黃芪甲苷通過RNF10-NF-κB途徑改善小鼠心梗后心室重構(gòu)的機(jī)制研究*

李 康 鞠洪君 蒲 鵬

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)發(fā)生時即伴有心室重構(gòu)的啟動[ 1，2]。心室重構(gòu)往往表現(xiàn)為部分心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡、自噬或者肥大增生。期間大量炎癥反應(yīng)、炎性介質(zhì)釋放，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)被激活，繼而出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)改變[3,4]。其部分本質(zhì)是強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[5]。因此，調(diào)控炎癥反應(yīng)可能有利于心室重構(gòu)的防治。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)環(huán)指蛋白10(RNF10)與心血管發(fā)育密切相關(guān)，參與了平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)改變[6,7]。而作為一條新證實(shí)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，RNF10-NF-κB軸更是調(diào)控了大量炎性因子的產(chǎn)生與釋放，可能影響心室重構(gòu)。因此，通過干預(yù)RNF10-NF-κB軸可能對心梗后心室重構(gòu)的防治具有重要價值。

黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ, AS)是中藥植物黃芪的主要活性成分[8]。其藥理作用廣泛，包括抗缺血、抗炎、抗心衰和抗腫瘤等作用[9]。研究證實(shí)在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)大鼠模型中，AS顯現(xiàn)出一定的抗重構(gòu)效應(yīng)[10]。但AS抗心梗后心室重構(gòu)效應(yīng)尚不清楚，且多數(shù)文獻(xiàn)并未闡明其具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。結(jié)合文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗，我們推測AS可能通過RNF10-NF-κB軸發(fā)揮抗炎效應(yīng)。因此，本研究擬闡明AS對小鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)是否有改善作用，并探討可能的作用機(jī)制及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，旨在為臨床藥物開發(fā)、改良提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑

AS源自成都瑞芬思生物科技有限公司(批號：rfs84687-452；純度：95%；200g/袋)。Trizol、cDNA合成試劑盒由Invitrogen公司提供。上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司為本試驗提供所需引物。

1.2實(shí)驗分組及AMI模型建立

60只雄性C57BL/6小鼠(10周齡，平均體重22-28g)購自山東省實(shí)驗動物中心[動物許可證號：SYXK(魯) 2019-0007]。所有小鼠根據(jù)飲食不同隨機(jī)分為4組：對照組(n=15)、模型組(n=15)、AS低劑量組(n=15)、AS高劑量組(n=15)。對照組與模型組小鼠接受標(biāo)準(zhǔn)飼料(AIN76A)飼養(yǎng)；AS低劑量組在標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加0.4‰AS(折合小鼠體重：40mg/kg)；AS高劑量組在標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加0.8‰AS(折合小鼠體重：80mg/kg)，AS添加劑量參考既往相應(yīng)文獻(xiàn)[11]。所有小鼠按上述相應(yīng)要求喂養(yǎng)2周后進(jìn)行如下處理：對照組：僅開胸，不結(jié)扎冠狀動脈；其余三組依據(jù)文獻(xiàn)建立AMI模型[12]：開胸+冠狀動脈結(jié)扎(結(jié)扎部位選取左心耳下緣約1.0-1.5mm處)。動物模型成功標(biāo)準(zhǔn)：冠脈結(jié)扎以下區(qū)域變白，出現(xiàn)節(jié)段性運(yùn)動障礙；結(jié)扎后心電圖提示持續(xù)ST 段抬高或出現(xiàn)寬大畸形的QRS 波。本實(shí)驗所有建模小鼠全部成功，之后所有小鼠按先前包含要求繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3小鼠生存狀況觀察

術(shù)后觀察所有小鼠存活情況，第1日每 2h觀察 1 次，后每日觀察2次，共計監(jiān)測2周。記錄建模后小鼠死亡情況，根據(jù)解剖明確死亡原因是否為心臟破裂(解剖顯微鏡下可見破裂口，心臟可見暗紅色凝血塊包裹或附著)，并計算心臟破裂發(fā)生率。

1.4小鼠心臟超聲檢測

模型建立后2周，采用超聲儀(美國惠普 Sonos 5500，15MHz高頻線陣探頭)經(jīng)胸檢查。采集參數(shù)包括：心率(HR)、左心室收縮期前壁厚度(Aws)、舒張期前壁厚度(Awd)、收縮期后壁厚度(Pws)、舒張期后壁厚度(Pwd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)及左心室短軸縮短率(FS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5Real-time PCR檢測心室重構(gòu)相關(guān)基因、炎性因子及RNF10-P65關(guān)鍵信號基因的表達(dá)

模型建立后第15天所有小鼠均脫臼處死。處死前禁食12h，處死后分離左心室，速凍于液氮后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱，用于后續(xù)分子生物學(xué)檢測。提取心室肌總RNA，測定純度并定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以GAPDH為內(nèi)參，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測各炎性因子mRNA水平。引物序列自Genebank中檢索，采用Primer Express5.0設(shè)計。引物序列見表1。各組反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性3.5min后，94℃變性35s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行40次循環(huán)，最后再71℃延伸10min，4℃冷卻終止反應(yīng)。所有實(shí)驗樣品均重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后，檢測各樣本的Ct值(7300 System SDS software軟件)，根據(jù)Ct值計算出各指標(biāo)各樣本mRNA含量的相對值。PCR反應(yīng)的特異性通過熔解曲線進(jìn)行判斷。

表1 各引物序列

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1AS未能降低心臟破裂風(fēng)險

由表2可知，成模14天后，對照組、模型組、AS低劑量組、AS高劑量心臟破裂率分別為0.00%，13.33%，6.67%，0.00%，組間未見明顯差異(χ2=3.86,P>0.05)。其中模型組小鼠死亡分別是術(shù)后第5天及第7天死亡，AS低劑量組小鼠死亡為術(shù)后第5天。死亡小鼠均經(jīng)尸檢驗證為心臟破裂。

表2 各組心臟破裂情況(n，%)

2.2AS減緩心梗后心室重構(gòu)進(jìn)展

各組心臟超聲檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相較對照組，模型組小鼠LVEDD、LVESD和HR增加，Awsth、Awdth、Pwsth及Pwdth降低，F(xiàn)S及LVEF減退(q均>15.62，P<0.01)。與模型組比較，AS高/低劑量組小鼠LVEDD、LVESD和HR降低，Awsth、Awdth、Pwsth及Pwdth升高，F(xiàn)S及LVEF增強(qiáng)(q均>4.50，P<0.05或P<0.01)，其中AS高劑量組在Awsth、Awdth、Pwsth及LVEF等指標(biāo)上較AS低劑量組改善更為明顯(q均>4.04，P<0.05)。見表3。

表3 AS改善了心梗后心室重構(gòu)

2.3AS對心室重構(gòu)相關(guān)基因的影響各組心室重構(gòu)相關(guān)基因水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠心臟組織MMP-2、MMP-9基因表達(dá)顯著升高(q均>21.02，P<0.01)，而TIMP-2表達(dá)下調(diào)(q均>29.90，P<0.01)。與模型組比較，AS低/高劑量組則明顯得到緩解(q均>6.53，P<0.05)，其中AS高劑量組對重構(gòu)相關(guān)基因的逆轉(zhuǎn)更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q均>10.21，P<0.05)。詳見表4。

表4 AS對心室重構(gòu)相關(guān)基因的影響

2.4AS對心肌炎性因子及RNF10-P65關(guān)鍵信號基因表達(dá)的影響

各組心肌炎性因子及RNF10-P65關(guān)鍵信號基因表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠的心肌炎癥基因[白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)]表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而P65表達(dá)上升(P<0.01)，關(guān)鍵因子RNF10表達(dá)顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，AS低劑量組和高劑量組炎性因子及P65水平顯著降低，RNF10水平升高(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組更為明顯(P<0.05)。見表5。

3 討 論

AMI發(fā)生后，即使血運(yùn)重建，患者后期心室重構(gòu)所導(dǎo)致的心力衰竭仍不容忽視[13,14]。在這一病理生理過程中，大量信號蛋白及功能蛋白不斷生成與降解。作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin Proteasome System，UPS)起到了重要的平衡作用[15]。特別是心肌受損時，心肌UPS系統(tǒng)明顯激活，調(diào)控大量信號蛋白的生成降解，直接影響心肌組織能量代謝、凋亡自噬、心肌間質(zhì)纖維化等[16]。RNF10是UPS 中一類重要的調(diào)控因子，廣泛表達(dá)于哺乳動物的各組織，且在不同種屬間高度保守[17]。既往研究證實(shí)RNF10參與了糖脂代謝紊亂及炎癥調(diào)控[18]。本課題組前期研究也證實(shí)了RNF10可以調(diào)控血管平滑肌的增殖與凋亡[6,7]。在心肌組織中，RNF10也能影響心肌細(xì)胞的炎癥與凋亡，而這一關(guān)鍵調(diào)控原件就是NF-κB(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。因此，我們提出RNF10-NF-κB軸是心血管發(fā)育的關(guān)鍵信號通路并擁有強(qiáng)大的抗炎抗凋亡作用，但如何激活尚不清楚。

表5 AS對炎癥因子及RNF10-P65信號基因表達(dá)的影響

作為黃芪的主要活性成分，AS已被證實(shí)具有廣泛的藥理學(xué)作用[9]。在心血管領(lǐng)域，已證明其能夠保護(hù)心肌細(xì)胞、抗缺血、抗心律失常、延緩動脈粥樣硬化、對抗左室肥厚等[19]，主要作用靶點(diǎn)為炎癥與凋亡的調(diào)控。但令人疑惑的是現(xiàn)有的抗炎機(jī)制不能完全解釋其作用，我們推測有其它抗炎機(jī)制參與其中。因此，本文觀察了AS對心室重構(gòu)的影響以及是否發(fā)揮調(diào)控RNF10-NF-κB通路及其下游炎性因子的作用。

本研究確實(shí)證明了AS不能降低心梗后心臟破裂發(fā)生率，但在心室重構(gòu)方面，AS的改善效應(yīng)的確很明顯，能顯著抑制心臟擴(kuò)大。分子生物學(xué)研究揭示其可能通過抑制RNF10-NF-κB途徑發(fā)揮強(qiáng)烈的抗炎作用，抑制了包括IL-6、TNF-α、VCAM-1等在內(nèi)的炎癥基因活化，進(jìn)而減輕了急性期心室水腫。持續(xù)的抗炎作用還減輕了MMP的激活，對后期心室擴(kuò)張及纖維化起到了阻滯作用，最終抑制了心室重構(gòu)。

該研究有幾點(diǎn)值得指出，(1)各組在死亡率方面沒有顯現(xiàn)出差異?？赡苁且驗闃颖玖枯^小，也有可能與早期AS干預(yù)時間不足相關(guān)；(2)80mg/kg AS在小鼠心室重構(gòu)的防治可能更具有有效性。相比低劑量組，盡管高劑量AS在心臟破裂發(fā)生率及心臟擴(kuò)大(LVEDD、LVESD變化不大)中未顯現(xiàn)出差異。但可以看到AS高劑量組大鼠Awsth、Awdth、Pwsth改善更為明顯，更強(qiáng)烈地抑制了炎性因子釋放及MMP活性，若增加樣本量及觀察時間或可觀察到更明顯的抗重構(gòu)效應(yīng)性；(3)本研究首次提出AS可能通過RNF10-NF-κB通路減少炎癥損害及MMP所致纖維化，進(jìn)而改善心梗后心室重構(gòu)。盡管既往研究認(rèn)為AS可抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)[8]，但其具體作用機(jī)制完全不同，有可能不同心室重構(gòu)條件下涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同，也有可能為多信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，尚需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)了AS減輕了AMI大鼠血清炎癥程度并降低了MMP水平，改善了心梗后的心室重構(gòu)。這一作用可能是通過調(diào)控RNF10-NF-κB這一關(guān)鍵信號通路，繼而減少炎性因子釋放及MMP所致纖維化而實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果將有助于后續(xù)藥物的研發(fā)及改良，最終為心梗后心室重構(gòu)患者提供新的藥物選擇。

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