液配制、稀釋過程中產(chǎn)生的不確定度，線性擬合引入的不確定度。

(2) 樣品前處理引入的不確定度。主要包括樣品稱量引入的不確定度，樣品定容、稀釋過程中產(chǎn)生的不確定度。

(3) 樣品檢測重復性引入的不確定度。包括樣品的均勻性和代表性、重復性進樣、前處理過程的一致性及液相色譜儀響應和面積積分等因素引入的不確定度。

(4) 加標回收引入的不確定度。

2.3 不確定度的評定

2.3.1 標準品引入的不確定度

(1) 稱量引入的不確定度：準確稱取25.38 mg 維生素C (L-抗壞血酸標準品純度98.5%)，用20 g/L的偏磷酸溶液定容至25.00 mL，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液。

② 標準溶液稀釋過程引入的不確定度：采用1 mL單標線吸量管移取儲備液于10 mL容量瓶(A級)中，用20 g/L 的偏磷酸溶液定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的標準中間液。稀釋過程中引入的不確定度主要來自于1 mL A級單標線吸量管和10 mL A級容量瓶引入的誤差，計算過程同25 mL A級單線容量瓶，具體結(jié)果見表1。

表1 標準溶液配制、稀釋過程玻璃量器引入的不確定度Table 1 The uncertainty from the preparation and dilution of standard solution by glass container

(4) 標準系列工作溶液配制過程引入的不確定度：配制質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L 5個梯度的標準工作溶液，采用的量器有10 mL容量瓶和100，200，1 000 μL 移液器。配制過程中引入的不確定根據(jù) JJG 196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》和JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》規(guī)定的容量允許誤差進行計算，同時考慮試驗測試溫度為(20±5) ℃，標準系列工作溶液配制過程中移液器引入的標準不確定度見表2。

表2 標準系列工作溶液配制移液器引入的不確定度Table 2 The uncertainty from the preparation of series standards solution by pipette

(5) 標準曲線擬合引入的不確定度：上述5種標準系列工作溶液重復測定3次，采用最小二乘對每個濃度峰面積y的平均值與質(zhì)量濃度x進行擬合，線性方程如表3所示。

表3 標準曲線結(jié)果Table 3 Results of standard curve

由標準曲線擬合引入的不確定度

(2)

(3)

式中：

a——線性擬合方程斜率；

N——樣品溶液待測組分測定次數(shù)；

n——標準系列工作溶液總的測定次數(shù)；

C0——樣品溶液中待測組分的質(zhì)量濃度，mg/L；

Ci——各標準工作溶液的質(zhì)量濃度，mg/L；

SR——標準溶液峰面積殘差的標準差;

Ai——標準溶液的峰面積[12]。

綜上，整個檢測過程中，標準物質(zhì)各分量合成的相對不確定度為

2.3.2 樣品前處理過程引入的不確定度

表4 樣品提取、稀釋過程吸量管和容量瓶引入的不確定度Table 4 The uncertainty from pipettes and volumetric flasks during the extraction and dilution of sample

綜上，樣品前處理過程中，各分量合成的相對不確定度為

2.4 測量不確定度的評定與報告

2.4.1 合成標準不確定度 辣椒中維生素C含量的合成相對標準不確定度為

橙子中維生素C含量的合成相對標準不確定度為

2.4.2 擴展不確定度 根據(jù) CNAS-GL006:2019《化學分析中不確定度的評估指南》，擴展不確定度由合成標準不確定度乘以包含因子得到。取置信水平 95%，則k=2，辣椒中維生素C含量的擴展不確定度為U(X)=urel(X)×X×2=2.03%×33.7×2=1.4 mg/kg；橙子中維生素C含量的擴展不確定度為：U(X)=urel(X)×X×2=2.04%×42.3×2=1.7 mg/kg。

2.4.3 測定結(jié)果 采用高效液相色譜法測定辣椒和橙子中維生素C，當取樣量為1.000 0 g，k=2 (置信水平95%)時，辣椒中維生素C含量為(33.7±1.4) mg/kg；橙子中維生素C含量為(42.3±1.7) mg/kg。

3 結(jié)論

從樣品的稱量、提取、稀釋及標準物質(zhì)的稱量、配制、線性擬合以及測量的重復性等方面對高效液相色譜法測定蔬菜和水果中維生素C含量的不確定度進行了分析與評定。結(jié)果表明，高效液相色譜法測定蔬菜和水果中維生素C含量的不確定度主要來源于標準物質(zhì)的純度、配制及標準曲線的擬合過程，其次是測試的重復性和回收率，樣品的前處理過程影響較小。針對水果、蔬菜中維生素C含量的測定，國家標準中規(guī)定了液相色譜法、熒光光度法和滴定法，試驗僅對液相色譜法進行了不確定度評估，未對另外兩種方法進行不確定度評估，后續(xù)有待進行另外兩種方法的不確定度評估，并進行3種方法的比較。