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    人工栽培桑黃不同生長期子實(shí)體的主要活性成分測定比較

    2021-06-03 09:55:32張文雋吳亞召馬婧嘉
    食用菌 2021年3期
    關(guān)鍵詞:桑黃三萜試液

    張文雋 吳亞召 雷 萍* 馬婧嘉 賈 靜 張 歡

    (1陜西省微生物研究所,陜西西安 710043;2陜西崇德生物技術(shù)發(fā)展有限公司,陜西西安 710201)

    桑黃(Sanghuangporusspp.)隸屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)非褶菌目(Polyporales)銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)桑黃孔菌屬(Sanghuangporus),是多年生大型藥用真菌,因其通常生長于桑屬植物上,子實(shí)體為黃褐色而得名[1]?!侗静菥V目》詳細(xì)記載了桑黃的藥性:“味甘、性平。主治女子漏下赤白,血病腹內(nèi)凝塊,腫痛,陰陽寒熱,不孕。療月經(jīng)不調(diào)?!盵2]民間用于治療肝腹水、肝硬化等癥?,F(xiàn)代研究表明,桑黃有效活性成分有多糖類、黃酮類、三萜類、甾類、多酚類、吡喃類及生物堿等,具有顯著的醫(yī)療保健功效及較高的營養(yǎng)價(jià)值[3]。桑黃多糖類物質(zhì)是桑黃主要有效成分之一,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗炎、護(hù)肝、降血糖血脂等廣泛的藥理作用[4]。黃酮類化合物是桑黃具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、增強(qiáng)心血管系統(tǒng)等作用的重要藥理成分[5]。桑黃含有的三萜類化合物具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等藥用功效[6-10]。不同生長發(fā)育期的藥用真菌子實(shí)體活性有效成分含量差異較大[11-13]。故藥用菌采收時(shí)間直接影響其有效成分及藥效。研究藥用菌生長期有效成分含量變化,對(duì)探索其適宜的采收期尤為重要。目前關(guān)于桑黃多糖、總黃酮和總?cè)频难芯繄?bào)道主要集中在提取測定、分離純化和藥理藥效等方面,對(duì)不同生長期桑黃子實(shí)體中三種活性成分含量變化研究報(bào)道較少,為此筆者進(jìn)行人工栽培桑黃不同生長期子實(shí)體的(以下稱桑黃子實(shí)體)多糖、總黃酮、三萜測定,以期為桑黃子實(shí)體的適時(shí)采收及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    桑黃桑-S子實(shí)體為2019年6月中旬至8月下旬采集自陜西省微生物研究所試驗(yàn)基地,分別為原基發(fā)生后生長30 d、40 d、50 d、60 d、70 d、80 d、90 d、100 d。采收后桑黃子實(shí)體由鼓風(fēng)干燥箱68℃烘干2.5 h,粉碎后過孔徑為0.85 mm篩,備用。

    試劑:葡萄糖、蘆丁、齊墩果酸(均為標(biāo)準(zhǔn)品),美國Sigma;無水乙醇、苯酚、硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯仿、香草醛、冰乙酸、高氯酸(均為分析純)。儀器:WGL-65B鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司),F(xiàn)W177型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司),RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠),TG16高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司),LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興有限公司),TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)。

    1.2 多糖測定方法

    1.2.1 樣品制備

    分別精確稱取待測桑黃樣品2.0 g,加入蒸餾水100 mL充分混勻,70℃水浴提取2 h,真空抽濾,收集濾渣按上述操作重復(fù)1次,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/5,加入無水乙醇至乙醇終濃度達(dá)80%,置于4℃冰箱靜置過夜,3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,用80%乙醇洗滌沉淀,離心,此操作重復(fù)2次,沉淀用蒸餾水溶解定容至250 mL,即得多糖測定供試液。

    1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    精確稱取105℃條件下干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品20 mg,于100 mL容量瓶中溶解定容,配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL于25 mL具塞試管,加入蒸餾水至1 mL。然后加入5%苯酚溶液2 mL,振蕩搖勻,再加入濃硫酸7 mL,充分搖勻,靜置顯色30 min,于490 nm波長處測定吸光值,計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.3 供試液多糖含量的測定

    吸取供試液0.5 mL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作,測定吸光值并計(jì)算不同生長期桑黃樣品中多糖含量。

    1.3 總黃酮測定方法[14]

    1.3.1 樣品制備

    精確稱取待測桑黃樣品粉末10.0 g,加入70%乙醇200 mL,于室溫下浸提24 h,真空抽濾,收集濾渣按上述操作重復(fù)1次,合并濾液,真空濃縮回收乙醇,濃縮液中加水繼續(xù)濃縮以揮發(fā)殘留的乙醇,水液冷凍干燥,得桑黃提取物。準(zhǔn)確稱取桑黃提取物17.3 mg于25 mL容量瓶中,用70%乙醇定容,即得總黃酮測定供試液。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    精確稱取蘆丁對(duì)照品23.2 mg,于50 mL容量瓶中用70%乙醇溶解定容,配制成0.464 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶,加入5%NaNO2溶液1 mL,充分搖勻后放置6 min,然后加入10%Al(NO3)3溶液1 mL,振蕩搖勻放置6 min,再加入4%NaOH溶液10 mL,搖勻后用70%乙醇定容,靜置顯色10 min,于510 nm波長處測吸光值,計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.3 供試液總黃酮含量的測定

    吸取供試液3 mL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作,測定吸光值并計(jì)算不同生長期桑黃樣品中總黃酮含量。

    1.4 總?cè)坪繙y定方法

    1.4.1 樣品制備

    準(zhǔn)確稱取待測桑黃樣品粉末0.2 g,置于100 mL具塞磨口三角瓶,加入氯仿50 mL,超聲處理60 min,放冷,移至100 mL容量瓶中,用氯仿洗滌三角瓶3次,洗滌液合并入同一容量瓶中,并加入氯仿定容至100 mL,搖勻,即得總?cè)茰y定供試液[15-16]。

    1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    精確稱取95℃干燥2 h齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,于100 mL容量瓶中用氯仿溶解定容,配制成0.1 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于5 mL具塞試管中,常壓下60℃水浴蒸干溶劑。依次加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL,搖勻,70℃水浴加熱15 min,取出,立即冰浴冷卻5 min,再水浴調(diào)至室溫。用冰乙酸定容至5 mL,搖勻后于30 min內(nèi)在548 nm波長處測吸光度值,計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4.3 供試液總?cè)坪康臏y定

    吸取供試液1 mL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作,測定吸光值并計(jì)算樣品中總?cè)坪俊?/p>

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    采用Excel 2013和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程與相關(guān)系數(shù)

    分別繪制多糖、總黃酮和總?cè)茰y定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性回歸方程與相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表1。由表1可知,相關(guān)系數(shù)均為0.99以上,符合檢測的要求。

    2.2 不同生長期桑黃子實(shí)體的多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)

    不同生長時(shí)期桑黃子實(shí)體的多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)及變化見表2、圖1、圖2。

    表2 不同生長期桑黃子實(shí)體多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)

    圖1 不同生長期桑黃子實(shí)體的多糖、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢

    圖2 不同生長期桑黃子實(shí)體的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢

    由表2、圖1和圖2可以看出,多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著桑黃子實(shí)體生長時(shí)間的遞增逐漸升高,分別在生長60 d、70 d時(shí)達(dá)最高,隨后又逐漸下降。

    多糖、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致,在子實(shí)體生長30~70 d逐漸上升,70 d時(shí)達(dá)最大值,為4.26%、2.22%,之后又逐漸降低;總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在子實(shí)體生長30~60 d快速上升,至60 d時(shí)達(dá)最高值(24.05%),生長70 d之后下降迅速。

    3 小結(jié)

    對(duì)桑黃的三種活性成分測定結(jié)果表明:人工栽培桑黃子實(shí)體生長70 d時(shí),其多糖和總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)最高,為4.26%、2.22%,生長80 d次之,為3.87%、1.85%;生長60 d時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)最高,為24.05%,生長70 d時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅次于60 d,為23.34%。綜合考慮這3種主要有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù),再結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的子實(shí)體產(chǎn)量,桑黃子實(shí)體生長70 d時(shí)應(yīng)為最佳采收期,此時(shí)采收可有效保障活性成分含量,為市場提供更為優(yōu)質(zhì)的桑黃產(chǎn)品。

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