芬戈莫德預(yù)先給藥對(duì)急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺損傷的保護(hù)作用

汪 宇 付惠玲 陳 蕓

急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是一種以炎癥肺水腫、重度低氧血癥、彌漫性血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞損傷為主要特征的臨床綜合征[1]，雖然目前ARDS的治療方法及管理方式都得到了很大的提升，但其病死率依然很高，超過了40%[2]。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate，S1P)是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的天然溶血磷脂，在調(diào)控細(xì)胞遷移、凋亡，炎癥反應(yīng)及血管通透性等過程中均起到重要的作用[3]，芬戈莫德(Fingolimod，F(xiàn)TY720)是人工合成的一種鞘氨醇結(jié)構(gòu)類似物，在生物體內(nèi)可以激活S1P受體發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[4]。目前有研究發(fā)現(xiàn)FTY720預(yù)處理能夠緩解肢體缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷[5]，但FTY720預(yù)處理對(duì)ARDS肺損傷作用的相關(guān)研究鮮少報(bào)道。本次研究通過對(duì)ARDS大鼠模型給予FTY720預(yù)處理，旨在探討S1P受體在ARDS中的作用，為ARDS的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源

健康雄性SD大鼠30只，體重230-260g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院[許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0013]，所有SD大鼠均飼養(yǎng)在中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2014-0033]，培育室溫度20-25℃，濕度保持在65%-70%，進(jìn)行人工光照(12h/晝、12h/夜)，大鼠全天自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中均嚴(yán)格遵循“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器

FTY720(美國(guó)Selleck公司購(gòu)買，100mg，批號(hào)：S500207)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170309、20170114)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)170428、170524)；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)170312)；兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl2相關(guān)X蛋白(Bax)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-12(Caspase-12)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、GAPDH抗體(Abcam公司購(gòu)買)；i-STAT 300型血?dú)夥治鰞x(美國(guó)雅培公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；TDL-4臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Image Master VDS凝膠自動(dòng)成像儀(瑞典Pharmacia公司)；BX 51型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備處理

將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和FTY720預(yù)處理組，每組各10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，F(xiàn)TY720預(yù)處理組大鼠給予FTY720 3mg/kg灌胃，1次/天，持續(xù)7 天，其余組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。模型組和FTY720預(yù)處理組大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.05ml/kg油酸，30min后再次注射2.5mg/kg大腸埃希菌脂多糖構(gòu)建ARDS模型[6]，正常組大鼠注射等量生理鹽水。所有建模大鼠全部建模成功，6h后用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 樣本采集和處理

構(gòu)建模型后6h，利用i-STAT 300型便攜式血?dú)夥治鰞x進(jìn)行各組大鼠PaO2的測(cè)量；腹主動(dòng)脈采血4ml，離心，吸取血清，用于血清蛋白含量檢測(cè)；斷頭處死大鼠，開胸迅速取出心臟和肺，4℃生理鹽水沖洗后將左肺門結(jié)扎，將4℃生理鹽水從氣管導(dǎo)管處緩慢注入右肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，等待30s后吸出，每次注入量為2ml，注入后反復(fù)抽吸，連續(xù)灌洗3次后，收集5ml的支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)于離心管中，低溫2 000 rpm離心10min后取上清液于液氮中冰凍，保存于-80℃超低溫冰箱待測(cè)；取適量新鮮左上肺組織，剪碎后加入胰蛋白酶消化，過濾、離心后收集細(xì)胞懸液，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)；另取左下肺組織用10%甲醇固定后，進(jìn)行常規(guī)脫水、石臘包埋、切片，用于肺組織病理學(xué)檢測(cè)；另取50mg肺組織，加入500μl NaCl溶液，于冰上研磨成勻漿，低溫3 000rpm離心30min后，取上清保存于離心管中，放入液氮中迅速冷凍后保存于-80℃超低溫冰箱，用于凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)。

1.5 肺組織濕干重比值(Wet/dry Weight Ratio，W/D)計(jì)算

取左肺1/3部分切下，用溫生理鹽水沖洗干凈之后，用濾紙將肺組織表明液體吸干，天平稱重記錄濕重，之后放入60℃恒溫烘箱中72h至恒重后稱重記為干重，計(jì)算W/D值。

1.6 BALF及血清中蛋白含量檢測(cè)以及肺通透性指數(shù)(PPI)計(jì)算

根據(jù)BCA試劑盒中操作說(shuō)明，分別計(jì)算BALF及血清樣本中總蛋白含量，并計(jì)算PPI(BALF中總蛋白濃度/血清中總蛋白濃度)。

1.7 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理變化

取1.4中制備好的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟2次后，用從高到低的梯度乙醇透明，蘇木精染色5min，鹽酸分化15s，流水返藍(lán)15min，伊紅染色2min，再用從低到高的梯度乙醇脫色，二甲苯脫水透明后封片，利用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。參考文獻(xiàn)[7]中方法，每只大鼠選樣3張肺組織病理切片進(jìn)行觀察，每張切片選取10個(gè)視野，根據(jù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、肺泡出血程度、肺泡水腫程度、肺間質(zhì)水腫程度、肺不張程度及透明膜形成程度對(duì)肺損傷情況進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)項(xiàng)目4個(gè)程度，計(jì)0、1、2、3分，分?jǐn)?shù)越高，肺損傷越嚴(yán)重。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡情況

將1.4中制備好的細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×106個(gè)/ml，接種于6孔板中、400μl/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，1 000r/min離心5min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入5μl AnnexinV/FITC、10μl PI混合均勻后，室溫避光孵育15min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，Cell Quest軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡率(AI)。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.9 BALF中SOD、MDA、IL-1β、TNF-α水平測(cè)定

取1.4中制備的BALF，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒步驟處理后，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性、硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA水平，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平。

1.10 Western blot法檢測(cè)肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

取1.4中制備好的肺組織勻漿上清，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，密封2h，加入兔抗鼠Bax、Bcl-2、CHOP、Caspase-12、JNK、GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1h，TBST漂洗40min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶吸光度值比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠動(dòng)脈PaO2、肺組織W/D值、PPI比較

三組大鼠PaO2、W/D值、PPI水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與正常組大鼠相比，模型組大鼠PaO2降低，肺組織的W/D值、PPI升高(q均>10.645,P<0.01)，與模型組相比，F(xiàn)TY720預(yù)處理組大鼠PaO2升高，肺組織的W/D值、PPI降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q均>6.186,P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈PaO2、肺組織W/D值、PPI比較

2.2 各組大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)觀察及肺損傷評(píng)分

HE染色結(jié)果如圖1所示，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰可見，肺間質(zhì)無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡間隔嚴(yán)重增厚，且肺間質(zhì)有明顯出血和水腫，并伴隨有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有透明膜形成；FTY720預(yù)處理組損傷介于正常組和模型組之間。三組間肺損傷評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與正常組相比，模型組肺損傷評(píng)分升高，與模型組相比，F(xiàn)TY720預(yù)處理組肺損傷評(píng)分降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q均>12.226,P<0.01)。見表2。

注：黑色箭頭位置提示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

表2 各組大鼠肺損傷評(píng)分及細(xì)胞AI情況比較

2.3 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況

三組間肺組織細(xì)胞AI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組相比，模型組肺組織細(xì)胞AI升高，與模型組相比，F(xiàn)TY720預(yù)處理組肺組織細(xì)胞AI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q均>18.517,P<0.01)。見圖2，表2。

圖2 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.4 各組大鼠BALF中SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平比較

各組大鼠BALF中SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組相比，模型組BALF中MDA、IL-1β、TNF-α水平升高，SOD活性降低；與模型組相比，F(xiàn)TY720預(yù)處理組BALF中MDA、IL-1β、TNF-α水平降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q均>5.302,P<0.01)。見表3。

2.5 各組大鼠肺組織中Bax、Bcl-2、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表達(dá)水平

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：各組大鼠肺組織中Bax、Bcl-2、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組大鼠相比，模型組大鼠肺組織中Bax、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值顯著升高，

表3 各組BALF中SOD、MDA、IL-1β、TNF-α水平比較

Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，與模型組大鼠相比，F(xiàn)TY720預(yù)處理組大鼠肺組織中Bax、CHOP、Caspase-12、JNK蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。見圖3。

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

3 討 論

ARDS作為臨床較為常見的一種急性低氧性呼吸功能不全疾病，病死率極高，目前尚未完全闡明其具體的發(fā)病機(jī)制及病理生理過程，因此通過建立ARDS病理模型對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要[8]?！岸未驌簟蹦Ｐ褪悄壳拜^為理想的一種模擬人類ARDS過程的模型，油酸注射及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ARDS是主要的ARDS模型構(gòu)型方式：油酸注射導(dǎo)致肺血管通透性增加，從而引起肺水腫[9]；內(nèi)毒素誘導(dǎo)則主要是引起肺組織炎癥反應(yīng)[10]。本次研究通過油酸注射聯(lián)合大腸埃希菌脂多糖來(lái)構(gòu)建ARDS模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠PaO2顯著降低，同時(shí)W/D值、PPI顯著升高，BALF中MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，而SOD活性顯著降低，肺組織病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺間質(zhì)水腫、出血，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明油酸注射聯(lián)合大腸埃希菌脂多糖既可以對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成直接毒害作用，還會(huì)加重肺組織中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促使ARDS形成。FTY720是人工合成的一類S1P受體激動(dòng)劑，而S1P在細(xì)胞增殖、遷徙，細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放、血管生成及維持血管內(nèi)皮屏障過程中發(fā)揮著重要的作用[11]。對(duì)ARDS模型大鼠給予FTY720預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，與模型組比較其股動(dòng)脈血中PaO2顯著升高，BALF中MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著降低，而SOD活性顯著升高，同時(shí)W/D值、PPI也顯著降低，病理切片結(jié)果也顯示肺組織損傷情況要顯著降低，表明FTY720預(yù)處理可以保護(hù)ARDS引起的肺損傷。

ARDS會(huì)引起肺組織缺血、缺氧，引起大量氧自由基合成，這些因素均會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。CHOP和Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要作用元件，CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記分子，其表達(dá)水平升高后，能夠誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax合成，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2合成，Bax/Bcl-2比值升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]；Caspase-12作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑特有的前凋亡分子，當(dāng)機(jī)體發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，無(wú)活性pro-Caspase-12會(huì)迅速被激活，促進(jìn)下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達(dá)，從而誘導(dǎo)非線粒體依賴途徑的細(xì)胞凋亡[14]。JJNK信號(hào)途徑能夠被多種細(xì)胞外應(yīng)激原激活，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，當(dāng)機(jī)體組織或細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡時(shí)，TNF受體相關(guān)因子1會(huì)和活化的Ire1形成復(fù)合體，募集凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1激活JNK信號(hào)通路，促進(jìn)Bax表達(dá)，并破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的完整性，繼而引起細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，ARDS模型大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率顯著升高，且Bax、CHOP、Csapase-12、JKN蛋白表水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)TY720預(yù)處理后ARDS模型大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡率降低，且Bax、CHOP、Csapase-12、JKN蛋白表水平及Bax/Bcl-2比值均顯著減低，Bcl-2表達(dá)水平升高，提示FTY720可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程，降低肺血管通透性，緩解肺組的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，從而降低肺損傷。金立達(dá)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，用FTY720預(yù)處理能夠激動(dòng)S1P1型受體，減輕肺組織炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡減輕呼吸機(jī)引發(fā)的肺損傷，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，F(xiàn)TY720預(yù)處理能夠有效緩解ARDS引起的肺損傷，并可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程，降低肺血管通透性，緩解肺組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡來(lái)完成的。雖然本研究發(fā)現(xiàn)FTY720預(yù)處理對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有抑制作用，但FTY720是否能夠通過其它途徑來(lái)保護(hù)ARDS引起的肺損傷尚不清楚，有待深入研究。

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