重癥顱腦損傷患者血清微小RNA-126、血管細(xì)胞黏附分子-1與遲發(fā)性顱內(nèi)血腫的關(guān)系

王 霞 劉 琴 周澤華 劉國平 孟光榮 孟小鵬

顱腦損傷(Craniocerebral Injury，CI)是神經(jīng)外科常見的一種創(chuàng)傷性疾病，重癥CI患者易發(fā)生遲發(fā)性顱內(nèi)血腫(Delayed Traumatic Intracranial Hematoma，DTIH)，對重癥CI患者的生命安全及生存質(zhì)量構(gòu)成極度威脅[1]。目前CI并發(fā)DTIH發(fā)生機制尚無定論，因此，尋找CI并發(fā)DTIH的相關(guān)因素，對CI并發(fā)DTIH具有一定臨床指導(dǎo)意義。有研究發(fā)現(xiàn)CI發(fā)生后，患者外周血中微小RNA(MicroRNA，miRNA)存在異常表達(dá)，且CI患者腦組織常伴有缺血缺氧或腦血管自身調(diào)節(jié)功能障礙，易引發(fā)DTIH[2,3]。微小RNA-126(MicroRNA-126，miR-126)在脊髓損傷后表達(dá)下調(diào)，可影響血管生成和炎癥反應(yīng)過程，進(jìn)而在脊髓損傷中發(fā)揮重要作用[4]。血管細(xì)胞黏附分子-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1,VCAM-1)與腦損傷繼發(fā)性腦損害的炎癥反應(yīng)有關(guān)，其在重度CI患者呈高表達(dá)，經(jīng)重組人促紅細(xì)胞生成素治療后，VCAM-1表達(dá)水平降低，VCAM-1有望成為重度CI患者康復(fù)指標(biāo)[5]。但miR-126和VCAM-1在重癥CI并發(fā)DTIH患者血清中的表達(dá)情況鮮有報道?；诖?，本研究初步探究miR-126、VCAM-1在CI患者、CI并發(fā)DTIH患者血清中的表達(dá)水平，分析兩者與CI患者并發(fā)DTIH的關(guān)系，以期為臨床早期防治CI并發(fā)DTIH提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組

選擇2015-03-2019-02本院收診的重癥CI患者289例，所有患者診斷均符合《現(xiàn)代顱腦損傷學(xué)》重癥CI的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]。參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行DTIH判定。依據(jù)是否發(fā)生DTIH，將患者分為DTIH組(102例)和非DTIH組(187例)；DTIH組中男62例，女40例；年齡31-62歲，平均年齡(46.64±10.81)歲。非DTIH組中男95例，女92例；年齡30-61歲，平均年齡(45.96±10.72)歲。選取本院同時間段內(nèi)135例體檢健康者為對照組，其中男69例，女66例；年齡30-63歲，平均年齡(46.25±10.77)歲。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)頭顱螺旋CT確診為重癥CI者或重癥CI并發(fā)DTIH；(2)所有患者入院進(jìn)行格拉斯哥昏迷評分(Glasgow Coma Scale，GCS)，GCS范圍為3-8分；(3)患者受傷至入院時間<24h；(4)所有受試者家屬自愿參與該項研究，且中途未退出。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重四肢、胸、腹損傷者；(2)合并近期手術(shù)、急/慢性感染、凝血功能障礙或免疫系統(tǒng)疾病者；(3)合并臟器功能衰竭、惡性腫瘤者；(4)近期接受心肺復(fù)蘇、抗凝治療者。

所有受試者家屬簽署知情同意書，且本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，研究所用方法符合《赫爾辛基宣言》。

1.3 主要試劑與方法

TRIzol試劑(貨號：GMS12279)購買于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(貨號：04655877001)購買于上海易匯生物科技有限公司，TaqMan Human MicroRNA Assay(貨號：4398965)購買于上海恪敏生物科技有限公司，Taqman Universal master mix(貨號：4347166)購買于上海賓智生物科技有限公司。引物購買于上?；瞪锛夹g(shù)有限公司，各引物序列見表1。紫外分光光度計(型號：DU-800)購買于上海智巖科學(xué)儀器有限公司，實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：SimpliAmp)購買于賽默飛世爾科技。

表1 引物序列

1.4 觀察指標(biāo)和方法

1.4.1一般臨床資料收集：收集患者性別、年齡，入院時收縮壓、舒張壓、血漿凝血酶原時間、GCS評分等臨床基本資料。

1.4.2qRT-PCR法檢測血清中miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達(dá)水平：收集所有研究對象入院空腹外周血6-7ml，室溫自然凝集30min，4℃、3 500g/min離心12min，收集上層血清，分裝于無RNA酶凍存管中，保存于-80℃冰箱中，待樣本集齊后集中檢測。檢測前取出凍存于-80℃冰箱中的血清樣本，冰上解凍，無菌環(huán)境下，根據(jù)TRIzol試劑說明書抽提所有血清樣本總RNA，測定RNA純度及濃度，并驗證RNA完整性。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，應(yīng)用Transcriptor One-Step RT-PCR Kit合成cDNA。按照TaqMan Human MicroRNA Assay、Taqman Universal master mix說明書流程將所得cDNA進(jìn)行擴增、PCR檢測血清miR-126、VCAM-1、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)相對表達(dá)水平。miR-126以U6為內(nèi)參，VCAM-1、VEGF、TNF-α以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組基本臨床指標(biāo)比較

對照組、非DTIH組和DTIH組三組間收縮壓、舒張壓差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，血漿凝血酶原時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與非DTIH組相比，DTIH組患者血漿凝血酶原時間明顯延長(P<0.01)，GCS評分明顯升高(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組基本資料比較

2.2 各組血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達(dá)水平比較

各組血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。與對照組相比，非DTIH組、DTIH組血清miR-126表達(dá)水平明顯降低，VCAM-1、VEGF、TNF-α表達(dá)水平均明顯升高(t均>4.793，P均<0.01)；與非DTIH組相比，DTIH組血清miR-126表達(dá)水平明顯降低，VCAM-1、VEGF、TNF-α表達(dá)水平均明顯升高(t均>11.528，P均<0.01)。詳見表3。

表3 各組血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達(dá)水平比較

2.3 重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α水平的相關(guān)性

Pearson法分析顯示，重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126表達(dá)水平與VEGF、TNF-α、VCAM-1均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.489、-0.375、-0.575，P均<0.01)，VCAM-1與VEGF、TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.360、0.418，P均<0.01)。

2.4 Logistic回歸分析重癥CI并發(fā)DTIH的影響因素

以重癥CI并發(fā)DTIH為因變量，以血漿凝血酶原時間、GCS評分、miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血漿凝血酶原時間、VCAM-1、VEGF、TNF-α為重癥CI并發(fā)DTIH的獨立危險因素(P<0.01)，miR-126為重癥CI并發(fā)DTIH的獨立保護因素(P<0.01)。詳見表4。

表4 重癥CI并發(fā)DTIH的Logistic回歸分析

3 討 論

CI可引發(fā)腦組織水腫、腦梗死、DTIH等繼發(fā)性CI，具有較高致殘率和致死率，嚴(yán)重威脅患者生活質(zhì)量及生命[8]。因此，尋找有效評估CI并發(fā)DTIH指標(biāo)，對CI患者進(jìn)行實時監(jiān)控，及時防治DTIH，可有效提高CI患者生存率。

miRNA可在機體代謝、個體發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、血管生成等生理病理過程中起重要生物調(diào)節(jié)作用[9]。miRNA在腦梗死、腦水腫、CI、DTIH等疾病中表達(dá)異常，可作為缺血缺氧腦損傷相關(guān)疾病的診治靶標(biāo)[10]。miR-191在急性缺血腦卒中表達(dá)異常，其可通過靶向血管內(nèi)皮鋅指蛋白1抑制血管生成，進(jìn)而在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，miR-191可作為診治急性缺血腦卒中的生物靶標(biāo)[11]。Di等[12]研究顯示，miR-425-5p在CI患者中異常表達(dá)，其可用于CI病情判斷及預(yù)后評估。以上研究證實，miRNA表達(dá)失調(diào)與腦損傷類疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-126與血管生成、血管炎癥有關(guān)，在腦出血患者血清中呈低水平，且其成員miR-126-3p可緩解腦出血后引起的血腦屏障破壞、神經(jīng)元損傷及腦水腫，miR-126及miR-126-3p在腦損傷疾病發(fā)展過程中起重要作用[13]。miR-126可促進(jìn)血管重塑，減少纖維化，缺血性腦卒中患者miR-126表達(dá)下調(diào)，其miR-126與腦卒中發(fā)病關(guān)系密切[14]。本研究中DTIH組患者血清miR-126表達(dá)水平明顯低于非DTIH組和對照組，提示低miR-126水平可能參與并影響重癥CI并發(fā)DTIH的進(jìn)程。推測miR-126表達(dá)下降可能會加重患者血管纖維化和炎癥反應(yīng)，從而增加重癥CI并發(fā)DTIH的發(fā)病率，影響預(yù)后。VCAM-1是血清黏附分子，可介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，影響血管壁完整性及組織缺氧引發(fā)的炎癥反應(yīng)，VCAM-1在老年急性腦梗死患者中表達(dá)失調(diào)，與急性腦梗死發(fā)病有關(guān)[15]。局灶性腦缺血損傷患者VCAM-1表達(dá)水平升高，經(jīng)西洋參莖葉總皂苷治療后，其表達(dá)水平降低，炎癥和腦水腫減輕，提示VCAM-1可能在局灶性腦缺血損傷發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[16]。以上研究表明，VCAM-1可能與缺血性腦病炎癥反應(yīng)過程有關(guān)。本研究中DTIH組患者血清VCAM-1水平均明顯高于非DTIH組和對照組，提示高表達(dá)VCAM-1在重癥CI并發(fā)DTIH疾病發(fā)生發(fā)展中起一定作用，推測高表達(dá)VCAM-1可能會加劇患者炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響重癥CI并發(fā)DTIH的發(fā)展。

VEGF是具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性、誘導(dǎo)血管生成等生物學(xué)功能的多功能細(xì)胞因子，對顱內(nèi)血管內(nèi)膜損傷異常敏感，VEGF在發(fā)生創(chuàng)傷性腦損傷后異常表達(dá)，與腦損傷發(fā)展過程密切相關(guān)[17]。TNF-α是機體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，其在急性CI中表達(dá)升高，CI發(fā)生后TNF-α可能激活水通道蛋白4，引起嚴(yán)重腦水腫，使腦組織嚴(yán)重缺血缺氧，TNF-α有助于評估CI嚴(yán)重程度[18]。本研究顯示，DTIH組患者血清VEGF、TNF-α表達(dá)水平明顯高于非DTIH組和對照組，提示VEGF、TNF-α可能與重癥CI并發(fā)DTIH發(fā)展過程相關(guān)。其原因可能是VEGF具有改變血管通透性、影響內(nèi)皮細(xì)胞增長及血管新生的作用，而TNF-α可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，二者共同影響DTIH的發(fā)生和發(fā)展。

本研究中重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126表達(dá)水平與VEGF、TNF-α、VCAM-1均呈負(fù)相關(guān)，VCAM-1與VEGF、TNF-α均呈正相關(guān)，提示miR-126、VEGF、TNF-α與VCAM-1相互作用，從而共同影響重癥CI并發(fā)DTIH進(jìn)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)血漿凝血酶原時間、VCAM-1、VEGF、TNF-α是重癥CI并發(fā)DTIH的獨立危險因素，miR-126是重癥CI并發(fā)DTIH的獨立保護因素，提示血漿凝血酶原時間延長，VCAM-1、VEGF、TNF-α水平升高，miR-126水平降低，均可能增加重癥CI并發(fā)DTIH的幾率，實時監(jiān)測重癥CI患者血漿凝血酶原時間、miR-126、VEGF、TNF-α及VCAM-1水平，有助于早期評估重癥CI并發(fā)DTIH的幾率并及時控制疾病發(fā)展。

綜上所述，重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126低表達(dá)，VCAM-1高表達(dá)，miR-126、VCAM-1均可能是影響重癥CI并發(fā)DTIH的影響因素，兩者參與并影響重癥CI并發(fā)DTIH進(jìn)程。但本研究樣本量較少，實驗結(jié)果可能會出現(xiàn)偏倚，后續(xù)將擴大樣本量進(jìn)一步研究。

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