基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)預(yù)測艾葉抗動脈粥樣硬化的分子機(jī)制

何樹苗，陳元堃，曾 奧，賀思晴，李春梅，林樹真，盧 群*

（1.廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東金妮寶科技發(fā)展有限公司，廣東 廣州 511475）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種脂質(zhì)驅(qū)動的動脈內(nèi)膜炎癥性疾病，其促炎和消炎機(jī)制的平衡決定了最終的臨床結(jié)果。目前，AS形成機(jī)制學(xué)說眾多，但炎癥始終貫穿疾病發(fā)生、發(fā)展并決定其最終轉(zhuǎn)歸[1]，AS抗炎治療可限制動物模型斑塊進(jìn)展[2]，有效改善患者預(yù)后[3]。

艾葉是菊科植物艾草的干燥葉，在臨床上的應(yīng)用范圍極廣。中醫(yī)認(rèn)為，艾葉性溫，味辛、苦，歸肝經(jīng)、脾經(jīng)和腎經(jīng)，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血、鎮(zhèn)咳平喘、殺蟲止癢及安胎的作用[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，艾葉還具有抗炎和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能的作用[5]，但在古方中未有體現(xiàn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，艾葉能降低IL-6、ILlβ、TNF-α炎癥因子的表達(dá)和分泌以及巨噬細(xì)胞NO的釋放量[6]，抑制炎癥反應(yīng)和改善氧化應(yīng)激；艾葉多酚通過抑制NO的產(chǎn)生、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的合成、炎癥因子表達(dá)以及絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化來抑制巨噬細(xì)胞的活化[7]；艾葉揮發(fā)油以及提取物對小鼠[8]、斑馬魚[9]的炎癥均有明顯抑制作用，提示艾葉可能具有抗AS的療效，而其具體作用成分和機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法探討艾葉抗動脈粥樣硬化的活性成分及其作用機(jī)制，為下一步的藥理研究提供基礎(chǔ)。研究思路流程見圖1。

圖1 研究思路流程圖Figure 1 Flow chart of research

1 材料與方法

1.1 艾葉化學(xué)成分及其靶點(diǎn)挖掘與歸屬

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php，Version 2.3）是一個針對中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)的研究平臺，整合了多種中草藥及其組成成分、成分結(jié)構(gòu)、靶標(biāo)與疾病間的關(guān)系等數(shù)據(jù)[10]。本研究從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）查找艾葉化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug like index，DL）篩選出符合條件的活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)，將OB ≥30%和DL ≥0.18設(shè)為篩選條件，獲取艾葉的活性成分用于后續(xù)研究[11]。Swiss Target Predication 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）是常用的預(yù)測中藥成分或者小分子化合物潛在靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫，能基于所提交的2D化合物或者3D結(jié)構(gòu)與已知的配體組合，從而預(yù)測中藥成分或小分子化合物的生物活性靶點(diǎn)[12]。本研究由Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取各有效成分的2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為SDF 格式文件，導(dǎo)入Swiss Target Predication預(yù)測靶點(diǎn)，以“probability ＞0.1”為篩選條件，最終得到艾葉化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測

Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）涵蓋了多個數(shù)據(jù)庫的基因信息數(shù)據(jù)，可以實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)-疾病交互信息匹配，獲取大量的靶點(diǎn)信息。本研究利用Genecards 數(shù)據(jù)庫查詢動脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)信息，選取Relevance score ＞20 的靶點(diǎn)。DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu，Version 5.0）是包含與人類疾病相關(guān)的基因和變體的重要數(shù)據(jù)平臺之一[13]。本研究在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫內(nèi)以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞，設(shè)定物種為人、Scores ＞0.3，獲取疾病靶點(diǎn)。為保證靶點(diǎn)的可靠性，將兩個數(shù)據(jù)庫所得靶點(diǎn)取交集，最終得到疾病的潛在靶點(diǎn)。

1.3 中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將中藥、有效化學(xué)成分及其對應(yīng)的作用靶點(diǎn)信息與相互關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape（v3.7.1），構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

Jvenn（http://jvenn.toulouse.inra.fr/）是一個高效靈活、可實(shí)現(xiàn)在線合成Veen 圖的工具。本研究將獲取的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入以匯集兩者的共同靶點(diǎn)，確定艾葉作用于動脈粥樣硬化的可能靶點(diǎn)。STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/，Version 10.5）是一種包含已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，收集了大量的蛋白相互作用數(shù)據(jù)。本研究將上述步驟篩選出的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺以確定其網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建靶點(diǎn)-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用MCODE插件分析核心基因。

1.5 通路富集分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/，Version6.8）能為大量的基因或蛋白提供系統(tǒng)、綜合的生物功能注釋信息，并找出最顯著富集的生物學(xué)注釋。本研究將篩選出來的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，結(jié)合R studio 進(jìn)行艾葉對動脈粥樣硬化的潛在作用靶點(diǎn)的GO功能注釋和KEGG 通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05，按照涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，篩選排名靠前的生物過程或通路做氣泡圖，最后結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫繪制關(guān)鍵通路機(jī)制圖。

1.6 主要活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證

本研究通過分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出AS與艾葉共有且度值最高的兩個靶蛋白分別與藥物中與之作用的同樣度值最高的兩個活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。應(yīng)用ChemOffice軟件構(gòu)建活性成分的3D結(jié)構(gòu)，保存為*mol2 格式，使其能量最小化。由PDB 數(shù)據(jù)（https://www.rcsb.org/）獲取關(guān)鍵蛋白的*PDB 格式3D 結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Discovery Studio 4.5軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等操作，利用AutoDock 軟件將活性成分及靶蛋白轉(zhuǎn)換為*pdbqt格式，最后運(yùn)行Vina進(jìn)行對接。如果結(jié)合能小于0 kJ/mol，說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾葉化學(xué)成分及其潛在靶點(diǎn)

本研究基于TCMSP數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)獲得艾葉有效化學(xué)成分，并以口服利用度及類藥性指數(shù)從中篩選得到9個成分，詳見表1。將由Pubchem 數(shù)據(jù)庫獲取的各有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Predication平臺預(yù)測靶點(diǎn)，以“probability ＞0.1”為篩選條件，匯總?cè)ブ?，共得?74個艾葉化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)。

表1 主要的艾葉有效化學(xué)成分Table 1 Effective chemical constituents from Folium Artemisia argyi

2.2 中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將2.1 所得的艾葉化學(xué)成分及靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。其中，（2R）-5，7-二羥基-2-（4-羥基苯基）苯并吡喃-4-酮、油酸乙酯、β-谷甾醇、豆甾醇和槲皮素作用靶點(diǎn)較多。

圖2 中藥-成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Network of herbal medicine-components-action targets

2.3 艾葉抗AS靶點(diǎn)獲取及PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

通過Jveen取成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，得到艾葉作用于動脈粥樣硬化的120個可能靶點(diǎn)。將篩選出的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺，設(shè)置相互作用閾值＞0.9，確定其網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，結(jié)果見圖3。網(wǎng)絡(luò)包含120個節(jié)點(diǎn)，259條邊。節(jié)點(diǎn)表示艾葉抗AS的潛在作用靶點(diǎn)，邊表示潛在作用靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，代表蛋白質(zhì)之間的結(jié)合關(guān)系，即共同促進(jìn)某生物功能進(jìn)行，不同顏色的邊表示不同的作用方式。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化分析，并應(yīng)用MCODE插件分析核心基因，關(guān)鍵蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。根據(jù)度值將節(jié)點(diǎn)分為不同的大小，節(jié)點(diǎn)越大表明其度值越高。顏色表示結(jié)合分?jǐn)?shù)的高低，由紅色至黃色再至藍(lán)色，靶點(diǎn)的結(jié)合分?jǐn)?shù)逐漸升高。

圖3 共同靶點(diǎn)蛋白互作信息Figure 3 Interaction information of common target protein

圖4 關(guān)鍵共同靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Interaction network of common target protein

2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對艾葉抗動脈粥樣硬化作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 通路分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選排名靠前的生物過程和信號通路。利用R studio構(gòu)建高級氣泡圖，并在KEGG數(shù)據(jù)庫中對關(guān)鍵通路進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 差異表達(dá)基因富集分析Figure 5 Enrichment analysis of DEGs

經(jīng)計(jì)算，排名前5位的關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine protein kinase，AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、熱休克蛋白HSP 90-alpha（Heat shock protein HSP 90-alpha，HSP90AA1）、視黃酸受體-alpha（retinoic acid receptor RXR-alpha，RXRA）。結(jié)果顯示，艾葉治療動脈粥樣硬化的蛋白主要通過調(diào)節(jié)核酸轉(zhuǎn)錄、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)過程發(fā)揮作用；在細(xì)胞構(gòu)成方面主要與細(xì)胞核、胞外小體與胞液有關(guān)；在分子功能方面主要涉及鋅離子結(jié)合、ATP結(jié)合以及類固醇激素受體激活等。KEGG通路注釋分析結(jié)果顯示，潛在靶點(diǎn)涉及37條相關(guān)信息通路，提示癌癥通路、PIK3-Akt信號通路、Rapl信號通路、RAS信號通路等與艾葉抗動脈粥樣硬化密切相關(guān)。對富集靶點(diǎn)最多的癌癥通路進(jìn)行詳細(xì)注釋，結(jié)果見圖7，通路中艾葉抗AS可能涉及的靶點(diǎn)用粉色標(biāo)記。

2.5 艾葉主要活性成分作用于SRC、HSP90AA1、RARX的分子對接驗(yàn)證

通過對“中藥-成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”的分析及查閱文獻(xiàn)可知，槲皮素與β-谷甾醇是艾葉作用于AS的主要活性成分。SRC、HSP90AA1、RARX不僅是疾病的靶點(diǎn)，也同樣出現(xiàn)在最終所得的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)之中且度值較高。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定結(jié)合能越低，發(fā)生相互作用的可能性越大。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素和β-谷甾醇分別與SRC、HSP90AA1、RARX 分子對接的結(jié)合能均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0 kJ/mol，表明其相互之間具有較好的結(jié)合活性（表3、圖7、圖8），槲皮素和β-谷甾醇作為抗AS藥物具有一定可行性。

圖6 癌癥通路圖解Figure 6 Detailed diagram of cancer pathway

圖7 槲皮素與關(guān)鍵蛋白分子對接示意圖Figure 7 Molecular docking of quercetin and key proteins

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)與槲皮素和β-谷甾醇的結(jié)合能Table 3 Binding energy of core targets with quercetin and β-sitosterol

圖8 β-谷甾醇與關(guān)鍵蛋白分子對接示意圖Figure 8 Molecular docking of β-sitosterol and key proteins

3 討論

本研究經(jīng)過篩選獲得槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等9個艾葉活性成分，將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相匹配獲得艾葉治療動脈粥樣硬化的120個關(guān)鍵靶點(diǎn)。靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，結(jié)合活性較好的關(guān)鍵靶點(diǎn)有AKT1、HSP90AA1、VEGFA、SRC、RXRA 等。AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）功能，VSMCs 中缺少AKT1 的表達(dá)會引起斑塊易損性特征，包括纖維帽變薄和核心區(qū)域壞死[14，15]。HSP90蛋白家族在動脈粥樣硬化斑塊中過表達(dá)，并與炎癥發(fā)生有關(guān)，HSP90 抑制劑降低HSP90AA1 的表達(dá)，其特異性抑制作用可促進(jìn)Nrf2 的激活，抑制NF-κB 在斑塊中表達(dá)[16]，通過抑制VSMCs的遷移增殖來減緩AS斑塊的形成，從而顯著減少病變。實(shí)驗(yàn)證明給予HSP90抑制劑后，高膽固醇飲食刺激的LDLR(-/-)小鼠VSMCs的遷移減少[17]，氧化應(yīng)激和炎癥因子水平降低，AS斑塊的穩(wěn)定性增高。VEGFA是與血管生成有關(guān)的重要生長因子，可參與VEGF、PI3K/Akt信號通路，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化和血管新生[18]，增加斑塊的易損性[19]，ApoE（-/-）小鼠中VEGFA的表達(dá)有助于AS的發(fā)展[20]。SRC是活躍于細(xì)胞接觸粘附連接及縫隙連接部位的一類銜接蛋白，通過磷酸化底物將特異蛋白定位于黏附結(jié)構(gòu)上，從而參與黏著連接信號通路[21]，介導(dǎo)細(xì)胞遷移與血管形成[22]，在AS斑塊形成及穩(wěn)定過程中起到關(guān)鍵作用。有研究證明SRC通過破壞黏附連接的完整性和促進(jìn)單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與AS病變的發(fā)展[23]。RXRA激動劑可降低促炎分子的表達(dá)和血管壁炎癥細(xì)胞的浸潤情況，抑制動脈粥樣硬化損傷的形成[24]。

富集分析和靶點(diǎn)歸屬分析結(jié)果表明，艾葉抗AS機(jī)制涉及核酸轉(zhuǎn)錄、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖遷移及凋亡等多個生物過程，有信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、酶和酶調(diào)節(jié)劑等多種物質(zhì)參與。KEGG 通路注釋分析結(jié)果顯示，活性成分的靶點(diǎn)顯著富集于PPAR、MAPK、Wnt、VEGF等癌癥通路，PIK3-Akt信號通路，Rapl信號通路、RAS信號通路等。在動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要的VSMCs增殖遷移及凋亡過程與癌癥中癌細(xì)胞的發(fā)展有相似之處。有研究證實(shí)，選擇性抑制PIK3-Akt信號通路能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減少斑塊巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制炎癥反應(yīng)從而穩(wěn)定AS 易損斑塊[25]。PIK3-Akt 能直接或間接地影響抑癌基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞存活[26]，細(xì)胞膜上PI3K的生成幫助激活A(yù)kt的信號因子PIP3，被激活的Akt可通過磷酸化參與凋亡、蛋白質(zhì)合成與代謝和細(xì)胞周期調(diào)控。高血壓、毒素及氧化作用等內(nèi)外環(huán)境因素?fù)p傷動脈內(nèi)膜后，導(dǎo)致單核細(xì)胞招募、粘附和侵入動脈內(nèi)膜[27]。Rap1是RAS超家族成員中與細(xì)胞黏附相關(guān)的一類蛋白，具有獨(dú)特的觸發(fā)細(xì)胞極化、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動性的能力，有助于與抗原呈遞細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附相互作用[28]。Ras與GTP蛋白結(jié)合被活化后能激活MAPK 級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)入細(xì)胞核參與其它激酶或轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化修飾，誘導(dǎo)與細(xì)胞周期進(jìn)程或其他細(xì)胞過程有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。單核細(xì)胞侵入動脈內(nèi)膜后分化成巨噬細(xì)胞，并開始吸收脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK級聯(lián)反應(yīng)可促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成[29]，多數(shù)情況下不單獨(dú)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，而是與其他信號通路（如PI3K/Akt/mTor、Wnt/b-catenin通路）相互作用，調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化進(jìn)程中炎癥發(fā)生、細(xì)胞黏附等過程。