亞細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體含量是否與肌纖維類型、飲食干預(yù)有關(guān)？

耿國強(qiáng)，梁祎珩，Rasmus Jensen，Joachim Nielsen，Niels ?rtenblad，邱俊強(qiáng)*

（1.北京體育大學(xué)，北京 100084；2.南丹麥大學(xué)，丹麥歐登塞，5230）

線粒體作為能為機(jī)體供給能源物質(zhì)并支持人體運(yùn)動功能的重要細(xì)胞器，在體育科學(xué)界始終受到廣泛的關(guān)注。有研究表明，線粒體含量是影響線粒體功能的重要因素（Groennebaek et al.，2020）。在電鏡觀察下，基于肌纖維肌節(jié)的結(jié)構(gòu)特性，線粒體在骨骼肌中并非均勻分布（Boncompagni et al.，2009；Elander et al.，1985；Nielsen et al.，2017）。根據(jù)所分布的不同區(qū)域劃分線粒體亞型的概念最早被Palmer等（1977）提出，他們從大鼠心肌中提取出兩種不同類型的線粒體，并證明了肌膜下線粒體對耐力訓(xùn)練具有一定的適應(yīng)性。在隨后的研究中，根據(jù)結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)上的差異，將位于肌細(xì)胞中不同特定區(qū)域的線粒體，稱為亞細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體，有兩種類型，分別為肌原纖維間線粒體（intermyofibrillar mitochondria，IMF線粒體）和肌膜下線粒體（subsarcolemmal mitochondria，SS線粒體）（Krieger et al.，1980；Takahashi et al.，1996）。近年來，大量研究證實(shí)，肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體不均勻分布具備功能表達(dá)特異性，例如，SS和IMF線粒體對蛋白質(zhì)合成和代謝水平的作用有明顯差異，且通過不同的通路進(jìn)行調(diào)控（Cogswell et al.，1993；Ferreira et al.，2010；Groennebaek et al.，2020）。但是，關(guān)于人體肌細(xì)胞特定區(qū)域線粒體的含量及其在快慢肌中分布特性的研究較少。雖然線粒體總含量的多少是區(qū)分Ⅰ/Ⅱ型肌纖維的直接證據(jù)之一（Ogata et al.，1985），但是使用光學(xué)顯微鏡量化線粒體含量以判定肌纖維類型的方法，實(shí)用性不強(qiáng)且時間和經(jīng)濟(jì)成本較高。有研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維的z線寬度與肌纖維類型有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，因此認(rèn)為其可能可以作為電子顯微鏡下有效預(yù)測肌纖維類型的指標(biāo)之一（Sj?str?m et al.，1982）。但是，時至今日仍然沒有足夠的數(shù)據(jù)證明z線寬度和特定區(qū)域線粒體含量的直接相關(guān)關(guān)系，因此并未被廣泛使用。

短期飲食干預(yù)可影響耐力運(yùn)動表現(xiàn)，相比混合飲食或高脂低碳水飲食干預(yù)，高糖膳食后具有更高肌糖原儲備的受試者進(jìn)行耐力運(yùn)動的力竭時間明顯更長（Bergstr?m et al.，1967；Jeukendrup，2011），提示肌糖原含量與運(yùn)動表現(xiàn)密切相關(guān)。作為肌糖原有氧氧化的主要代謝場所，線粒體被認(rèn)為是氧化磷酸化供能過程中最重要的細(xì)胞器之一。與線粒體在骨骼肌中的分布特點(diǎn)類似，研究已證實(shí)肌糖原在骨骼肌中也符合非均勻分布，即分布具有區(qū)域化特性，依據(jù)肌節(jié)結(jié)構(gòu)特性將肌糖原儲存于獨(dú)立的糖原“貯存池”（Han et al.，1992）。有研究在靜坐少動人群中證實(shí)了這一觀點(diǎn)，結(jié)果表明，SS肌糖原的儲存敏感度和優(yōu)先級都高于IMF區(qū)域肌糖原，糖原的儲存存在區(qū)域差異性（Nielsen et al.，2009）。也有研究報道了短期飲食干預(yù)的肌糖原含量儲存具有肌纖維類型和亞細(xì)胞區(qū)域化特異性，分布于肌纖維內(nèi)部的糖原儲備含量和中高強(qiáng)度耐力運(yùn)動表現(xiàn)有潛在的相關(guān)性（Fisher，2020）。隨著人體有氧運(yùn)動時間的累積，線粒體作為糖原有氧氧化的主要代謝場所，在肌糖原非線性的氧化供能過程中起到重要的調(diào)控作用（Irrcher et al.，2003）。而以耐力運(yùn)動中能源底物（糖原）與線粒體代謝為切入點(diǎn)，大量研究報道了能量代謝過程中的線粒體區(qū)域化特性，Chomentowski等（2011）的研究表明，兩種不同區(qū)域化分布的線粒體具有各自獨(dú)立的線粒體調(diào)控模式，IMF線粒體含量受胰島素活性的直接影響，而SS線粒體含量卻保持不變。還有研究報道，骨骼肌細(xì)胞中特定區(qū)域化線粒體的呼吸作用有明顯的差異，IMF線粒體第Ⅲ階段的呼吸作用水平是SS線粒體的2.3～2.8倍（Adhihetty et al.，2005）。然而，關(guān)于短期飲食干預(yù)對肌糖原的影響是否進(jìn)而對相應(yīng)區(qū)域的線粒體含量產(chǎn)生影響則尚未可知。因此，本研究在不同飲食干預(yù)下，嘗試探究不同運(yùn)動表現(xiàn)的差異是否與骨骼肌線粒體含量的區(qū)域化分布特性以及不同肌纖維類型有關(guān)，為特定區(qū)域化線粒體特性的后續(xù)研究提供更多的參考依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

招募11名無專業(yè)運(yùn)動經(jīng)歷的男性運(yùn)動愛好者作為研究對象（基本情況：年齡25±4歲，身高183±6 cm，體重77±10 kg，BMI23±2 kg/m2，體脂率14±3%，最大攝氧量4.54±0.58 L/min）。實(shí)驗(yàn)前，由實(shí)驗(yàn)人員告知受試者實(shí)驗(yàn)過程中可能存在的風(fēng)險、益處以及詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程和時間進(jìn)度，受試者知悉實(shí)驗(yàn)信息后簽署了知情同意書。本研究得到南丹麥健康研究倫理區(qū)域委員會（S-20170198）的批準(zhǔn)，并符合《赫爾辛基宣言》中所述的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 運(yùn)動測試方案

在實(shí)驗(yàn)正式開始兩周前，對所有受試者進(jìn)行基線測試。使用DXA雙能射線骨密度測試儀（Lunar Prodigy，GE Healthcare，丹麥邦比）對受試者體成分進(jìn)行測量。使用功率車遞增運(yùn)動負(fù)荷方案測定受試者的最大攝氧量（O2max），使用間接測熱法通過氣體代謝儀（AMIS Sport，Innovision Aps，Glamsbjerg，丹麥）采集氣體代謝數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)前使用16.0%O2和4.0%CO2的高精度兩組分氣體混合物進(jìn)行校準(zhǔn)，并使用3 L空氣注射器在低、中、高流速下對流量計(jì)（Hans Rudolph，Kansas美國密蘇里州市）進(jìn)行校準(zhǔn)。隨后依據(jù)O2max測試的結(jié)果，確定受試者在測試周進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動強(qiáng)度，為75%O2max功率自行車強(qiáng)度（Hvid et al.，2013；Loon et al.，2004）。

正式實(shí)驗(yàn)包括3次耐力力竭測試，每2次測試需間隔3天，間隔期間進(jìn)行不同的短期飲食干預(yù)。受試者在實(shí)驗(yàn)室完成75%O2max恒定強(qiáng)度的功率自行車力竭測試。恒定負(fù)荷運(yùn)動期間，當(dāng)受試者的運(yùn)動強(qiáng)度在5 min內(nèi)連續(xù)兩次低于既定強(qiáng)度（75%O2max強(qiáng)度）的90%，或者未能在30 s內(nèi)恢復(fù)到既定運(yùn)動強(qiáng)度時，則認(rèn)為受試者達(dá)到力竭無法繼續(xù)運(yùn)動，即刻停止實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行肌肉活檢。

在每次耐力力竭測試開始前，實(shí)驗(yàn)人員需在每位受試者下肢的股外側(cè)肌部位采集肌肉活檢樣本，隨后開始運(yùn)動，運(yùn)動中每隔60 min在相同的部位取肌肉活檢，直至力竭，力竭后即刻再取一次肌肉活檢。由于3種不同飲食干預(yù)下的測試平均力竭時間并不一致，因此，3次測試（依次為混合飲食干預(yù)、高脂肪＋高蛋白質(zhì)飲食干預(yù)和高碳水化合物飲食干預(yù)）分別采集3條、2條、4條肌肉纖維，每個受試者共取9個肌肉活檢位點(diǎn)。

1.3 飲食干預(yù)方案

為了探究不同的短期飲食干預(yù)是否會影響骨骼肌線粒體含量，本研究采用了由Bergstr?m等（1967）設(shè)計(jì)的測試方案，該方案被認(rèn)為是經(jīng)典的飲食和耐力運(yùn)動干預(yù)方案，所有受試者在完成3次不同的短期飲食干預(yù)（3天）后進(jìn)行耐力力竭測試（圖1）。在實(shí)驗(yàn)周開始前，所有受試者可進(jìn)行自選混合飲食（self-chosen mix-diet），在第一個測試日前一天（周一）受試者進(jìn)行為期一天的給定混合飲食干預(yù)（1 400 kcal碳水化合物＋850 kcal蛋白質(zhì)＋550 kcal脂肪），并于周二進(jìn)行耐力力竭測試。在第1次測試結(jié)束后，飲食干預(yù)方案為3天高脂肪＋高蛋白質(zhì)飲食（1 500 kcal脂肪＋1 300 kcal蛋白質(zhì)），直至第2測試日（周五）。測試結(jié)束后飲食干預(yù)方案為3天高碳水化合物飲食（2 300 kcal碳水化合物＋500 kcal蛋白質(zhì)），直至第3測試日（下周一）。上述飲食方案除自由混合飲食外，其他所有方案均由實(shí)驗(yàn)人員提供所需的食材和食譜，且受試者須嚴(yán)格按照食譜要求在家烹飪和進(jìn)食。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1.Experimental Protocol

1.4 肌纖維類型挑選方法

活檢的每條肌肉中提取10條肌纖維，并以肌纖維的z線寬度為肌纖維類型的鑒別指標(biāo)。為了定義兩種主要的肌纖維類型（Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維），只挑選出明顯的Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維各3條，為了對比兩種類型肌纖維的線粒體含量的明顯差異，剔除了Ⅱa型肌纖維的線粒體含量干擾因素，研究人員在10條肌纖維中挑選z線寬度最粗的3條肌纖維并定義為Ⅰ型肌纖維，相反的z線寬度最細(xì)的3條被定義為Ⅱ型肌纖維（Nielsen et al.，2010）。由于在測試過程中，有兩名受試者分別只接受了8次肌肉活檢，實(shí)驗(yàn)人員依據(jù)上述方法共提取出582條肌纖維用以之后的電鏡切片材料。

1.5 電鏡切片制作

將肌肉活檢取出的肌肉樣本用2.5%戊二醛在0.1 M、pH 7.3的二甲胂酸鈉緩沖液中固定24 h，隨后繼續(xù)在0.1 M、pH 7.3的二甲胂酸鈉緩沖液中沖洗4次。沖洗后，將纖維樣本用1%四氧化鋨和1.5%亞鐵氰化鉀在4℃、0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液中再固定90 min，之后繼續(xù)在4℃、0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液中沖洗2次。之后通過一系列分級的4℃～20℃酒精脫水，和20℃氧化丙烯和環(huán)氧樹脂分級混合物的浸潤后，包埋在100%、30℃環(huán)氧樹脂下。上述工序處理之后，使用切片機(jī)（Ultracut UCT超薄切片機(jī)，萊卡微觀系統(tǒng)，德國）將肌纖維樣本切成3個深度（相隔150 μm）的60 nm超薄切片，并與乙酸鈾酰和檸檬酸鉛對比。最后在預(yù)先校準(zhǔn)過的CM100透射電子顯微鏡（飛利浦，荷蘭）和Olympus Veleta鏡頭（Olympus圖像軟件，德國）下檢查切片并拍攝照片。將制備好的切片放大13 500倍，并以隨機(jī)系統(tǒng)化的原則分別拍攝12張IMF區(qū)域的圖片和12張SS區(qū)域的圖片（圖2）。

圖2 肌纖維電鏡切片示意圖Figure 2.The Schematic Diagram of Fiber Sections with TSM

1.6 體視學(xué)方法

在形態(tài)學(xué)和線粒體含量的檢測階段為雙盲操作。2名研究人員使用標(biāo)準(zhǔn)的體視學(xué)方法盲審計(jì)算亞細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體體積密度（圖3）。2名研究人員對不同組別下電鏡切片的分析工作量是相同的。使用點(diǎn)計(jì)數(shù)法（Gundersen et al.，1988）測量所有線粒體的體積密度（volume density，VV），公式為VV=AA，AA是通過點(diǎn)計(jì)數(shù)法測量出的線粒體面積分?jǐn)?shù)，點(diǎn)計(jì)數(shù)網(wǎng)格尺寸為60 nm×60 nm。由于線粒體所在區(qū)域不同，IMF線粒體含量表達(dá)為相應(yīng)肌原纖維的體積分?jǐn)?shù)的形式（單位μ3·μ-3），SS線粒體含量表達(dá)為線粒體體積除以肌纖維表面積的形式（單位μ3·μ-2）；總線粒體的體積密度根據(jù)上述兩種類型線粒體含量重新計(jì)算得出，遵循公式總線粒體（μm3·μm-3）= IMF線粒體（μm3·μm-3）＋ SS線粒體（μm3·μm-2）/20，公式中 SS線粒體含量做次分?jǐn)?shù)運(yùn)算得出相應(yīng)的體積密度數(shù)值，根據(jù)前人研究，理想假設(shè)肌纖維是半徑為40 μm的圓柱體（Nielsen et al.，2010）。

圖3 體視學(xué)方法標(biāo)記線粒體示意圖Figure 3.The Schematic Diagram of Counting Mitochondria by Using Stereological Method

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)通過了正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。線粒體含量與z線寬度的相關(guān)關(guān)系采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)的方法處理，皮爾遜相關(guān)系數(shù)R取值-1到＋1，絕對值越大表示相關(guān)程度越大。使用單因素方差分析的方法測試3種不同短期飲食干預(yù)下耐力力竭測試的運(yùn)動表現(xiàn)的差異性。使用混合效應(yīng)模型分析交互作用和主效應(yīng)來比較肌纖維線粒體含量在不同類型肌纖維和不同短期飲食干預(yù)下的差異，其中肌纖維類型和飲食干預(yù)類型為固定因素，受試者基礎(chǔ)信息作為隨機(jī)因素。首先確定兩個固定變量的交互作用，判定兩者是否存在互相之間的影響。若兩變量存在交互作用，則通過簡單效應(yīng)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果；如無交互作用，則直接檢驗(yàn)主效應(yīng)結(jié)果。P＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 不同飲食干預(yù)下耐力測試力竭時間的差異

根據(jù)表1可知，3種短期飲食干預(yù)下耐力測試力竭時間有顯著性差異，高碳水化合物飲食組的力竭時間相比其他兩組顯著更長（P＜0.001）。

表1 3種飲食干預(yù)下耐力測試力竭時間Table 1 Exhaustion Time of Endurance Tests under 3 Different Diets

2.2 亞細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體和z線寬度的相關(guān)性研究

根據(jù)表2可知，IMF、SS和總線粒體含量都和其對應(yīng)的z線寬度具有顯著中等正相關(guān)性（P＜0.001，RTotal=0.44，RIMF=0.42，RSS=0.37，圖 4）。

圖4 線粒體含量和z線寬度的皮爾遜相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Figure 4.The Pearson’s Correlation Results between the Mitochondrial Contents and z-line Width

表2 不同類型特定亞細(xì)胞定位的線粒體含量和其z線寬度的相關(guān)性Table 2 The Correlation between the Subcellular Localization Specific Mitochondrial Contents and z-line Width

2.3 不同肌纖維類型和飲食干預(yù)下線粒體含量的差異

結(jié)果顯示，不同類型肌纖維所含線粒體含量有明顯差異，Ⅰ型肌纖維的總線粒體IMF和SS線粒體含量均非常顯著地高于Ⅱ型肌纖維（P＜0.001，圖5）。相較于對應(yīng)的Ⅱ型肌纖維，Ⅰ型肌纖維的平均總線粒體含量高47%；平均IMF線粒體含量，Ⅰ型肌纖維比Ⅱ型肌纖維高41%；平均SS線粒體含量，Ⅰ型肌纖維比Ⅱ型肌纖維高67%。此外，對肌纖維類型和飲食干預(yù)這兩個組間變量來說，不存在顯著性交互作用（P＞0.05），故可以直接比較主效應(yīng)。無論哪種類型的線粒體（總線粒體、IMF線粒體、SS線粒體），Ⅰ型肌纖維的線粒體含量都非常顯著地多于Ⅱ型肌纖維（P＜0.001）。而且，任何一種短期飲食干預(yù)之間都不存在線粒體含量的顯著性差異（P＞0.05）。由表3可知，在3種不同的飲食干預(yù)下，不同肌纖維類型間特定區(qū)域化線粒體含量的比較也有明顯差異，Ⅰ型肌纖維IMF線粒體含量和體積占比顯著高于Ⅱ型肌纖維（P＜0.001），Ⅰ型肌纖維SS線粒體含量和體積占比顯著高于Ⅱ型肌纖維（P＜0.001）；各飲食干預(yù)組之間的線粒體含量及肌纖維體積占比無明顯差異（P＞0.05）。

表3 3種短期飲食干預(yù)下Ⅰ型、Ⅱ型肌纖維中亞細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體含量均值Table 3 Subcellular Localization Specific Mitochondrial Contents（Mean±SD）in Type Ⅰ and Ⅱ Muscle Fibers under Different Diet Intervention

圖5 不同肌纖維類型和3種飲食干預(yù)的線粒體含量差異柱狀圖Figure 5.The Mitochondrial Contents in Three Different Diet Interventions

3 分析與討論

3.1 特定區(qū)域化線粒體含量與肌纖維類型

早期研究證實(shí)，Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維的結(jié)構(gòu)和代謝特性存在明顯差異（Hoppeler et al.，2003）。體育科學(xué)界基本達(dá)成了“Ⅰ型肌纖維主導(dǎo)有氧代謝”的共識（?rtenblad et al.，2018；Schiaffino et al.，2011）。據(jù)此，線粒體含量也被證實(shí)其與肌纖維類型的高度依賴性，即相比于Ⅱ型，Ⅰ型肌纖維中的線粒體總含量更多，但不同肌纖維類型中不同區(qū)域分布下的線粒體含量特征并不清楚。已有研究結(jié)果表明，性別、身體狀況等因素不會影響普通人群的線粒體總量，普通人群的肌纖維線粒體總量均隨著耐力運(yùn)動訓(xùn)練有所提升，且具有區(qū)域化特異性：相較IMF線粒體，SS線粒體含量對耐力運(yùn)動適應(yīng)的敏感度更高（Devries et al.，2013；Hoppeler et al.，1985）。關(guān)于不同肌纖維類型的線粒體含量對比，Howald等（1985）的研究顯示，普通人群的總線粒體的體積密度分?jǐn)?shù)Ⅰ型肌纖維約為6%，Ⅱ型肌纖維約為4.5%，但是此實(shí)驗(yàn)并沒有比較不同肌纖維類型下的區(qū)域化線粒體含量特性。本研究中，Ⅰ型肌纖維的總線粒體的體積密度分?jǐn)?shù)為8.7%，Ⅱ型的肌纖維總線粒體的體積密度分?jǐn)?shù)為5.9%，數(shù)值均高于上述研究中普通人群的相關(guān)指標(biāo)。由于本研究中受試者為耐力項(xiàng)目的業(yè)余愛好者，最大攝氧量水平均超過45 ml/（min·kg-1），他們的有氧能力較普通人群更好，這可能是本研究線粒體含量數(shù)值整體水平偏高的原因之一。本研究在此基礎(chǔ)上對不同肌纖維類型中特定區(qū)域化分布的線粒體含量進(jìn)行了對比，結(jié)果顯示，除了Ⅰ和Ⅱ型肌纖維總線粒體含量上的明顯差異外，不同亞細(xì)胞區(qū)域定位下（IMF，SS），Ⅰ型肌纖維的平均線粒體含量全部顯著高于Ⅱ型肌纖維的平均線粒體含量。本研究結(jié)果表明，Ⅰ型肌纖維的平均總線粒體含量比與Ⅱ型高47%；Ⅰ型肌纖維的平均IMF線粒體含量比Ⅱ型肌纖維高41%；而相比于Ⅱ型肌纖維的平均SS線粒體含量，Ⅰ型肌纖維高67%。這個比例的差異顯示SS線粒體含量對Ⅰ型肌纖維的依賴度更高，該研究結(jié)果與前人研究一致（Nielsen et al.，2010），再次驗(yàn)證SS線粒體對耐力訓(xùn)練的敏感性更高。

關(guān)于肌纖維類型的判定標(biāo)準(zhǔn)，所有人群不同類型肌纖維的z線寬度均呈現(xiàn)兩極分化（Prince et al.，1981），且z線寬度不易受任何外界干預(yù)或者是長期運(yùn)動訓(xùn)練的影響，是肌纖維超微結(jié)構(gòu)下最不具備可塑性特征的指標(biāo)之一，因此z線寬度被認(rèn)為是直觀判斷肌纖維類型的潛在指標(biāo)。Sj?str?m等（1982）據(jù)此思路量化了不同肌纖維類型下的z線寬度，研究結(jié)果顯示，Ⅰ型肌纖維z線的平均寬度最大，為125±11 nm；平均寬度最小的則是Ⅱ型肌纖維，Ⅱb肌纖維z線寬度均值為86±8 nm。此研究團(tuán)隊(duì)通過判別分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法證明，僅通過z線寬度判定肌纖維類型的準(zhǔn)備率高達(dá)83%，因此得出結(jié)論，z線寬度是判定骨骼肌纖維類型的較優(yōu)指標(biāo)之一。然而，使用z線寬度作為肌纖維類型判定的方法近年來仍然沒有被廣泛使用，該方法未被廣泛使用的一個重要原因在于，沒有足夠多或者數(shù)據(jù)量足夠多的研究作為數(shù)據(jù)支撐。近年來的研究指出，不同肌纖維類型中肌球蛋白ATP酶活性會影響z線寬度和肌纖維類型的關(guān)系（Yan et al.，2010）。部分研究根據(jù)肌球蛋白重鏈?zhǔn)湛s特性差異，通過肌纖維銀染分析的方法（Sj?str?m et al.，1982；Talmadge et al.，1993）進(jìn)行肌纖維類型判定，但操作復(fù)雜程度大大增加。本研究通過大數(shù)據(jù)量特定區(qū)域化線粒體含量和z線寬度的相關(guān)性分析，驗(yàn)證了z線寬度作為肌纖維類型判定依據(jù)的有效性。結(jié)果顯示，肌纖維特定區(qū)域化線粒體含量和其z線寬度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。這也為前人研究（Sj?str?m et al.，1982）中提到的使用z線寬度作為判定肌纖維類型的直接指標(biāo)，提供了更充足的證據(jù)支持。

3.2 短期不同飲食干預(yù)對肌纖維線粒體含量的影響

1967年，Bergstrom等（1967）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明，短期高碳水化合物飲食干預(yù)對比混合飲食或者高脂飲食，能明顯提高受試者耐力力竭測試運(yùn)動表現(xiàn)，力竭時間的差異與測試前的糖原儲備有高度相關(guān)性。本研究采用相似的實(shí)驗(yàn)方案，受試者在正式實(shí)驗(yàn)前兩周開始適應(yīng)混合飲食的基礎(chǔ)上，先后進(jìn)行為期3天的高脂肪＋高蛋白質(zhì)飲食以及高碳水化合物的飲食干預(yù)方案，并比較不同短期飲食干預(yù)下亞極量（標(biāo)準(zhǔn)75%O2max強(qiáng)度的運(yùn)動模型）運(yùn)動表現(xiàn)的差異。本研究結(jié)果表明，相比于其他兩種營養(yǎng)干預(yù)方案，3天高碳水化合物飲食干預(yù)下的亞極量運(yùn)動測試力竭時間顯著更長，且高脂脂肪+高蛋白質(zhì)飲食方案下的力竭時間在3種方案中最短，此實(shí)驗(yàn)方案直接印證了機(jī)體的肌糖原儲備對中高強(qiáng)度的運(yùn)動表現(xiàn)的增益作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動會引發(fā)肌纖維中肌糖原區(qū)域化的特異性表達(dá)。在耐力運(yùn)動后48 h內(nèi)，人體肌纖維中均呈現(xiàn)SS肌糖原含量消耗最少，但此區(qū)域的肌糖原后續(xù)恢復(fù)較慢的特征（Marchand et al.，2007）。后續(xù)研究顯示，短期飲食干預(yù)會造成不同區(qū)域下肌糖原的特異性表達(dá)，SS肌糖原對于碳水化合物的額外補(bǔ)充敏感性最強(qiáng)。在短期的高碳水化合物補(bǔ)充的條件下，肌糖原總量提升，且SS的肌糖原儲量相比分布于肌原纖維區(qū)域的肌糖原含量明顯更高，并顯示出更強(qiáng)的有氧運(yùn)動能力（Jensen et al.，2020）。與此相關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)是區(qū)域化線粒體含量也會隨之產(chǎn)生變化，作為機(jī)體向骨骼肌提供ATP的代謝通路中非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporter type 4，GLUT-4）在人體進(jìn)行中高強(qiáng)度耐力運(yùn)動時顯著增加，且在SS區(qū)域表達(dá)更明顯（Lauritzen et al.，2008）。而GLUT-4也會通過同一條代謝通路調(diào)節(jié)線粒體的特定表達(dá)，這種長期的運(yùn)動訓(xùn)練適應(yīng)會導(dǎo)致肌纖維中線粒體總量的增加（Holloszy，2011；Chomentowski et al.，2011）。但是上述提到的肌糖原特異性與耐力運(yùn)動表現(xiàn)的緊密聯(lián)系是否會引起不同區(qū)域分布的線粒體發(fā)生特定的變化，則鮮見報道。本研究據(jù)此思路，針對不同糖原儲備的短期飲食干預(yù)下的區(qū)域化線粒體含量進(jìn)行比較。

相比于其他兩種營養(yǎng)干預(yù)方案，3天高碳水化合物飲食干預(yù)下的亞極量運(yùn)動測試力竭時間顯著更長，且高脂肪+高蛋白質(zhì)方案下的力竭時間最短，此實(shí)驗(yàn)方案直接印證了機(jī)體的肌糖原儲備對中高強(qiáng)度的運(yùn)動表現(xiàn)的增益作用。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究（Jensen et al.，2020）使用相同的運(yùn)動模型證明，糖原的機(jī)體儲備以及長時間亞極量運(yùn)動中的糖原消耗均具有亞細(xì)胞區(qū)域化的特異性：在3天的不同飲食干預(yù)下，高糖膳食組的Ⅰ型肌纖維IMF肌糖原儲備顯著高于高脂低糖組或者混合飲食組，SS肌糖原含量則在3組之間無顯著性差異。而高糖膳食組Ⅱ型肌纖維的IMF肌糖原含量僅顯著高于高脂低糖組，其他各個組別之間則無顯著性差異。然而實(shí)驗(yàn)并未進(jìn)一步探究“糖原池”的結(jié)構(gòu)特異性是否會引起相應(yīng)的特定區(qū)域分布的線粒體含量的適應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，不同能源底物配比（高碳水化合物飲食或高脂肪+高蛋白質(zhì)飲食）的短期飲食干預(yù)下，骨骼肌細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體含量無明顯差異；3次不同的飲食干預(yù)下，人體肌纖維中均維持了相同的線粒體含量比例，且在Ⅰ、Ⅱ型肌纖維中均呈現(xiàn)IMF線粒體體積占比更多的情況。結(jié)果表明，短期飲食干預(yù)對亞極量耐力性力竭實(shí)驗(yàn)運(yùn)動表現(xiàn)的顯著影響與線粒體含量的區(qū)域化分布無關(guān)。大量研究證明，長期的耐力訓(xùn)練適應(yīng)會增加人體肌纖維的區(qū)域化線粒體含量，且SS區(qū)域線粒體含量的增加更加明顯（Bizeau et al.，1998；Nielsen et al.，2010）。因此，本研究并未發(fā)現(xiàn)線粒體含量顯著變化的原因可能是區(qū)域化線粒體含量的適應(yīng)性改變與長期的運(yùn)動訓(xùn)練關(guān)系更大，而短期的高碳水化合物飲食干預(yù)引發(fā)的運(yùn)動表現(xiàn)差異并非通過影響線粒體含量的區(qū)域化分布而實(shí)現(xiàn)。另一方面，本研究飲食干預(yù)時間較短，且目前鮮有關(guān)于長期高碳水化合物飲食干預(yù)對特定區(qū)域化線粒體含量的直接影響的實(shí)驗(yàn)。因此，關(guān)于特定區(qū)域分布的糖原和線粒體之間的特定通路對中高強(qiáng)度耐力項(xiàng)目的運(yùn)動訓(xùn)練指導(dǎo)意義，需要進(jìn)一步的研究探討和證實(shí)。

4 結(jié)論

Ⅰ型肌纖維中線粒體總量多于Ⅱ型肌纖維，且在肌細(xì)胞微觀特性視角下，亞細(xì)胞不同區(qū)域下分布的線粒體（IMF和SS線粒體），均呈現(xiàn)Ⅰ型肌纖維中的分布含量多于Ⅱ型肌纖維的狀態(tài)；不同肌纖維的總線粒體含量為z線寬度作為區(qū)分快慢肌的判斷方法提供了更直接的數(shù)據(jù)支撐；不同糖原儲備的短期飲食干預(yù)下長時間亞極量運(yùn)動至力竭時間有顯著性差異，但是該運(yùn)動表現(xiàn)的差異與亞細(xì)胞特定區(qū)域化線粒體含量無關(guān)。