血清維生素D結(jié)合蛋白與慢性腎臟病發(fā)生的相關(guān)性

彭 慧，李屾森，邢紅霞，李汶汶，曹長春

南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南京 211166

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是由各種原因引起的進(jìn)行性和不可逆的腎臟結(jié)構(gòu)或功能異常［1-2］，患病率高達(dá)8%～16%，已成為全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題［3-4］。人類維生素D結(jié)合蛋白基因是白蛋白多基因家族中的一員，該基因家族還包括白蛋白和甲胎蛋白基因［5］，維生素D結(jié)合蛋白（Vitamin D binding protein，DBP），也稱為Gc?球蛋白（GC?Glob?ulin），是一種糖基化的α?球蛋白，大小為58 kDa。DBP不僅可以運(yùn)輸維生素D及其代謝產(chǎn)物，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及清除壞死細(xì)胞外G?肌動蛋白等功能［6］。

CKD時普遍存在維生素D的缺乏［7-8］，DBP作為維生素D的主要載體蛋白，在CKD時是否會受到影響，目前并沒有系統(tǒng)的相關(guān)研究。已有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤［9］、糖尿?。?0-11］等終末期疾病中血清DBP 水平發(fā)生變化［12］，有理由推測DBP和CKD可能存在相關(guān)性。本研究通過分析正常對照組和CKD1～5期患者血清DBP水平的差異，探討血清DBP水平與CKD相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，初步建立包含DBP的CKD臨床風(fēng)險預(yù)測模型，并對其預(yù)測效能進(jìn)行評估，為CKD 的臨床診療提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2020年3—9月南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院腎內(nèi)科住院的患者110例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75 歲；②簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）；②服用活性維生素D制劑、西那卡塞、磷結(jié)合劑；③惡性腫瘤；④嚴(yán)重感染；⑤腎臟移植；⑥系統(tǒng)性淀粉樣變；⑦嚴(yán)重的肝臟疾?。虎嗌眢w一般情況較差者。排除27 例后，本研究共納入符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者83例，用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測患者血清DBP水平，收集患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，分析DBP 與CKD 相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，繪制DBP 診斷CKD 的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線），根據(jù)ROC 曲線的最佳臨界值將患者分為高DBP組和低DBP組，比較高DBP 組和低DBP 組患者的臨床資料。構(gòu)建包含DBP 的臨床風(fēng)險預(yù)測模型并評估其預(yù)測CKD 發(fā)生的效能。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2019?SR?022）。

1.2 方法

記錄患者一般信息及臨床資料：年齡，性別，是否貧血，近期是否服用鐵劑，重組人促紅細(xì)胞生成素等藥物，是否存在血管鈣化，心臟瓣膜鈣化。腎功能相關(guān)評價指標(biāo)：血清肌酐（serum creatinine，Scr），血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），β2 微球蛋白（β2?microglobulin，β2?MG），腎小球?yàn)V過率（glo?merular filtration rate，GFR），尿酸（uric acid，UA），甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）。肝功能相關(guān)評價指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotrans?ferase，ALT），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate ami?notransferase，AST）。其他評價指標(biāo)：血鈣，血磷。

CKD 是由于各種原因引起的進(jìn)行性和不可逆的腎臟結(jié)構(gòu)或功能異常。依據(jù)“腎臟疾病·改善全球預(yù)后”組織2012 年頒布的“慢性腎臟疾病評估和管理的臨床實(shí)踐診療指南”（KDIGO 2012指南），本研究分為：①正常對照組，GFR≥90 mL/（min·1.73 m2）且腎臟結(jié)構(gòu)和功能正常；②CKD 組，包括CKD 1～5 期患者；其中①CKD 1 期，GFR≥90 mL/（min·1.73 m2）伴有腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常，持續(xù)時間＞3 個月；②CKD 2 期，GFR 為60～89 mL/（min·1.73 m2）；③CKD 3期，GFR為30～59 mL/（min·1.73 m2）；④CKD 4期，GFR 為15～29 mL/（min·1.73 m2）；⑤CKD 5 期，GFR＜15 mL/（min·1.73 m2）。本研究共采用3 種分組標(biāo)準(zhǔn)：①83 例患者分為兩組，正常對照組和CKD組。②83 例患者分為3 組，正常對照+CKD 1 期組，CKD 2～3 期組，CKD 4～5 期組。③83 例患者分為6組，正常對照組，CKD 1 期組，CKD 2 期組，CKD 3 期組，CKD 4 期組和CKD 5 期組。GFR 的計算采用慢性腎臟病流行病學(xué)協(xié)作（chronic kidney disease epi?demiology collaboration，CKD?EPI）方程。高尿酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：男性血清UA 水平＞420 μmol/L，女性＞357 μmol/L。

入院第2天早晨收集入選者靜脈血標(biāo)本。標(biāo)本收集后30 min 內(nèi)離心（2 500 r/min，10 min），分裝于1 mL EP管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用ELISA法測定血清DBP，試劑盒（Catalog Number DVDBP0B）購自美國的R&D SYSTEMS公司。按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究統(tǒng)計分析采用SPSS21.0 軟件。服從正態(tài)分布的連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料間的比較采用方差分析。計數(shù)資料或等級資料采用頻率或百分比表示，兩組間比較采用Pearson 卡方檢驗(yàn)或校正卡方檢驗(yàn)。對于雙變量正態(tài)分布的資料采用Pearson相關(guān)分析，對于總體分布未知的資料和原始數(shù)據(jù)用等級表示的資料采用Spearman 秩相關(guān)分析。多因素Logistic回歸構(gòu)建臨床風(fēng)險預(yù)測模型，用ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）評估臨床風(fēng)險預(yù)測模型的預(yù)測效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清DBP水平的比較

本研究共納入83 例患者，正常對照組15 例（18.1%）；CKD 組68 例（81.9%）：其中CKD 1 期4 例（4.8%），CKD 2期6例（7.2%），CKD 3期15例（18.1%），CKD 4期4例（4.8%），CKD 5期39例（47.0%）。83例患者血清DBP平均值為（170.69±52.87）μg/mL，正常對照組和CKD 各期患者血清DBP 水平分別為：正常對照組（205.84±24.45）μg/mL；CKD 1 期（209.88±7.66）μg/mL；CKD 2 期（183.76 ± 21.90）μg/mL；CKD 3期（193.83±52.57）μg/mL；CKD 4期（133.31±15.84）μg/mL；CKD 5期（146.07±55.21）μg/mL。與正常對照組相比，CKD 1～3 期無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，CKD 4 期和CKD 5 期患者血清DBP 水平顯著降低（P＜0.05）；與CKD 3 期相比，CKD 4 期和CKD 5 期患者血清DBP水平顯著降低（P＜0.05，圖1）。

圖1 CKD1～5期血清DBP水平Figure 1 Serum DBP levels in 1～5 stages of CKD

2.2 相關(guān)分析結(jié)果

血清DBP水平分別與患者的年齡、血清Scr、BUN，是否伴有貧血、高血壓、瓣膜鈣化，是否使用重組人促紅細(xì)胞生成素、鐵劑等藥物呈負(fù)相關(guān)，與GFR、ALT、AST和血鈣水平呈正相關(guān)（表1）。

表1 血清DBP與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of serum DBP and clinical indicators

2.3 以血清DBP水平預(yù)測CKD發(fā)生的價值

通過繪制ROC 曲線明確血清DBP 對CKD 的影響程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清DBP 預(yù)測CKD 發(fā)生的AUC為0.752（95%CI：0.635～0.870，P=0.002），靈敏度為0.632，特異度為0.733，約登指數(shù)為0.365。血清DBP預(yù)測CKD的最佳臨界值（cut?off值）為161.40 μg/mL，提示血清DBP水平低于161.40 μg/mL的患者更易發(fā)生CKD（圖2）。

圖2 DBP診斷CKD發(fā)生的ROC曲線Figure 2 ROC curve of DBP diagnosis of CKD

2.4 CKD不同分期DBP水平百分條圖

根據(jù)血清DBP 預(yù)測CKD 發(fā)生的最佳臨界值分為高DBP 組和低DBP 組。83 例中正常對照組和CKD1 期共19 例，且全部患者均為高DBP 組；CKD 2～3 期21 例，其中17 例（81%）為高DBP 組，4 例（19%）為低DBP 組；CKD 4～5 期共43 例，其中18 例（42%）為高DBP 組，25 例（58%）為低DBP 組。隨著CKD 的進(jìn)展，高DBP 組患者所占比例減少，低DBP組患者所占比例增多（圖3）。

圖3 CKD不同分期DBP水平百分條圖Figure 3 Percentage bar graph of DBP levels in different stages of CKD

2.5 血清高DBP組與低DBP組患者臨床資料的比較

根據(jù)血清DBP預(yù)測CKD發(fā)生的最佳臨界值分為高DBP組和低DBP組。與高DBP組相比，低DBP組血清Scr、BUN增高，使用重組人促紅細(xì)胞生成素的患者增多，而血清GFR降低（均P＜0.05，表2）。

表2 血清高DBP組和低DBP組患者臨床資料的比較Table 2 Comparison of clinical data of patients with serum high DBP group and low DBP group

2.6 血清DBP水平與CKD的發(fā)生具有相關(guān)性

將單因素Logistic 回歸分析P＜0.2 的指標(biāo)以及與CKD 相關(guān)的臨床指標(biāo)納入二元Logistic 回歸模型中，結(jié)果顯示在校正了年齡（P=0.111）、性別（P=0.487）、高血壓（P=0.055）、糖尿病（P=0.515）、瓣膜鈣化（P=0.520）等因素后發(fā)現(xiàn)，UA（OR：1.009，95%CI：1.003～1.015，P=0.006）是CKD 的主要危險因素，而血清DBP（OR：0.981，95%CI：0.964～0.998，P=0.030）則是預(yù)防CKD的保護(hù)性因素（表3）。

表3 CKD多因素logistic回歸分析Table 3 Multivariate logistic regression analysis of CKD

將單因素Logistic 回歸模型中P＜0.2 以及與CKD 相關(guān)的臨床指標(biāo)用進(jìn)入法納入多因素Logistic回歸模型進(jìn)行分析，擬合優(yōu)度Hosmer?Lemeshow 檢驗(yàn)，卡方值15.807，P=0.045。

2.7 臨床風(fēng)險預(yù)測模型預(yù)測CKD發(fā)生的效能

綜合臨床風(fēng)險預(yù)測模型A納入年齡、性別、UA、是否合并瓣膜鈣化、高血壓、糖尿病，該回歸模型預(yù)測CKD 發(fā)生的AUC 為0.917（95%CI：0.849～0.985，P＜0.001），靈敏度為0.956，特異度為0.733，約登指數(shù)為0.689；綜合臨床風(fēng)險預(yù)測模型B 納入年齡、性別、UA、DBP、是否合并瓣膜鈣化、高血壓、糖尿病，該回歸模型預(yù)測CKD 發(fā)生的AUC 為0.942（95% CI：0.894～0.991，P＜0.001），靈敏度為0.868，特異度為1，約登指數(shù)為0.868；與模型A 相比，模型B 增加了血清DBP 這一預(yù)測變量，顯著改善了預(yù)測CKD 的AUC、特異度和約登指數(shù)（圖4）。

圖4 臨床風(fēng)險預(yù)測模型診斷CKD發(fā)生的ROC曲線Figure 4 The ROC curve of the clinical risk prediction model to diagnose the occurrence of CKD

3 討論

Aggarwal 等［13］研究發(fā)現(xiàn)腎病綜合征患者組和對照組的血清DBP水平相似。在該研究中，腎病綜合征患者的血清肌酐水平和腎小球?yàn)V過率水平與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明在腎功能不受損的腎病綜合征患者中，血清DBP 水平保持正常。這支持了我們的研究結(jié)論：在CKD 1～2 期時，血清DBP 水平正常。本研究還提示在腎功能嚴(yán)重降低時［GFR＜30 mL/（min·1.73m2）］，血清DBP 水平顯著降低。Doorenbos 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，CKD 患者的尿DBP 排泄顯著增加，這可能是CKD 4～5期患者血清DBP水平降低的重要原因。

Tagliabue 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，與低DBP水平的受試者比較，高DBP 水平的受試者患癌癥的危險性降低；Wang 等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥患者的DBP 水平較低（P＜0.01）；Fernando 等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血清DBP 濃度低與不育，子宮內(nèi)膜異位，多囊卵巢綜合征，自然流產(chǎn)以及不良妊娠結(jié)局（包括妊娠期糖尿病、先兆子癇、早產(chǎn)和胎兒生長受限）有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在CKD 4～5 期血清DBP 水平降低，進(jìn)一步在腎臟病領(lǐng)域證實(shí)了疾病狀態(tài)時，DBP的水平偏低，DBP可能作為一種保護(hù)性因子存在于各組織器官中。

目前國內(nèi)未有CKD 與血清DBP 相關(guān)關(guān)系的報道，國外研究多集中于血清DBP的單核苷酸多態(tài)性的研究，本研究首先發(fā)現(xiàn)了血清DBP水平與患者的年齡、血清Scr、BUN，是否伴有貧血、高血壓、瓣膜鈣化，是否使用重組人促紅細(xì)胞生成素、鐵劑等藥物呈負(fù)相關(guān)，與GFR、ALT、AST 和血鈣水平呈正相關(guān)。更加確切地說，本研究發(fā)現(xiàn)了在腎功能嚴(yán)重受損時，血清DBP水平降低。與綜合臨床風(fēng)險預(yù)測模型A（AUC=0.917，95%CI：0.849～0.985，P＜0.001）相比，綜合臨床風(fēng)險預(yù)測模型B（AUC=0.942，95%CI：0.894～0.991，P＜0.001）增加了血清DBP 這一預(yù)測變量，顯著改善了預(yù)測CKD 的AUC、特異度和約登指數(shù)。周苗等［18］構(gòu)建模型的預(yù)測因子有年齡、性別、高血壓、糖尿病、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、嗜堿性粒細(xì)胞百分比，模型AUC 為0.685（95%CI：0.678～0.692），靈敏度和特異度分別為70.220%和55.580%。與周苗的預(yù)測模型相比，本研究構(gòu)建的預(yù)測模型的靈敏度、特異度更好，更具有預(yù)測潛力。

雖然維生素D結(jié)合蛋白是維生素D及其代謝物運(yùn)輸過程中重要的載體蛋白，但Shroff 等［19］的研究表明CKD兒童患者25?羥維生素D和血清DBP無相關(guān)性，而Doyon等［20］的研究表明，腎小球病患者由于DBP 的喪失，繼發(fā)25?羥維生素D 降解加速。Brown等［21］研究進(jìn)一步表明，DBP 通過近端小管的重吸收機(jī)制維持維生素D的水平，過濾后的DBP 與巨蛋白結(jié)合，并由近端腎小管細(xì)胞通過內(nèi)吞作用吸收，因此蛋白尿會導(dǎo)致DBP 喪失，并可能導(dǎo)致維生素D缺乏癥。

但本研究也存在局限性，如沒有檢測血清維生素D，以便進(jìn)一步分析維生素D與DBP的關(guān)系；研究樣本數(shù)不夠大，研究對象僅隨訪了其住院期間的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，隨訪時間不夠長。后期需加大樣本量進(jìn)行多中心前瞻性研究，進(jìn)一步驗(yàn)證臨床風(fēng)險預(yù)測模型的預(yù)測效能。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，血清DBP 在CKD 4～5 期水平下降，與CKD的發(fā)生具有相關(guān)性。綜合臨床風(fēng)險預(yù)測模型增加了血清DBP這一預(yù)測變量，顯著改善了預(yù)測CKD的AUC、特異度和約登指數(shù)。綜合臨床風(fēng)險預(yù)測模型對CKD發(fā)生的預(yù)測效能較高，有助于篩查CKD的高?；颊撸孕柽M(jìn)一步探索血清維生素D結(jié)合蛋白在CKD中的具體機(jī)制。