彭啟華,王力剛,趙玉馳
(1.南華大學附屬邵陽醫(yī)院骨科, 湖南邵陽 422000; 2.南方科技大學鹽田醫(yī)院骨科,廣東深圳 518000)
骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨密度(bone mineral density,BMD)顯著降低和骨折風險增加為特征的人類常見骨代謝疾病,且隨著年齡增長發(fā)病率越明顯[1]。SOST蛋白(sclerostin)是由人類17q12-21染色體上SOST基因編碼的糖蛋白。肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)是重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Kramer等[2]發(fā)現(xiàn),敲除小鼠MEF2C基因會導致SOST表達下降,從而使骨量和骨密度增加。因此,MEF2C-SOST轉(zhuǎn)錄軸的發(fā)現(xiàn)對于骨代謝疾病的治療具有重要意義。慢病毒載體以其較高感染率和穩(wěn)定基因表達已成為實驗室常用轉(zhuǎn)基因載體[3]。肌細胞增強因子2C-反義鏈1(myocyte enhancer factors 2C-antisense RNA1, MEF2C-AS1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,基因位于5q14.3, 編碼于MEF2C基因的反義鏈上,不僅可以調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄本的表達水平,還可以反饋蛋白質(zhì)和基因組水平。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1與股骨頸密度顯著相關[4]。
課題組前期在細胞實驗中,發(fā)現(xiàn)lncRNA MEF2C-AS1可以促進成骨細胞分化成熟,對機體骨量增加可能存在積極作用[5]。因此,本實驗將構(gòu)建大鼠骨質(zhì)疏松動物模型,通過體內(nèi)注射MEF2C-AS1慢病毒載體后檢測骨組織形態(tài)計量學變化,進一步探討MEF2C-AS1對機體骨量的影響。
SD雌性大鼠46只,SPF級,體重180~220 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物公司;在湖南省藥物安全評價研究及動物實驗中心屏障環(huán)境C區(qū)飼養(yǎng)。動物使用得到動物實驗中心倫理委員會批準,并按照《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行。
2%戊巴比妥鈉購自德國Merck公司;青霉素購自華北制藥股份有限公司;ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)免疫生物科技公司;MEF2C、b-actin(兔抗)購自武漢愛博泰克生物技術公司;慢病毒載體MEF2C-AS1及空病毒載體購自湖南贏潤生物科技有限公司; 4%多聚甲醛固定液、裂解液、Western洗滌液、轉(zhuǎn)膜液均購自武漢谷歌生物科技公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司;Tanon4100全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能公司;ME2002E型電子天平購自日本島津公司;Micro-CT儀購自德國Bruker公司;LABOSPECT003全自動血液生化分析儀購自日本日立公司;Spectra Max i3x酶標儀購自美谷分子儀器有限公司。
SD大鼠46只,標準飼料、分籠飼養(yǎng),自由飲水,溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境相同,保持飼養(yǎng)室良好通風。大鼠適應一周后,按體重隨機分為假手組(SHAM)、去卵巢組(OVX),每組共23只。OVX組大鼠用2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)麻醉后,取側(cè)臥位于動物實驗手術臺上,兩側(cè)背部剪毛,蓋上洞巾,用碘酒、乙醇局部消毒術野皮膚,先逐層切開左側(cè)皮膚,分離肌肉,用鑷子輕輕提起脂肪團,露出與子宮角緊密相連的卵巢(呈粉紅色顆粒狀),組織鉗夾閉卵巢下輸卵管,結(jié)扎輸卵管并切除卵巢,余下組織送入腹腔,縫合肌肉和皮膚。另一側(cè)與之相同操作。SHAM組于相同部位切開皮膚、暴露卵巢,于卵巢組織周邊切除相等大小脂肪組織,切口逐層縫合。術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(8×104IU, 0.1 ml/只),觀察大鼠皮膚切口、飲食和活動狀態(tài)。
術后12周,每組各隨機剖殺7只大鼠,取右側(cè)股骨行MicroCT成像檢測以驗證模型。將假手術組剩下的16只大鼠隨機分成2組,每組各8只,分別為假手術對照組(SHAM)、假手術+MEF2C-AS1組(SHAM+MEF2C-AS1);將去卵巢組剩下的16只大鼠隨機分成2組,每組各8只,分別為去卵巢對照組(OVX)、去卵巢+MEF2C-AS1組(OVX+MEF2C-AS1)。SHAM+MEF2C-AS1組及OVX+MEF2C-AS1組取大鼠尾靜脈注射MEF2C-AS1慢病毒載體(5×107TU,100 μl/只),SHAM組及OVX組同樣部位注射等量空病毒載體。8周后行Western blot分析、ELISA分析和Micro-CT成像檢測。
大鼠剖殺時,行腹主動脈采血,離心后取上清液,將收集的血清樣本立即編號后放-80℃冰箱保存,用ELISA法檢測SOST蛋白水平,所有操作根據(jù)試劑盒說明進行。
大鼠剖殺后取左側(cè)股骨,加入少量液氮于研缽中研磨,加入適量裂解液提取蛋白,將樣本于-80℃冰箱儲存。取蛋白進行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下用5%脫脂乳在TBS封閉液中封閉1 h,與相應的一抗兔抗MEF2C抗體(1∶1 000)、兔b-actin抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜。次日,回收一抗,洗膜后,將二抗稀釋于TBS中,常溫孵育1 h,洗滌液洗膜3次,顯影。以b-actin作為內(nèi)參照,對曝光條帶進行蛋白定量分析。
大鼠剖殺后取右側(cè)股骨,仔細剔除周圍肌肉組織,放入4%多聚甲醛固定液中,分別編號后,置4℃冰箱保存以備Micro-CT成像系統(tǒng)檢測。造模12周及最后剖殺大鼠測量方法一致。測量指標包括:皮質(zhì)骨厚度(cortical bone thickness, Ct.Th)、骨體積(bone volume, BV)、骨體積分數(shù)(bone volume/ total volume, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)、組織密度(tissue mineral density, TMD)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)造模指數(shù)(structural modeling index, SMI)。
如表1所示,OVX組骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨體積、骨體積分數(shù)均低于SHAM組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中骨密度減少36.7%;而骨小梁分離度高于SHAM組,差異有統(tǒng)計學意義(如圖1,P<0.05)。結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、組織密度、皮質(zhì)骨厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHAM組的骨小梁厚度變薄,數(shù)量明顯減少(見圖2)。
表1 造模12周后,SHAM組與OVX組的骨微結(jié)構(gòu)的比較
圖1 SHAM組和OVX組的骨密度和骨微結(jié)構(gòu)比較(BMD為骨密度,TMD為組織密度)
A. SHAM組 B. OVX組
12周后OVX組大鼠骨小梁厚度變薄、數(shù)量明顯減少)
如表2所示,各組SOST蛋白相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進行兩兩間比較顯示,OVX組較SHAM組SOST蛋白相對表達量高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SHAM組與SHAM+MEF2C-AS1組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHAM+MEF2C-AS1組與OVX+MEF2C-AS1組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX+MEF2C-AS1組與OVX組比較,SOST蛋白相對表達量較去卵巢對照組減少(如圖3),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表2 各組MEP2C蛋白和SOST蛋白相對表達量比較
圖3 各組MEF2C蛋白和SOST蛋白相對表達量比較 (aa為OVX組與SHAM組比較, P<0.05; bb為OVX組
如表2所示,各組MEF2C蛋白相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步行兩組間比較顯示,OVX組較SHAM組MEF2C蛋白相對表達量高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SHAM組與SHAM+MEF2C-AS1組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHAM+MEF2C-AS1組與OVX+MEF2C-AS1組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX+MEF2C-AS1組與OVX組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組MEF2C蛋白的Western blot見圖4。
圖4 各組MEF2C蛋白的Western blot
表3 各組骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較
Micro-CT分析發(fā)現(xiàn),OVX組大鼠Tb.Th、Tb.N均低于SHAM組(P<0.05),OVX+MEF2C-AS1組大鼠Tb.Th、Tb.N均高于OVX組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結(jié)果表明MEF2C-AS1可以增加骨小梁數(shù)量,增加骨小梁之間連接。同時OVX+MEF2C-AS1組大鼠BV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BV/TV基本恢復到SHAM組水平。而四組SMI比較,OVX組較SHAM組大鼠SMI增加,骨小梁形狀從平板狀變?yōu)榘魻睿硎救ヂ殉矊φ战M骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)降解明顯。而用MEF2C-AS1干預后,SMI減少,骨小梁結(jié)構(gòu)改善,變成平板狀結(jié)構(gòu),見圖5,圖6。
圖5 各組骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較(aa為SHAM組與OVX組比較,P<0.05;bb為OVX組與OVX+MEF2C-AS1組比較,P<0.05)
A. SHAM組
B. OVX組
C. SHAM+MEF2C-AS1
D. OVX+MEF2C-AS1
去除大鼠雙側(cè)卵巢為復制骨質(zhì)疏松動物模型的常用方法。但對于鼠齡、品種、時間并無統(tǒng)一標準,有文獻報道6月齡雌性大鼠最為合適,造模時間持續(xù)6周~6月不等[6]。但國內(nèi)多數(shù)認為3~6月齡雌性大鼠骨骼生長最活躍,造模持續(xù)時間3~4月多見[7]。大鼠去勢以腹側(cè)和背側(cè)皮膚切口進行。然而,近年來對比研究發(fā)現(xiàn)腹部切口由于胃腸道容易受影響,且腹部與籠摩擦,易傷口感染或裂開,術后24 h大鼠死亡率高,而背側(cè)切口,因不需要縫合肌肉、操作簡便、創(chuàng)傷小、手術時間短、愈合快、傷口感染率低、造模安全系數(shù)高等優(yōu)勢而被推薦[6,8]。
本實驗選用5月齡SD大鼠,并采用背側(cè)雙切口去卵巢。術后12周,發(fā)現(xiàn)OVX組骨密度(BMD)、骨體積(BV)、骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)較SHAM組下降,骨小梁分離度明顯升高,且BMD減少約36.7%,研究表明去卵巢后BMD減少10%~20%表示造模成功[9]。因此,本研究首次證實5月齡SD大鼠通過切除雙側(cè)卵巢,造模12周也能成功復制骨質(zhì)疏松模型。并通過骨形態(tài)計量學分析發(fā)現(xiàn),骨小梁對雌激素變化反應比皮質(zhì)骨要快。研究表明女性在圍絕經(jīng)期前、后幾年骨量丟失最快,并以松質(zhì)骨為主,約占松質(zhì)骨丟失的20%~30%,這個過程稱為快速骨丟失階段,一般持續(xù)5~10年[10]。有趣的是,本實驗還發(fā)現(xiàn)OVX對骨小梁和皮質(zhì)骨之間變化矛盾結(jié)果,發(fā)現(xiàn)股骨松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)和BMD減少,而組織密度和皮質(zhì)骨厚度卻增加。有研究同樣也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果,Rocabado等[11]通過去卵巢觀察股骨骨組織形態(tài)學分析,發(fā)現(xiàn)遠端松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨變化不一致。分析可能與兩種不同雌激素受體(ERα和ERβ)差異性表達有關[12]。
反義長鏈非編碼RNA(anti-sense lncRNAs)是一種內(nèi)源性RNA(endo-siRNA), 通過與正義鏈相同的轉(zhuǎn)錄因子競爭結(jié)合來調(diào)控正義鏈的轉(zhuǎn)錄表達,并在參與反義轉(zhuǎn)錄過程中導致RNA polⅡ停滯,介導附件染色質(zhì)的組蛋白和DNA甲基化,從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄基因沉默作用[13]。因此,反義lncRNA參與的復雜生物學過程使學界對疾病發(fā)展和治療有了新的認識:即反義lncRNA可以通過堿基互補配對方式與正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合,提示如果某正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為某病致病基因產(chǎn)物,則可以利用該反義lncRNA通過抑制該疾病的致病基因功能,從而發(fā)揮治療作用。在NCBI Blast比對中發(fā)現(xiàn),MEF2C-AS1與MEF2C存在反向互補配對堿基序列[4], 提示lncRNA MEF2C-AS1可通過調(diào)控MEF2C基因發(fā)揮重要作用。
MEF2C是骨代謝中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。甲狀旁腺激素對SOST表達的抑制是由MEF2C介導的[14],而SOST基因編碼的SOST蛋白是成骨細胞骨形成的抑制劑。因此,可通過抑制SOST基因表達來刺激成骨細胞分化,從而達到促進骨合成作用。課題組在前期體外細胞實驗中,通過MEF2C-AS1過表達或沉默表達及進一步行拯救實驗來檢測MEF2C和SOST基因及蛋白表達,發(fā)現(xiàn)過表達MEF2C-AS1組的MEF2C和SOST表達水平低于對照組,而沉默MEF2C-AS1表達組高于對照組;然而在拯救實驗(同時過表達MEF2C-AS1和MEF2C基因)中檢測到原本受抑制的SOST表達有所恢復。因此,前期實驗發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1通過抑制MEF2C基因,從而抑制SOST基因和蛋白表達;并且在過表達MEF2C-AS1中檢測成骨分化早期標志物堿性磷酸酶活性明顯升高,表明能促進成骨細胞分化成熟[5],提示對促進機體骨量增加有積極作用。
本實驗在前期細胞實驗基礎上進行體內(nèi)實驗,首先復制骨質(zhì)疏松大鼠模型,通過注射MEF2C-AS1慢病毒載體后,用Western blot分析發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組MEF2C蛋白相對表達水平較OVX組降低,這與前期細胞實驗結(jié)果一致[5],進一步證實在體內(nèi)MEF2C-AS1對MEF2C表達同樣有抑制作用。本實驗還進一步通過ELISA分析,發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組SOST蛋白表達水平較OVX組明顯降低。結(jié)合前期促進成骨細胞活化結(jié)論[5],表明在大鼠體內(nèi),MEF2C-AS1通過下調(diào)MEF2C表達,抑制SOST基因編碼SOST蛋白表達,從而對成骨細胞分化起積極作用。同時本實驗還發(fā)現(xiàn)OVX組SOST蛋白較SHAM組升高,表明去卵巢誘導雌激素缺乏使SOST蛋白表達增加。
本實驗還做了骨形態(tài)計量學分析,以驗證MEF2C-AS1是否有促進骨形成作用,發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組大鼠BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD均高于去卵巢對照組,且BV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BV/TV恢復假手術對照組水平,表明MEF2C-AS1可促進骨形成、增加骨體積、改善骨小梁為主的骨微結(jié)構(gòu),從而增加骨密度。同時本實驗還意外發(fā)現(xiàn),與空載體對照組比較,SHAM+MEF2C-AS1組和OVX+MEF2C-AS1組骨密度都有所升高,表明MEF2C-AS1可能對正常大鼠骨丟失有積極保護作用,但結(jié)果差異不明顯,分析可能與干預時間短或不除外正常大鼠卵巢分泌雌激素與基因之間相互影響有關,仍需進一步研究證實。
SOST蛋白由骨細胞分泌,競爭性結(jié)合LRP5/6抑制成骨細胞中Wnt/b-catenin途徑,從而抑制成骨細胞分化[15]。Romosozumab是SOST蛋白單抗隆抗體,研究表明其既能抑制SOST蛋白表達,誘導成骨細胞分化,從而促進骨形成,又能在一定程度上減少骨吸收[16]。本研究通過lncRNA MEF2C-AS1抑制SOST蛋白表達,可能促進Wnt/b-catenin信號通路表達,從而促進成骨細胞分化、成熟發(fā)揮成骨作用。因此,本研究從抑制SOST蛋白表達的LncRAN方向為骨代謝疾病中促骨形成提供新的治療靶點。
隨著研究的深入,骨質(zhì)疏松癥被認為是復雜性、多基因疾病。在全基因組關聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)SOST中多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)和MEF2C rs1366594基因與OP及BMD之間的關聯(lián)[4,17]。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1基因上多個lncRNA SNP位點與股骨頸BMD顯著相關[4],提示LncRNA MEF2C-AS1/MEF2C/SOST通路在人類骨代謝疾病中的重要性。本研究首次在體內(nèi)證實lncRNA MEF2C-AS1通過下調(diào)MEF2C和SOST蛋白表達,來改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁結(jié)構(gòu),促進骨形成、增加骨體積和骨密度。因此,通過研究骨損傷與人類年齡相關骨代謝疾病的基因改變,可為以骨丟失為主疾病的合成代謝治療提供潛在基因治療靶點。但本實驗中未明確MEF2C-AS1在體內(nèi)對成骨細胞的成骨能力的影響,通過何種信號途徑來增加骨量的問題也仍需進一步研究證實。