Ag2S@BSA存儲(chǔ)液對(duì)純鈦表面成骨細(xì)胞行為的影響

湯澤華，朱文卿，邱 憬

南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029

純鈦具有優(yōu)異的理化性能、良好的生物相容性及骨整合潛能，是口腔種植體最常用的材料之一。鈦表面的理化特性決定了能否快速建立牢固的骨結(jié)合，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)鈦種植體的表面處理進(jìn)行了諸多嘗試，以期提高成骨速度，增加骨結(jié)合強(qiáng)度［1-4］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，純鈦表面和修飾改性鈦表面均存在時(shí)間依賴的生物活性老化現(xiàn)象［5］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，純鈦表面的二氧化鈦表層會(huì)吸附空氣中的碳?xì)浠衔镄纬商祭鄯e，且碳累積量與鈦表面親水性呈顯著的負(fù)相關(guān)性［6］。老化鈦表面生物相容性的降低可能與表面親水性的減弱有關(guān)，新制備的鈦表面具有超親水性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，成骨?xì)胞黏附、擴(kuò)散、增殖和堿性磷酸酶活性均呈時(shí)間依賴性降低［7-8］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在早期愈合階段，存放4 周后植入的鈦種植體周圍骨覆蓋率不足新鮮表面的50%［9］。

為了延緩鈦種植體表面的生物活性老化，提高鈦表面的骨結(jié)合效率，鈦種植體存儲(chǔ)媒介的優(yōu)化已成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究已提出了多種抗老化方法，如紫外光功能化、鹽溶液浸泡、等離子體處理、低真空存儲(chǔ)等［10-11］。其中，鹽溶液最為方便、經(jīng)濟(jì)。有文獻(xiàn)報(bào)道生理鹽水存儲(chǔ)可以減少鈦表面碳累積，改善鈦表面的親水性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、擴(kuò)散和增殖，提高Ⅰ型膠原表達(dá)和鈣沉積水平［12］。臨床中已經(jīng)運(yùn)用生理鹽水進(jìn)行種植體存儲(chǔ)，如ITI?Slactive 親水性種植體。但在種植區(qū)骨量不足或骨質(zhì)條件差的情況下，開發(fā)具有更強(qiáng)骨誘導(dǎo)活性的種植體存儲(chǔ)液勢(shì)在必行。

近年來，蛋白包裹的近紅外硫化銀（Ag2S）量子點(diǎn)因其良好的生物相容性及在生物介質(zhì)中良好的分散性被廣泛應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域［13］。有學(xué)者以牛血清白蛋白（boviaue serum albumin，BSA）為穩(wěn)定劑，在水溶液中制備納米銀材料，可形成穩(wěn)定的分散體，在納摩爾范圍內(nèi)產(chǎn)生最佳抗菌活性，且遠(yuǎn)低于體外測(cè)定的成骨細(xì)胞毒性濃度，合成的納米銀顆粒可作為生物材料或藥物產(chǎn)品的添加劑，分散在水溶液中，或涂覆于不同材料表面［14］。Zhou等［15］研究發(fā)現(xiàn)，包裹納米銀顆粒的絲纖蛋白基涂層具有良好的蛋白吸附性、親水性和持久的抗菌性能。體外研究表明，該涂層不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞附著、擴(kuò)散和增殖，還能增強(qiáng)堿性磷酸酶表達(dá)、膠原分泌和礦化。體內(nèi)研究顯示，具有骨架結(jié)構(gòu)的涂層顯著改善了新生骨的生成以及軟組織結(jié)合，有助于形成快速而持久的骨整合。由此推測(cè)蛋白包裹的Ag2S水溶液可用于鈦種植體的儲(chǔ)存，為開發(fā)新的種植體存儲(chǔ)液提供不同的思路。本研究制備一種BSA包裹的Ag2S 種植體存儲(chǔ)液，評(píng)估Ag2S@BSA 存儲(chǔ)液對(duì)鈦表面特性和成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

商用純鈦（99.5%，寶雞鈦業(yè)），砂紙（天津南景），氯化鈉、乙酸銀、硫化鈉、氫氧化鈉（分析純，上海國(guó)藥），BSA（南京生興生物），掃描電子顯微鏡（MAIA3 RISE，Tescan 公司，捷克），X 射線能譜儀（ULTIM EXTREME，Oxford公司，英國(guó)），標(biāo)準(zhǔn)型光學(xué)接觸角儀（SL200B，科諾公司，美國(guó)），小鼠MC3T3?E1細(xì)胞系（上海中科院細(xì)胞庫），α?MEM、FBS、青?鏈霉素雙抗、胰酶（Gibco公司，美國(guó)），鬼筆環(huán)肽（Cyto?skeleton 公司，美國(guó)），DAPI、CCK?8、RIPA 裂解液（上海碧云天），BCA試劑盒（南京凱基生物），堿性磷酸酶測(cè)試盒（南京建成），細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（Spectramax 190，MD公司，美國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（CLSM710，Zeiss公司，德國(guó)），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（上海天能5200）。

1.2 方法

1.2.1 存儲(chǔ)液及試件制備

存儲(chǔ)液的制備：Ag2S@BSA 存儲(chǔ)液的制備：定量稱取乙酸銀、硫化鈉和BSA，雙蒸水依次溶解配制為0.01 mol/L乙酸銀溶液、0.1 mol/L硫化鈉溶液和20 g/L BSA溶液。將乙酸銀溶液與BSA溶液以適量體積混合，所得混合液調(diào)節(jié)pH 至堿性后與硫化鈉溶液以適量體積混合得到Ag2S@BSA存儲(chǔ)液。生理鹽水存儲(chǔ)液制備：定量稱取氯化鈉粉末，雙蒸水稀釋為0.9%的氯化鈉溶液。BSA 存儲(chǔ)液制備：定量稱取BSA粉末，雙蒸水稀釋為5 g/L的BSA溶液。

試件制備：純鈦片經(jīng)砂紙打磨拋光，超聲清洗并干燥后備用。將純鈦試件隨機(jī)分為4 組，分別密閉保存于空氣（Air）、生理鹽水（Saline）、BSA 溶液、Ag2S@BSA 溶液中2 周后觀察鈦片表面特性及成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為。

1.2.2 鈦表面特性分析

4組鈦片在不同介質(zhì)中保存2周后，晾干后使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察試件的表面微形貌，X 線能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS）分析4 種介質(zhì)中存儲(chǔ)2 周后的試件表面元素分布情況。隨機(jī)選取4種介質(zhì)中存儲(chǔ)2周后的試件各3 枚，接觸角儀測(cè)量鈦片的接觸角及表面能以評(píng)價(jià)各組試件的表面親水性。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

體外復(fù)蘇MC3T3?E1 成骨細(xì)胞，加入α?MEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青?鏈霉素），于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、95% 相對(duì)濕度、5% CO2）內(nèi)靜置培養(yǎng)。每3 d換液，細(xì)胞密度達(dá)80%后1∶4傳代。

1.2.4 細(xì)胞黏附觀察

選用直徑5 mm、厚1 mm的純鈦片打磨拋光、超聲清洗后置于96 孔板中，分別以空氣、生理鹽水、BSA 溶液、Ag2S@BSA 溶液密閉存儲(chǔ)2 周，棄存儲(chǔ)液后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗3 遍，將MC3T3?E1 細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）接種于4 組材料表面孵育8 h，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，鬼筆環(huán)肽室溫下避光染色30 min，DAPI 室溫下避光染色2 min。激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取視野觀察各組試件表面細(xì)胞黏附形態(tài)。

1.2.5 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

每組各選用3枚純鈦片置于96孔板中，分別以4 種介質(zhì)密閉存儲(chǔ)2 周，棄存儲(chǔ)液后用PBS 漂洗3 遍，將MC3T3?E1 細(xì)胞（2×103個(gè)/孔）接種于4組試件表面。培養(yǎng)1、3、6 d后，加入200 μL新鮮配制的CCK?8 液37 ℃孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm下的吸光度。

1.2.6 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

將4 組鈦片置于6 孔板中，在4 種條件下保存2 周后用PBS 漂洗3 遍，將MC3T3?E1 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于4組鈦片表面培養(yǎng)7 d后，提取細(xì)胞總蛋白。以GAPDH 為內(nèi)參，Western blot 檢測(cè)成骨分化相關(guān)蛋白骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、骨鈣蛋白（osteo?calcin，OCN）的表達(dá)水平，Photoshop 軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)

將4 組鈦片置于6 孔板中，分別以不同介質(zhì)保存2 周，棄存儲(chǔ)液后用PBS 漂洗3 遍，將MC3T3?E1細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于4組鈦片表面培養(yǎng)7 d后，RIPA冰上裂解30 min，收集裂解液離心后取上清，采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，堿性磷酸酶測(cè)試盒測(cè)定ALP活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對(duì)親水性、細(xì)胞增殖、ALP活性和蛋白相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，顯示方差齊，進(jìn)行單因素方差分析和SNK 多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表面微形貌

掃描電鏡觀察純鈦試件在4種介質(zhì)中存儲(chǔ)2周后的表面形貌見圖1。低倍鏡下觀察4 組試件表面平坦，均可見整齊的機(jī)械劃痕。高倍鏡下生理鹽水組鈦表面可見散在分布的晶體，Ag2S@BSA 組鈦表面均勻分布納米級(jí)顆粒。該結(jié)果表明，鈦表面經(jīng)4種介質(zhì)存儲(chǔ)2 周后，表面微形貌無明顯改變，Ag2S@BSA 溶液浸泡后可形成大小均一的納米級(jí)顆粒吸附于鈦片表面。

圖1 純鈦試件在不同介質(zhì)中存儲(chǔ)2周后的掃描電鏡圖像Figure 1 SEM images of titanium specimens stored in different media for 2 weeks

2.2 表面元素分析

4組純鈦試件表面元素的EDS面分析結(jié)果如圖2 所示。各組試件表面均含有鈦、氧、碳元素，生理鹽水組可見散在重疊分布的鈉、氯元素，表明鈦片表面經(jīng)生理鹽水浸泡后散在分布氯化鈉晶體。BSA組表面相比空氣組和生理鹽水組碳元素和氧元素的分布更均勻密集，提示以碳元素和氧元素為主要組成元素的BSA 均勻吸附于鈦片表面。Ag2S@BSA組可見與顆粒重疊分布的銀元素和硫元素，提示含有Ag2S的納米顆粒形成并均勻吸附于鈦片表面。

圖2 純鈦試件在不同介質(zhì)中存儲(chǔ)2周后的EDS面分析圖像（×10 000）Figure 2 EDS mapping images of titanium surfaces stored in different media for 2 weeks（×10 000）

2.3 接觸角和表面能

4組純鈦試件的接觸角和表面能測(cè)量結(jié)果見圖3。生理鹽水組和BSA 組與空氣組相比接觸角減小，表面能增大，生理鹽水組和BSA 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ag2S@BSA 組與其余3 組相比接觸角明顯減小，表面能明顯增大，提示鈦表面的親水性得到了更好的留存。

圖3 純鈦試件在不同介質(zhì)中存儲(chǔ)2周后的接觸角和表面能Figure 3 Contact angle and surface energy of titanium specimens stored in different media for 2 weeks

2.4 細(xì)胞黏附觀察

4組試件表面接種MC3T3?E1細(xì)胞培養(yǎng)8 h后的黏附形態(tài)見圖4。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，空氣組黏附細(xì)胞較少，形態(tài)較為縮窄，生理鹽水組較空氣組鋪展稍大，BSA組較空氣組和生理鹽水組黏附細(xì)胞鋪展更為充分，Ag2S@BSA 組黏附細(xì)胞數(shù)量最多，鋪展充分，細(xì)胞偽足多而長(zhǎng)。結(jié)果表明Ag2S@BSA組促進(jìn)MC3T3?E1細(xì)胞黏附的作用最明顯。

圖4 四種介質(zhì)存儲(chǔ)后的鈦表面接種成骨細(xì)胞孵育8 h后的細(xì)胞黏附形態(tài)（×200）Figure 4 Adhesion morphology of osteoblasts cultured for 8 hours on titanium surfaces stored in four media（×200）

2.5 細(xì)胞增殖活性

4 組試件表面培養(yǎng)MC3T3?E1 細(xì)胞的增殖活性如圖5 所示。第1、3 天，各組吸光度值無明顯差異（P＞0.05）。培養(yǎng)6 d 后，生理鹽水組、BSA 組和Ag2S@BSA 組與空氣組相比吸光度值增高（P＜0.05），其中，Ag2S@BSA組吸光度值較生理鹽水組更高（P＜0.05），與BSA 組之間無顯著差異（P＞0.05）。該結(jié)果提示，與空氣組相比，經(jīng)3種液體存儲(chǔ)后的鈦表面均能促進(jìn)MC3T3?E1 細(xì)胞的增殖活性，其中Ag2S@BSA組的促進(jìn)作用相對(duì)明顯。

圖5 四種介質(zhì)存儲(chǔ)后的鈦表面接種成骨細(xì)胞1、3、6 d后的細(xì)胞增殖活性結(jié)果Figure 5 Proliferation of osteoblasts cultured for 1，3，and 6 days on titanium surfaces stored in four media

2.6 成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

4組鈦片表面接種MC3T3?E1細(xì)胞7 d后表達(dá)成骨相關(guān)蛋白的Western blot 條帶和灰度值比較結(jié)果見圖6。各組之間MC3T3?E1 細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，OPN、OSX、OCN 的相對(duì)表達(dá)水平由高到低依次為Ag2S@BSA組＞BSA組＞生理鹽水組＞空氣組。該結(jié)果表明，經(jīng)液體存儲(chǔ)后的鈦片表面增強(qiáng)了MC3T3?E1細(xì)胞的成骨分化活性，其中Ag2S@BSA組的促進(jìn)作用最明顯。

圖6 Western blot檢測(cè)4種介質(zhì)存儲(chǔ)后的鈦表面接種成骨細(xì)胞7 d后的成骨相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 6 Osteogenesis?related protein expression in osteo?blasts cultured for 7 days on titanium surfaces stored in four media Western blotting

2.7 ALP活性

4組試件表面接種MC3T3?E1細(xì)胞7 d后的ALP活性檢測(cè)結(jié)果見圖7。相比空氣組，經(jīng)3種液體保存后的鈦片表面成骨細(xì)胞ALP 活性均有不同程度升高，其中BSA 組和Ag2S@BSA 組ALP 的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。結(jié)果提示，經(jīng)液體存儲(chǔ)后的鈦片表面MC3T3?E1 細(xì)胞成骨分化活性增強(qiáng)，且BSA 組和Ag2S@BSA組更為顯著。

圖7 4種介質(zhì)存儲(chǔ)后的鈦表面接種成骨細(xì)胞7 d后的ALP活性Figure 7 The ALP activity of osteoblasts incubated for 7 days on titanium specimens stored in four me?dia

3 討論

近年來我國(guó)種植體植入數(shù)量逐年增長(zhǎng)，成品純鈦種植體通常保存在封閉的無菌包裝盒或生理鹽水中。純鈦表面暴露于空氣中可快速形成二氧化鈦層并吸附碳?xì)浠衔铮梢粚又旅艿难趸亩档筒牧系挠H水性［16］。Hori 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，純鈦、酸蝕和噴砂鈦表面隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)均存在生物老化過程，表面親水性逐漸轉(zhuǎn)為疏水性，且3種表面的蛋白吸附量與親水性成正相關(guān)。因此，如何改進(jìn)鈦種植體存儲(chǔ)方法，提高鈦表面親水性亟待研究。

為探索新型的種植體存儲(chǔ)媒介，本實(shí)驗(yàn)將BSA包裹的Ag2S 納米顆粒用于鈦表面存儲(chǔ)，以空氣、生理鹽水、BSA溶液為對(duì)照組，研究4種存儲(chǔ)介質(zhì)對(duì)純鈦表面特性及成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。打磨拋光的純鈦片置于4種介質(zhì)中存儲(chǔ)2周后于掃描電鏡下觀察，4組鈦片表面均呈現(xiàn)整齊的機(jī)械劃痕，表明不同存儲(chǔ)介質(zhì)保存后不會(huì)影響鈦片表面形貌。高倍鏡下可見Ag2S@BSA組鈦表面均勻吸附大小均一的納米級(jí)顆粒，而BSA組未見明顯變化，提示BSA包裹Ag2S 后聚集成核，體積增大。對(duì)比4 組試件的接觸角發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同溶液存儲(chǔ)后的鈦表面親水性與空氣組相比均有不同程度的提升，其中Ag2S@BSA 組接觸角最小，表面能最大。分析其原因可能是液體存儲(chǔ)隔絕了鈦表面的二氧化鈦層與空氣的接觸，減少鈦表面的碳累積，其中Ag2S@BSA組形成的納米級(jí)顆粒在鈦片表面均勻密集地吸附，使鈦表面的親水性得到更好地留存。

在不同介質(zhì)存儲(chǔ)2 周后的鈦表面培養(yǎng)MC3T3?E1細(xì)胞后的CEK?8結(jié)果顯示，經(jīng)過不同溶液存儲(chǔ)后的鈦表面成骨細(xì)胞的增殖活性較空氣組均有不同程度的改善，其中Ag2S@BSA 組相對(duì)更佳。提示BSA 包裹Ag2S以納米顆粒的形式吸附于鈦片表面，限制了其活動(dòng)性，消除了Ag2S的細(xì)胞毒副作用。表面修飾劑是硫化物納米粒子合成過程中控制粒徑大小和分布的關(guān)鍵，BSA因其良好的生物相容性和酶穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用為穩(wěn)定劑和修飾劑［18］。BSA 包裹后的金屬硫化物生物毒性降低，表面活性增強(qiáng)，且具有良好的尺寸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性［19］。有研究證明，BSA、腐殖質(zhì)、藻酸鹽等天然有機(jī)質(zhì)包覆可以通過穩(wěn)定Ag2S納米顆粒、減少其與細(xì)胞相互作用造成的細(xì)胞膜損傷程度來減輕納米材料的毒性，其中BSA包覆層最厚，對(duì)細(xì)胞膜損傷程度最小［20］。

激光共聚焦、ALP 活性和Western blot 結(jié)果表明，Ag2S@BSA 組成骨細(xì)胞的黏附和成骨分化活性顯著提升，可能與鈦表面親水性的增加和蛋白吸附有關(guān)［21］。Calciolari 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，親水性鈦表面通過調(diào)控特異性信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和有絲分裂原活化蛋白激酶等途徑促進(jìn)血管生成、骨礦化和骨重建。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，親水性種植體早期成骨反應(yīng)增強(qiáng)，炎癥反應(yīng)降低［23］。這歸因于血清中的生物活性因子在親水性鈦表面快速擴(kuò)散，通過調(diào)節(jié)吸附蛋白量、構(gòu)象和結(jié)合強(qiáng)度促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化［24］。蛋白吸附在骨整合過程中至關(guān)重要，種植體在植入后幾毫秒內(nèi)血液即可快速擴(kuò)散，蛋白吸附于鈦表面形成生物活性修飾，進(jìn)而影響后續(xù)的細(xì)胞黏附、增殖和擴(kuò)散［25］。選用血漿蛋白對(duì)不同形貌和潤(rùn)濕性的鈦種植體進(jìn)行吸附研究發(fā)現(xiàn)，親水性表面促進(jìn)了蛋白質(zhì)的選擇性吸附，增強(qiáng)了細(xì)胞黏附、增殖等生物學(xué)行為［26］。

綜上所述，本研究以BSA 為穩(wěn)定劑制備包裹Ag2S 的納米顆粒用于純鈦表面的存儲(chǔ)，結(jié)果表明，Ag2S@BSA 溶液存儲(chǔ)后的純鈦表面親水性和表面能增加，對(duì)成骨細(xì)胞無明顯毒性作用，且能促進(jìn)其黏附、增殖和成骨分化。本研究結(jié)果可為新型種植體存儲(chǔ)液的研發(fā)提供新的思路，后續(xù)研究將對(duì)其最優(yōu)濃度和銀離子釋放產(chǎn)生的抗菌性能進(jìn)行更深入的探索。