miR-577通過靶向調控HOXA1對乳腺癌MDB-MA-231細胞增殖、侵襲和遷移的影響

丁保鋒

【摘要】 目的：探討miR-577靶向調控HOXA1對乳腺癌MDB-MA-231細胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法：將體外培養(yǎng)的MDB-MA-231細胞分為對照組（未處理）、miR-NC組（轉染miR-577模擬物陰性對照）、miR-577組（轉染miR-577模擬物）、miR-577+pcDNA組（轉染miR-577模擬物和pcDNA3.1質粒）和miR-577+HOXA1組（轉染miR-577模擬物和pcDNA3.1-HOXA1質粒），采用實時熒光定量PCR測定MDB-MA-231細胞中miR-577和HOXA1 mRNA的表達，Western blot測定HOXA1蛋白表達，熒光素酶報告基因實驗測定miR-577和HOXA1的靶向關系，CCK-8法測定MDB-MA-231細胞增殖，流式細胞儀測定細胞周期分布，Transwell小室測定MDB-MA-231細胞侵襲和遷移。結果：與對照組、miR-NC組相比，miR-577組細胞中miR-577表達水平、G0/G1期細胞百分比升高，HOXA1 mRNA和蛋白表達水平、48與72 h細胞增殖活力、S期細胞百分比、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與miR-577組、miR-577+pcDNA組相比，miR-577+HOXA1組中HOXA1 mRNA和蛋白表達水平、48與72 h細胞增殖活力、S期細胞百分比、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均升高，G0/G1期百分比降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：miR-577可通過靶向HOXA1抑制MDB-MA-231細胞增殖、侵襲和遷移。

【關鍵詞】 miR-577 乳腺癌 HOXA1 增殖 侵襲 遷移

Effects of miR-577 Inhibits Proliferation， Migration and Invasion of Breast Cancer MDB-MA-231 Cells by Targeting HOXA1/DING Baofeng. //Medical Innovation of China， 2021， 18（10）： 0-018

[Abstract] Objective： To investigate the effects of miR-577 targeting HOXA1 on proliferation， invasion and migration of breast cancer MDB-MA-231 cells. Method： MDB-MA-231 cells cultured in vitro were divided into control group （untreated）， miR-NC group （transfected negative control of miR-577 mimics）， miR-577 group （transfected miR-577mimics）， miR-577+pcDNA group （transfected miR-577 mimics and pcDNA 3.1 plasmids） and miR-577+HOXA1 group （transfected miR-577 mimics and pcDNA3.1-HOXA1 plasmids）. The expression of miR-577 and HOXA1 mRNA in MDB-MA-231 cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR， the expression of HOXA1 protein was measured by Western blot， the targeting relationship between miR-577 and HOXA1 was checked by double luciferase reporter gene assay， the proliferation of MDB-MA-231 cells was tested by CCK-8， the cell cycle was examed by flow cytometry， the migration and invasion of MDB-MA-231 cells were detected by Transwell chamber. Result： Compared with the control group and the miR-NC group， the expression level of miR-577 and the percentage of G0/G1 phase cells in the miR-577 group were increased， the expression levels of HOXA1 mRNA and protein， the proliferation activity of cells at 48 and 72 h， the percentage of cells in the S phase， the number of invaded cells and the number of migrated cells were decreased， the differences were statistical significance （P<0.05）. Compared with the miR-577 group and the miR-577+pcDNA group， HOXA1 mRNA and protein expression levels， proliferation activity of cells at 48 and 72 h， percentage of cells in S phase， number of invading cells and number of migrating cells in the miR-577+HOXA1 group were all increased， while percentage of cells in G0/G1 phase was decreased， the differences were statistical significance （P<0.05）. Conclusion： miR-577 can inhibit proliferation， invasion and migration of MDB-MA-231 cells by targeting HOXA1.

[Key words] miR-577 Breast cancer HOXA1 Proliferation Invasion Migration

First-authors address： The Central Hospital of Jiamusi City， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.10.004

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類廣泛分布于機體血液、組織和唾液中的內源性非編碼RNA，常被作為腫瘤早期診斷和預后不良的重要指標，也是腫瘤基因治療的潛在靶分子，其可通過堿基互補配對抑制翻譯或降解靶mRNA參與包括乳腺癌在內的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。miR-577是miRNAs中的重要成員，被證實在肝癌、結腸癌和膠質母細胞瘤等腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要的抑制作用[2-3]。Yin等[4]證實miR-577在乳腺癌組織中低表達，與腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴轉移等有關，可通過靶向Rab25抑制癌細胞上皮間質轉化和轉移;但miR-577在乳腺癌中的作用及機制并不完全清晰。同源盒A1（HOXA1）是同源盒（HOX）基因家族成員，被證實在乳腺癌中異常高表達，通過調控癌細胞增殖、侵襲和遷移等促進腫瘤進展[5]。有研究指出，miR-577可通過靶向調控HOXA1表示抑制肝癌細胞侵襲和遷移，但其是否可能通過靶向調控HOXA1影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展尚不清楚[6]。因此，本研究以乳腺癌MDB-MA-231細胞為研究對象，通過觀察miR-577與HOXA1的靶向關系，探討miR-577通過靶向調控HOXA1對MDB-MA-231細胞增殖、侵襲和遷移等影響，以期為miR-577用于乳腺癌的治療靶點提供一定的實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌MDB-MA-231細胞株購于美國ATCC，BCA蛋白濃度試劑盒購于上海碧云天公司，CCK-8試劑盒購于上海威奧生物公司，碘化丙啶購于北京索萊寶公司，Lipo2000購于美國Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，兔抗人HOXA1單克隆抗體購于美國Sigma公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體和羊抗鼠/兔IgG二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。ECL底物液購于美國Thermo公司，Transwell購于美國BD Biosciences公司，反轉錄和qPCR試劑盒購于大連寶生物公司，Dual luciferase assays試劑盒購于美國Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。pcDNA3.1-HOXA1過表達載體質粒由上海北諾生物公司設計完成。miR-577模擬物及其陰性對照購于廣州銳博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 MDB-MA-231細胞培養(yǎng)與轉染 實驗分組：對照組（未處理）、miR-NC組（轉染miR-577模擬物陰性對照）、miR-577組（轉染miR-577模擬物），miR-577+pcDNA組（轉染miR-577模擬物和pcDNA3.1質粒）和miR-577+HOXA1組（轉染miR-577模擬物和pcDNA3.1-HOXA1質粒）。

1.2.2 實時熒光定量PCR測定miR-577和HOXA1 mRNA的表達 取轉染后的MDB-MA-231細胞于EP管中，應用Trizol試劑提取細胞總RNA。將定量后的RNA作為模板，參照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。取稀釋10倍的cDNA 4 μL作為模板，并與100 μm的上下游引物各0.4 μL、SYBR Green qPCR Master Mix（2×）10 μL和ddH2O 5.2 μL混勻配成20 μL的PCR反應體系;并按照94 ℃、6 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，

共40個循環(huán)的反應條件行溶解曲線。程序完成后，以U6和GAPDH為內參，2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。miR-577引物序列（F：5-ACCGCGCGCGCGTAGATAAAATATTGG-3，R：5-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3），U6引物序列（F：5-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3，R：5-AAATATGGAACGCTTCACGA-3），HOXA1引物序列（F：5-TCCTGGAATACCCCATACTTAGCA-3，R：5-GCCGCCGCAACTGTTG-3）和GAPDH引物序列（F：5-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3，R：5-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3）。

1.2.3 Western blot測定HOXA1蛋白的表達 將收集到的MDB-MA-231細胞以磷酸緩沖液洗滌后，加入預冷的細胞裂解液抽取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白檢測試劑盒說明書對總蛋白的濃度進行定量。取50 μg蛋白樣品行12%SDS-PAGE電泳（120 V，

2 h）分離后，轉PVDF膜（250 mA，1.5 h）。轉入含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫作用1 h。將膜轉入封閉液稀釋工作濃度分別為1︰500和

1︰1 000的HOXA1抗體和GAPDH抗體，4 ℃下孵育過夜。再轉入封閉液稀釋1︰5 000的二抗常溫孵育2 h。將ECL工作液滴加到PVDF膜上，置于暗室內顯影、曝光。采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析HOXA1蛋白的表達水平。

1.2.4 CCK-8法測定MDB-MA-231細胞增殖情

況 采用胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的各組MDB-MA-231細胞，以每孔10 000個細胞密度接種至96孔細胞板上，每組設置5個平行孔。放入培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑反應4 h后，上機于450 nm波長處檢測各組細胞的光密度值。重復檢測3次。

1.2.5 流式細胞儀測定MDB-MA-231細胞的周期變化 以磷酸緩沖液（預冷）洗滌收集到的各組MDB-MA-231細胞后，預冷的70%乙醇固定細胞12 h。經磷酸緩沖液洗滌后，以碘化丙啶對細胞染色30 min，上機于488 nm處檢測各組MDB-MA-231細胞的周期變化。

1.2.6 Transwell小室測定MDB-MA-231細胞侵襲遷移情況 將轉染48 h后的各組MDB-MA-231細胞制成濃度為3 000個/mL的細胞懸液。取200 μL細胞液加入以基質膠包被或不包被的Transwell小室上室中，另取含胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL加入到小室下室中。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將小室取出，小心擦去上室內殘留的細胞，經4%多聚甲醛固定和0.5%結晶紫后，顯微鏡下隨機選取5個視野統(tǒng)計下室面的細胞數(shù)量，結果取均值。

1.2.7 熒光素酶報告基因實驗測定miR-577與HOXA1的關系 應用TargetScanHuman軟件預測到miR-577與HOXA1的3-UTR存在互補的核苷酸序列。構建突變型HOXA1-MUT和野生型HOXA1-WT的HOXA1 3-UTR熒光素酶報告載體，參照Lipo 2 000說明書行miR-577+HOXA1-MUT（共轉染miR-577模擬物和HOXA1-MUT）、miR-577+HOXA1-WT（共轉染miR-577模擬物和HOXA1-WT）、miR-NC+HOXA1-MUT（共轉染miR-577模擬物陰性對照和HOXA1-MUT）和miR-NC+HOXA1-WT（共轉染miR-577模擬物陰性對照和HOXA1-WT）四組共轉染，培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)48 h后，根據(jù)Dual luciferase assays試劑盒說明書測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組間多重比較采用SNK-q，多組間比較使用單因素方差分析;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染后MDB-MA-231細胞中miR-577和HOXA1的表達結果 與對照組、miR-NC組相比，miR-577組細胞中miR-577的表達水平均顯著升高，而HOXA1 mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）;與miR-577組、miR-577+pcDNA組比較，miR-577+HOXA1組細胞中miR-577水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而HOXA1 mRNA和蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）;而miR-NC組與對照組比較，miR-577組與miR-577+pcDNA組比較，miR-577表達、HOXA1 mRNA和蛋白表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1、表1。

2.2 miR-577與HOXA1的靶向關系 經TargetScanHuman軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-577與HOXA1 3 UTR存在互補核苷酸序列，見表2。

miR-NC+HOXA1-WT組熒光素酶活性值為（0.98±0.06），miR-577+HOXA1-WT組熒光素酶活性值為（0.39±0.03），miR-NC+HOXA1-MUT組熒光素酶活性值為（0.96±0.06），miR-577+HOXA1-MUT組熒光素酶活性值為（0.94±0.05）。與miR-NC+HOXA1-WT組相比，miR-577+HOXA1-WT組細胞的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）;而miR-NC+HOXA1-MUT組與miR-577+HOXA1-MUT組細胞熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;四組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=92.255，P=0.000）。

2.3 miR-577靶向調控HOXA1對MDB-MA-231細胞增殖的影響 miR-577組與對照組、miR-NC組相比，miR-577+HOXA1組與miR-577組、miR-577+pcDNA組相比，細胞在24 h作用時間下增殖活力差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在48、72 h

作用時間下，miR-577組的細胞增殖活力較對照組、miR-NC組均明顯減弱（P<0.05），miR-577+HOXA1組較miR-577組、miR-577+pcDNA組均顯著增強（P<0.05）;而miR-NC組與對照組相比，miR-577+pcDNA組與miR-577組相比，細胞增殖活力差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 miR-577靶向調控HOXA1對MDB-MA-231細胞周期的影響 miR-577組、miR-577+pcDNA組和miR-577+HOXA1組中G0/G1期細胞百分比均顯著高于對照組、miR-NC組，S期細胞百分比均顯著低于對照組、miR-NC組（P<0.05），G2/M期細胞百分比與對照組、miR-NC組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;miR-577+HOXA1組中G0/G1期細胞百分比較miR-577組、miR-577+pcDNA組顯著降低，S期細胞百分比較miR-577組、miR-577+pcDNA組顯著升高（P<0.05），G2/M期細胞百分比與miR-577組、miR-577+pcDNA組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;而對照組與miR-NC組、miR-577+pcDNA組與miR-577組G0/G1期、S期及G2/M期細胞百分比比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

2.5 miR-577靶向調控HOXA1對MDB-MA-231細胞侵襲和遷移的影響 與對照組、miR-NC組相比，而miR-577組侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)中均顯著減少（P<0.05）;與miR-577組、miR-577+pcDNA組相比，miR-577+HOXA1組中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)顯著增多（P<0.05）;而對照組與miR-NC組相比，miR-577組與miR-577+pcDNA組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

3 討論

乳腺癌是一種起源于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，多見于女性;近年來其發(fā)病率有升高和年輕化的趨勢，嚴重威脅著女性身體健康[7-9]。深入探討乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的有效的治療靶點對治療乳腺癌具有重要意義。近年來，miR-577在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸引起關注。在胃癌的研究中，何銀平等[10]證實，miR-577表達下調，且與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移等有關，上調其表達可通過下調β-catenin抑制癌細胞侵襲;Yu等[11]指出，miR-577過表達可通過靶向調控E2F3誘導癌細胞阻滯于G1期抑制胃癌細胞增殖。Wang等[12]在非小細胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，miR-577表達下調，上調其表達可通過調節(jié)Wnt2b介導的Wnt/β-catenin途徑抑制細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間充質轉化。在甲狀腺乳頭狀癌研究中，miR-577表達下降，其過表達可通過靶向調控Sphk2抑制癌細胞增殖、侵襲和遷移[13]。另外，miR-577在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的抑癌作用在肝癌、結腸癌和膠質瘤等中也得以證實[14-16]。本研究結果顯示，miR-577過表達可抑制乳腺癌MDB-MA-231增殖、侵襲、遷移并誘導細胞周期阻滯于G0/G1期，這提示，miR-577在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著與上述文獻相似的抑癌作用。

HOX基因家族是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切的轉錄調節(jié)因子，通過結合DNA調控相關基因表達，在細胞增殖、侵襲和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用[17-18]。HOXA1是HOX基因家族成員，其異常表達也往往影響著腫瘤的惡性進展。研究顯示，HOXA1在胃癌組織中的蛋白陽性表達率明顯升高，且其高表達的患者3年生存率明顯低于低表達患者，其促進胃癌發(fā)展進程[19];AFAP1-AS1在口腔鱗狀細胞癌中表達升高，敲低其表達可通過競爭性吸附miR-145進而抑制HOXA1的表達降低口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，AFAP1-AS1/miR-145/HOXA1軸為口腔鱗狀細胞癌的治療提供了潛在分子靶點[20];miR-100可通過靶向抑制HOXA1阻礙非細胞肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，miR-100/HOXA1軸在非細胞肺癌細胞中發(fā)揮抑癌基因作用[21];HOXA1在乳腺癌中異常高表達，在腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要的促進作用，敲低其表達可抑制乳腺癌的惡性進展[22]。猜測miR-577可能通過靶向HOXA1調控細胞增殖、侵襲和遷移進而影響乳腺癌的進展。為了探討miR-577抑制乳腺癌進展的分子機制，本研究通過生物信息學軟件預測到miR-577與HOXA1 3 UTR存在互補核苷酸序列，熒光素酶報告基因實驗證實，HOXA1是miR-577的一個潛在靶基因。同時，過表達HOXA1后miR-577對MDB-MA-231細胞增殖、侵襲和遷移的作用均明顯得到部分逆轉。這提示，miR-577可通過靶向調控HOXA1抑制MDB-MA-231細胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，HOXA1是miR-577的潛在靶基因，miR-577可通過靶向HOXA1抑制乳腺癌MDB-MA-231細胞增殖、遷移和侵襲。該結果可能為miR-577有望成為乳腺癌治療的候選基因提供重要的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2020-07-13） （本文編輯：劉蓉艷）