• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA MEF2C-AS1對大鼠骨量的影響

    2021-06-01 09:37:52彭啟華王力剛趙玉馳
    中國現(xiàn)代手術學雜志 2021年1期
    關鍵詞:小梁成骨細胞骨密度

    彭啟華,王力剛,趙玉馳

    (1.南華大學附屬邵陽醫(yī)院骨科, 湖南邵陽 422000; 2.南方科技大學鹽田醫(yī)院骨科,廣東深圳 518000)

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨密度(bone mineral density,BMD)顯著降低和骨折風險增加為特征的人類常見骨代謝疾病,且隨著年齡增長發(fā)病率越明顯[1]。SOST蛋白(sclerostin)是由人類17q12-21染色體上SOST基因編碼的糖蛋白。肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)是重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Kramer等[2]發(fā)現(xiàn),敲除小鼠MEF2C基因會導致SOST表達下降,從而使骨量和骨密度增加。因此,MEF2C-SOST轉(zhuǎn)錄軸的發(fā)現(xiàn)對于骨代謝疾病的治療具有重要意義。慢病毒載體以其較高感染率和穩(wěn)定基因表達已成為實驗室常用轉(zhuǎn)基因載體[3]。肌細胞增強因子2C-反義鏈1(myocyte enhancer factors 2C-antisense RNA1, MEF2C-AS1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,基因位于5q14.3, 編碼于MEF2C基因的反義鏈上,不僅可以調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄本的表達水平,還可以反饋蛋白質(zhì)和基因組水平。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1與股骨頸密度顯著相關[4]。

    課題組前期在細胞實驗中,發(fā)現(xiàn)lncRNA MEF2C-AS1可以促進成骨細胞分化成熟,對機體骨量增加可能存在積極作用[5]。因此,本實驗將構(gòu)建大鼠骨質(zhì)疏松動物模型,通過體內(nèi)注射MEF2C-AS1慢病毒載體后檢測骨組織形態(tài)計量學變化,進一步探討MEF2C-AS1對機體骨量的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    SD雌性大鼠46只,SPF級,體重180~220 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物公司;在湖南省藥物安全評價研究及動物實驗中心屏障環(huán)境C區(qū)飼養(yǎng)。動物使用得到動物實驗中心倫理委員會批準,并按照《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行。

    1.2 主要試劑和儀器

    2%戊巴比妥鈉購自德國Merck公司;青霉素購自華北制藥股份有限公司;ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)免疫生物科技公司;MEF2C、b-actin(兔抗)購自武漢愛博泰克生物技術公司;慢病毒載體MEF2C-AS1及空病毒載體購自湖南贏潤生物科技有限公司; 4%多聚甲醛固定液、裂解液、Western洗滌液、轉(zhuǎn)膜液均購自武漢谷歌生物科技公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司;Tanon4100全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能公司;ME2002E型電子天平購自日本島津公司;Micro-CT儀購自德國Bruker公司;LABOSPECT003全自動血液生化分析儀購自日本日立公司;Spectra Max i3x酶標儀購自美谷分子儀器有限公司。

    1.3 動物建模

    SD大鼠46只,標準飼料、分籠飼養(yǎng),自由飲水,溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境相同,保持飼養(yǎng)室良好通風。大鼠適應一周后,按體重隨機分為假手組(SHAM)、去卵巢組(OVX),每組共23只。OVX組大鼠用2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)麻醉后,取側(cè)臥位于動物實驗手術臺上,兩側(cè)背部剪毛,蓋上洞巾,用碘酒、乙醇局部消毒術野皮膚,先逐層切開左側(cè)皮膚,分離肌肉,用鑷子輕輕提起脂肪團,露出與子宮角緊密相連的卵巢(呈粉紅色顆粒狀),組織鉗夾閉卵巢下輸卵管,結(jié)扎輸卵管并切除卵巢,余下組織送入腹腔,縫合肌肉和皮膚。另一側(cè)與之相同操作。SHAM組于相同部位切開皮膚、暴露卵巢,于卵巢組織周邊切除相等大小脂肪組織,切口逐層縫合。術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(8×104IU, 0.1 ml/只),觀察大鼠皮膚切口、飲食和活動狀態(tài)。

    1.4 動物處理及分組

    術后12周,每組各隨機剖殺7只大鼠,取右側(cè)股骨行MicroCT成像檢測以驗證模型。將假手術組剩下的16只大鼠隨機分成2組,每組各8只,分別為假手術對照組(SHAM)、假手術+MEF2C-AS1組(SHAM+MEF2C-AS1);將去卵巢組剩下的16只大鼠隨機分成2組,每組各8只,分別為去卵巢對照組(OVX)、去卵巢+MEF2C-AS1組(OVX+MEF2C-AS1)。SHAM+MEF2C-AS1組及OVX+MEF2C-AS1組取大鼠尾靜脈注射MEF2C-AS1慢病毒載體(5×107TU,100 μl/只),SHAM組及OVX組同樣部位注射等量空病毒載體。8周后行Western blot分析、ELISA分析和Micro-CT成像檢測。

    1.5 ELISA分析

    大鼠剖殺時,行腹主動脈采血,離心后取上清液,將收集的血清樣本立即編號后放-80℃冰箱保存,用ELISA法檢測SOST蛋白水平,所有操作根據(jù)試劑盒說明進行。

    1.6 Western blot分析

    大鼠剖殺后取左側(cè)股骨,加入少量液氮于研缽中研磨,加入適量裂解液提取蛋白,將樣本于-80℃冰箱儲存。取蛋白進行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下用5%脫脂乳在TBS封閉液中封閉1 h,與相應的一抗兔抗MEF2C抗體(1∶1 000)、兔b-actin抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜。次日,回收一抗,洗膜后,將二抗稀釋于TBS中,常溫孵育1 h,洗滌液洗膜3次,顯影。以b-actin作為內(nèi)參照,對曝光條帶進行蛋白定量分析。

    1.7 骨組織形態(tài)學分析

    大鼠剖殺后取右側(cè)股骨,仔細剔除周圍肌肉組織,放入4%多聚甲醛固定液中,分別編號后,置4℃冰箱保存以備Micro-CT成像系統(tǒng)檢測。造模12周及最后剖殺大鼠測量方法一致。測量指標包括:皮質(zhì)骨厚度(cortical bone thickness, Ct.Th)、骨體積(bone volume, BV)、骨體積分數(shù)(bone volume/ total volume, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)、組織密度(tissue mineral density, TMD)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)造模指數(shù)(structural modeling index, SMI)。

    1.8 統(tǒng)計學方法

    2 結(jié) 果

    2.1 大鼠骨質(zhì)疏松動物模型驗證

    如表1所示,OVX組骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨體積、骨體積分數(shù)均低于SHAM組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中骨密度減少36.7%;而骨小梁分離度高于SHAM組,差異有統(tǒng)計學意義(如圖1,P<0.05)。結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、組織密度、皮質(zhì)骨厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHAM組的骨小梁厚度變薄,數(shù)量明顯減少(見圖2)。

    表1 造模12周后,SHAM組與OVX組的骨微結(jié)構(gòu)的比較

    圖1 SHAM組和OVX組的骨密度和骨微結(jié)構(gòu)比較(BMD為骨密度,TMD為組織密度)

    A. SHAM組 B. OVX組

    12周后OVX組大鼠骨小梁厚度變薄、數(shù)量明顯減少)

    2.2 MEF2C-AS1對SOST蛋白的影響

    如表2所示,各組SOST蛋白相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進行兩兩間比較顯示,OVX組較SHAM組SOST蛋白相對表達量高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SHAM組與SHAM+MEF2C-AS1組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHAM+MEF2C-AS1組與OVX+MEF2C-AS1組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX+MEF2C-AS1組與OVX組比較,SOST蛋白相對表達量較去卵巢對照組減少(如圖3),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    表2 各組MEP2C蛋白和SOST蛋白相對表達量比較

    圖3 各組MEF2C蛋白和SOST蛋白相對表達量比較 (aa為OVX組與SHAM組比較, P<0.05; bb為OVX組

    2.3 MEF2C-AS1對MEF2C蛋白的影響

    如表2所示,各組MEF2C蛋白相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步行兩組間比較顯示,OVX組較SHAM組MEF2C蛋白相對表達量高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SHAM組與SHAM+MEF2C-AS1組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SHAM+MEF2C-AS1組與OVX+MEF2C-AS1組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX+MEF2C-AS1組與OVX組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組MEF2C蛋白的Western blot見圖4。

    圖4 各組MEF2C蛋白的Western blot

    表3 各組骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

    2.4 骨組織形態(tài)計量學分析

    Micro-CT分析發(fā)現(xiàn),OVX組大鼠Tb.Th、Tb.N均低于SHAM組(P<0.05),OVX+MEF2C-AS1組大鼠Tb.Th、Tb.N均高于OVX組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結(jié)果表明MEF2C-AS1可以增加骨小梁數(shù)量,增加骨小梁之間連接。同時OVX+MEF2C-AS1組大鼠BV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BV/TV基本恢復到SHAM組水平。而四組SMI比較,OVX組較SHAM組大鼠SMI增加,骨小梁形狀從平板狀變?yōu)榘魻睿硎救ヂ殉矊φ战M骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)降解明顯。而用MEF2C-AS1干預后,SMI減少,骨小梁結(jié)構(gòu)改善,變成平板狀結(jié)構(gòu),見圖5,圖6。

    圖5 各組骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較(aa為SHAM組與OVX組比較,P<0.05;bb為OVX組與OVX+MEF2C-AS1組比較,P<0.05)

    A. SHAM組

    B. OVX組

    C. SHAM+MEF2C-AS1

    D. OVX+MEF2C-AS1

    3 討 論

    去除大鼠雙側(cè)卵巢為復制骨質(zhì)疏松動物模型的常用方法。但對于鼠齡、品種、時間并無統(tǒng)一標準,有文獻報道6月齡雌性大鼠最為合適,造模時間持續(xù)6周~6月不等[6]。但國內(nèi)多數(shù)認為3~6月齡雌性大鼠骨骼生長最活躍,造模持續(xù)時間3~4月多見[7]。大鼠去勢以腹側(cè)和背側(cè)皮膚切口進行。然而,近年來對比研究發(fā)現(xiàn)腹部切口由于胃腸道容易受影響,且腹部與籠摩擦,易傷口感染或裂開,術后24 h大鼠死亡率高,而背側(cè)切口,因不需要縫合肌肉、操作簡便、創(chuàng)傷小、手術時間短、愈合快、傷口感染率低、造模安全系數(shù)高等優(yōu)勢而被推薦[6,8]。

    本實驗選用5月齡SD大鼠,并采用背側(cè)雙切口去卵巢。術后12周,發(fā)現(xiàn)OVX組骨密度(BMD)、骨體積(BV)、骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)較SHAM組下降,骨小梁分離度明顯升高,且BMD減少約36.7%,研究表明去卵巢后BMD減少10%~20%表示造模成功[9]。因此,本研究首次證實5月齡SD大鼠通過切除雙側(cè)卵巢,造模12周也能成功復制骨質(zhì)疏松模型。并通過骨形態(tài)計量學分析發(fā)現(xiàn),骨小梁對雌激素變化反應比皮質(zhì)骨要快。研究表明女性在圍絕經(jīng)期前、后幾年骨量丟失最快,并以松質(zhì)骨為主,約占松質(zhì)骨丟失的20%~30%,這個過程稱為快速骨丟失階段,一般持續(xù)5~10年[10]。有趣的是,本實驗還發(fā)現(xiàn)OVX對骨小梁和皮質(zhì)骨之間變化矛盾結(jié)果,發(fā)現(xiàn)股骨松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)和BMD減少,而組織密度和皮質(zhì)骨厚度卻增加。有研究同樣也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果,Rocabado等[11]通過去卵巢觀察股骨骨組織形態(tài)學分析,發(fā)現(xiàn)遠端松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨變化不一致。分析可能與兩種不同雌激素受體(ERα和ERβ)差異性表達有關[12]。

    反義長鏈非編碼RNA(anti-sense lncRNAs)是一種內(nèi)源性RNA(endo-siRNA), 通過與正義鏈相同的轉(zhuǎn)錄因子競爭結(jié)合來調(diào)控正義鏈的轉(zhuǎn)錄表達,并在參與反義轉(zhuǎn)錄過程中導致RNA polⅡ停滯,介導附件染色質(zhì)的組蛋白和DNA甲基化,從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄基因沉默作用[13]。因此,反義lncRNA參與的復雜生物學過程使學界對疾病發(fā)展和治療有了新的認識:即反義lncRNA可以通過堿基互補配對方式與正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合,提示如果某正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為某病致病基因產(chǎn)物,則可以利用該反義lncRNA通過抑制該疾病的致病基因功能,從而發(fā)揮治療作用。在NCBI Blast比對中發(fā)現(xiàn),MEF2C-AS1與MEF2C存在反向互補配對堿基序列[4], 提示lncRNA MEF2C-AS1可通過調(diào)控MEF2C基因發(fā)揮重要作用。

    MEF2C是骨代謝中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。甲狀旁腺激素對SOST表達的抑制是由MEF2C介導的[14],而SOST基因編碼的SOST蛋白是成骨細胞骨形成的抑制劑。因此,可通過抑制SOST基因表達來刺激成骨細胞分化,從而達到促進骨合成作用。課題組在前期體外細胞實驗中,通過MEF2C-AS1過表達或沉默表達及進一步行拯救實驗來檢測MEF2C和SOST基因及蛋白表達,發(fā)現(xiàn)過表達MEF2C-AS1組的MEF2C和SOST表達水平低于對照組,而沉默MEF2C-AS1表達組高于對照組;然而在拯救實驗(同時過表達MEF2C-AS1和MEF2C基因)中檢測到原本受抑制的SOST表達有所恢復。因此,前期實驗發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1通過抑制MEF2C基因,從而抑制SOST基因和蛋白表達;并且在過表達MEF2C-AS1中檢測成骨分化早期標志物堿性磷酸酶活性明顯升高,表明能促進成骨細胞分化成熟[5],提示對促進機體骨量增加有積極作用。

    本實驗在前期細胞實驗基礎上進行體內(nèi)實驗,首先復制骨質(zhì)疏松大鼠模型,通過注射MEF2C-AS1慢病毒載體后,用Western blot分析發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組MEF2C蛋白相對表達水平較OVX組降低,這與前期細胞實驗結(jié)果一致[5],進一步證實在體內(nèi)MEF2C-AS1對MEF2C表達同樣有抑制作用。本實驗還進一步通過ELISA分析,發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組SOST蛋白表達水平較OVX組明顯降低。結(jié)合前期促進成骨細胞活化結(jié)論[5],表明在大鼠體內(nèi),MEF2C-AS1通過下調(diào)MEF2C表達,抑制SOST基因編碼SOST蛋白表達,從而對成骨細胞分化起積極作用。同時本實驗還發(fā)現(xiàn)OVX組SOST蛋白較SHAM組升高,表明去卵巢誘導雌激素缺乏使SOST蛋白表達增加。

    本實驗還做了骨形態(tài)計量學分析,以驗證MEF2C-AS1是否有促進骨形成作用,發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組大鼠BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD均高于去卵巢對照組,且BV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BV/TV恢復假手術對照組水平,表明MEF2C-AS1可促進骨形成、增加骨體積、改善骨小梁為主的骨微結(jié)構(gòu),從而增加骨密度。同時本實驗還意外發(fā)現(xiàn),與空載體對照組比較,SHAM+MEF2C-AS1組和OVX+MEF2C-AS1組骨密度都有所升高,表明MEF2C-AS1可能對正常大鼠骨丟失有積極保護作用,但結(jié)果差異不明顯,分析可能與干預時間短或不除外正常大鼠卵巢分泌雌激素與基因之間相互影響有關,仍需進一步研究證實。

    SOST蛋白由骨細胞分泌,競爭性結(jié)合LRP5/6抑制成骨細胞中Wnt/b-catenin途徑,從而抑制成骨細胞分化[15]。Romosozumab是SOST蛋白單抗隆抗體,研究表明其既能抑制SOST蛋白表達,誘導成骨細胞分化,從而促進骨形成,又能在一定程度上減少骨吸收[16]。本研究通過lncRNA MEF2C-AS1抑制SOST蛋白表達,可能促進Wnt/b-catenin信號通路表達,從而促進成骨細胞分化、成熟發(fā)揮成骨作用。因此,本研究從抑制SOST蛋白表達的LncRAN方向為骨代謝疾病中促骨形成提供新的治療靶點。

    隨著研究的深入,骨質(zhì)疏松癥被認為是復雜性、多基因疾病。在全基因組關聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)SOST中多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)和MEF2C rs1366594基因與OP及BMD之間的關聯(lián)[4,17]。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1基因上多個lncRNA SNP位點與股骨頸BMD顯著相關[4],提示LncRNA MEF2C-AS1/MEF2C/SOST通路在人類骨代謝疾病中的重要性。本研究首次在體內(nèi)證實lncRNA MEF2C-AS1通過下調(diào)MEF2C和SOST蛋白表達,來改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁結(jié)構(gòu),促進骨形成、增加骨體積和骨密度。因此,通過研究骨損傷與人類年齡相關骨代謝疾病的基因改變,可為以骨丟失為主疾病的合成代謝治療提供潛在基因治療靶點。但本實驗中未明確MEF2C-AS1在體內(nèi)對成骨細胞的成骨能力的影響,通過何種信號途徑來增加骨量的問題也仍需進一步研究證實。

    猜你喜歡
    小梁成骨細胞骨密度
    預防骨質(zhì)疏松,運動提高骨密度
    中老年保健(2022年3期)2022-08-24 03:00:58
    天天喝牛奶,為什么骨密度還偏低
    小梁
    不要輕易給兒童做骨密度檢查
    補缺
    淫羊藿次苷Ⅱ通過p38MAPK調(diào)控成骨細胞護骨素表達的體外研究
    土家傳統(tǒng)藥刺老苞總皂苷對2O2誘導的MC3T3-E1成骨細胞損傷改善
    小梁切除術聯(lián)合絲裂霉素C治療青光眼臨床意義探析
    OSTEOSPACE型超聲骨密度儀故障案例解析
    Bim在激素誘導成骨細胞凋亡中的表達及意義
    在线看a的网站| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品久久久久久久久免| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日本wwww免费看| av国产精品久久久久影院| 99热全是精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久久久久国产电影| 午夜福利,免费看| 日韩人妻高清精品专区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 最近手机中文字幕大全| 成人美女网站在线观看视频| 日本免费在线观看一区| 五月玫瑰六月丁香| 国产淫片久久久久久久久| 涩涩av久久男人的天堂| 人体艺术视频欧美日本| 黑人高潮一二区| av国产久精品久网站免费入址| 免费看日本二区| 高清视频免费观看一区二区| 一区在线观看完整版| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩电影二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产男人的电影天堂91| 人妻少妇偷人精品九色| 久久毛片免费看一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 精品午夜福利在线看| videossex国产| 中文字幕免费在线视频6| 国产成人freesex在线| 久久99蜜桃精品久久| 伦理电影免费视频| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲国产日韩一区二区| 精品一区二区免费观看| 老司机亚洲免费影院| 久久久久久久亚洲中文字幕| 交换朋友夫妻互换小说| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产 精品1| 青春草视频在线免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 久久久久视频综合| 熟女人妻精品中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 综合色丁香网| 男人狂女人下面高潮的视频| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久久久久久国产电影| 国产熟女欧美一区二区| 九色成人免费人妻av| 在线 av 中文字幕| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久亚洲精品成人影院| 一级毛片电影观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 在线播放无遮挡| 国产黄频视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 美女主播在线视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 另类精品久久| 久久久久久久久久成人| www.色视频.com| 成人无遮挡网站| 伊人久久国产一区二区| 久久99一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品日本国产第一区| 男人添女人高潮全过程视频| 日日啪夜夜撸| 在线观看免费高清a一片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成人精品久久久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 免费黄色在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品成人在线| av卡一久久| av黄色大香蕉| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 秋霞伦理黄片| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲,一卡二卡三卡| 高清毛片免费看| h日本视频在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av国产久精品久网站免费入址| 日本91视频免费播放| 制服丝袜香蕉在线| 青青草视频在线视频观看| 国产精品久久久久久精品古装| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 五月伊人婷婷丁香| 日韩欧美精品免费久久| 国产又色又爽无遮挡免| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 亚洲,欧美,日韩| 最黄视频免费看| 亚洲成人手机| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色吧在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品久久久久久久电影| 日韩强制内射视频| 乱人伦中国视频| 午夜av观看不卡| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线看a的网站| 国产视频首页在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 日本黄大片高清| 一级a做视频免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| .国产精品久久| 精品午夜福利在线看| 午夜激情福利司机影院| 免费av不卡在线播放| 日韩中文字幕视频在线看片| 婷婷色av中文字幕| 免费观看在线日韩| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 两个人的视频大全免费| 国产精品女同一区二区软件| 免费黄频网站在线观看国产| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费观看性生交大片5| 国产深夜福利视频在线观看| 久久免费观看电影| 精品国产国语对白av| 亚洲第一av免费看| 日本色播在线视频| 女性被躁到高潮视频| 国产午夜精品一二区理论片| 精品一区二区免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲中文av在线| 一级毛片 在线播放| av女优亚洲男人天堂| kizo精华| 色吧在线观看| 秋霞在线观看毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 中国三级夫妇交换| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av | 亚洲性久久影院| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 男人爽女人下面视频在线观看| 在线播放无遮挡| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品.久久久| 一本色道久久久久久精品综合| 国产美女午夜福利| av福利片在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 高清毛片免费看| 永久免费av网站大全| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲不卡免费看| 我的老师免费观看完整版| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日本黄大片高清| 免费大片18禁| av专区在线播放| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 九九在线视频观看精品| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久久久久国产电影| 男女边摸边吃奶| 高清不卡的av网站| 欧美高清成人免费视频www| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品嫩草影院av在线观看| 人妻一区二区av| 成人国产av品久久久| 新久久久久国产一级毛片| 久久免费观看电影| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 成人国产麻豆网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 2018国产大陆天天弄谢| 高清在线视频一区二区三区| av免费观看日本| 老司机亚洲免费影院| 国产探花极品一区二区| 久久久精品94久久精品| 涩涩av久久男人的天堂| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 麻豆成人av视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产69精品久久久久777片| 最近中文字幕2019免费版| 青春草亚洲视频在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 只有这里有精品99| 精品人妻熟女av久视频| 免费观看在线日韩| 六月丁香七月| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品色激情综合| 欧美3d第一页| 国产成人精品无人区| 高清不卡的av网站| 高清视频免费观看一区二区| 丰满乱子伦码专区| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲性久久影院| 欧美精品国产亚洲| 精品亚洲成国产av| 亚洲欧洲国产日韩| 如何舔出高潮| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 尾随美女入室| 男女边吃奶边做爰视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日本色播在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 在线观看av片永久免费下载| 精品国产国语对白av| 午夜福利,免费看| 欧美精品国产亚洲| 国产色爽女视频免费观看| 深夜a级毛片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产av码专区亚洲av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 在线观看一区二区三区激情| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av国产av综合av卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 高清毛片免费看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 内射极品少妇av片p| 国产乱来视频区| 久久女婷五月综合色啪小说| 一级片'在线观看视频| 韩国高清视频一区二区三区| h日本视频在线播放| 亚洲美女视频黄频| 六月丁香七月| 国产一区有黄有色的免费视频| 激情五月婷婷亚洲| 男人爽女人下面视频在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 美女主播在线视频| 水蜜桃什么品种好| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲欧洲日产国产| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久97久久精品| 国产色婷婷99| 国产精品偷伦视频观看了| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 视频中文字幕在线观看| 91成人精品电影| 亚洲美女黄色视频免费看| 婷婷色综合www| kizo精华| 亚洲av男天堂| 51国产日韩欧美| 99re6热这里在线精品视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 水蜜桃什么品种好| 不卡视频在线观看欧美| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 老司机亚洲免费影院| 亚洲性久久影院| 精品国产一区二区久久| 久久久久网色| 在线播放无遮挡| 亚洲欧洲国产日韩| a 毛片基地| h日本视频在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 曰老女人黄片| 黄色一级大片看看| 美女国产视频在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美日韩在线观看h| 能在线免费看毛片的网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜av观看不卡| 一本大道久久a久久精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| av女优亚洲男人天堂| 国产探花极品一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品99久久99久久久不卡 | 激情五月婷婷亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| 国产有黄有色有爽视频| 免费av中文字幕在线| 中文字幕制服av| 日本免费在线观看一区| 国产精品一区二区在线不卡| 中文字幕制服av| 我的老师免费观看完整版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产深夜福利视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 嫩草影院新地址| 欧美97在线视频| av免费观看日本| 五月天丁香电影| 看免费成人av毛片| 午夜久久久在线观看| 久久久久久人妻| 男的添女的下面高潮视频| 黄色毛片三级朝国网站 | av在线app专区| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产黄色免费在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 久久狼人影院| 亚洲av成人精品一二三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲成人av在线免费| 丰满乱子伦码专区| 久热久热在线精品观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲情色 制服丝袜| 日本91视频免费播放| 日本与韩国留学比较| 免费观看性生交大片5| 九九爱精品视频在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久国产亚洲av麻豆专区| 老熟女久久久| 国产极品天堂在线| 好男人视频免费观看在线| 国产精品国产av在线观看| 久久久久久伊人网av| 99热全是精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 人人澡人人妻人| av在线老鸭窝| 91aial.com中文字幕在线观看| 老司机影院成人| 久久久久国产网址| 多毛熟女@视频| 老女人水多毛片| 日本色播在线视频| 最近2019中文字幕mv第一页| .国产精品久久| 嫩草影院入口| 免费观看在线日韩| 国产美女午夜福利| 中文欧美无线码| 极品教师在线视频| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲不卡免费看| 99热网站在线观看| 国产日韩欧美在线精品| av一本久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久av网站| 亚洲精品久久午夜乱码| 女性生殖器流出的白浆| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美精品一区二区大全| 麻豆乱淫一区二区| 观看av在线不卡| 三上悠亚av全集在线观看 | 国产色爽女视频免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜免费观看性视频| 国产视频首页在线观看| 国产在线视频一区二区| 美女福利国产在线| 精品熟女少妇av免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 天堂俺去俺来也www色官网| 日本色播在线视频| 高清在线视频一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 久久久欧美国产精品| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品.久久久| 亚洲国产最新在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 国产亚洲一区二区精品| 成人国产麻豆网| 日本91视频免费播放| 高清av免费在线| 另类亚洲欧美激情| 免费观看性生交大片5| 成人亚洲精品一区在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品人妻偷拍中文字幕| 婷婷色av中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 人妻系列 视频| 在线观看av片永久免费下载| 99热这里只有是精品在线观看| 69精品国产乱码久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 又大又黄又爽视频免费| 久久久a久久爽久久v久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 综合色丁香网| 色网站视频免费| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品午夜福利在线看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成人免费无遮挡视频| 人体艺术视频欧美日本| 最近的中文字幕免费完整| 国产极品天堂在线| 内地一区二区视频在线| 亚州av有码| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久久久精品精品| 大陆偷拍与自拍| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产黄色免费在线视频| 久久精品夜色国产| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产精品一区三区| av一本久久久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 天天操日日干夜夜撸| 99九九在线精品视频 | 女人精品久久久久毛片| 亚洲av综合色区一区| 久久99一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利,免费看| 国产精品免费大片| 精品久久久噜噜| 亚洲av男天堂| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲经典国产精华液单| 人人澡人人妻人| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人影院久久| 18+在线观看网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久久久久精品精品| 制服丝袜香蕉在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 美女国产视频在线观看| 久久久欧美国产精品| av卡一久久| 久久久久久久久久久久大奶| 中文字幕制服av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产伦在线观看视频一区| 能在线免费看毛片的网站| 一级,二级,三级黄色视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产毛片在线视频| 一级毛片我不卡| freevideosex欧美| 十八禁高潮呻吟视频 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美日韩视频精品一区| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线看a的网站| 嘟嘟电影网在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩成人伦理影院| 最近手机中文字幕大全| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 中文在线观看免费www的网站| 搡老乐熟女国产| h日本视频在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品国产一区二区久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人无遮挡网站| 男女边摸边吃奶| 国产精品蜜桃在线观看| 各种免费的搞黄视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 91精品伊人久久大香线蕉| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产免费又黄又爽又色| 我要看日韩黄色一级片| 黄色日韩在线| 亚洲国产色片| 国产精品福利在线免费观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久影院123| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久 成人 亚洲| 大香蕉久久网| 精华霜和精华液先用哪个| 一级毛片久久久久久久久女| tube8黄色片| 久久精品国产自在天天线| 免费黄色在线免费观看| 欧美精品一区二区大全| 性色avwww在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 日本av手机在线免费观看| 中文资源天堂在线| 男女国产视频网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 少妇精品久久久久久久| 亚州av有码| 日韩视频在线欧美| 2018国产大陆天天弄谢| 中文字幕久久专区| 精品午夜福利在线看| 中文字幕久久专区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产男人的电影天堂91| 国产av一区二区精品久久| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| av一本久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩强制内射视频| 国产成人精品福利久久| 99久久精品国产国产毛片| av播播在线观看一区| 日本91视频免费播放| 日韩成人av中文字幕在线观看| 中文天堂在线官网| 伊人久久国产一区二区| 色视频在线一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| av黄色大香蕉| 久久青草综合色| 亚洲精品视频女| 中文在线观看免费www的网站| 久久99热这里只频精品6学生| 在线观看av片永久免费下载| 新久久久久国产一级毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩人妻高清精品专区| 久久久国产欧美日韩av| 高清不卡的av网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产色婷婷99| 一区二区三区免费毛片| 亚洲天堂av无毛| a级一级毛片免费在线观看| av在线播放精品| 亚洲精品自拍成人| 在线观看一区二区三区激情| 男男h啪啪无遮挡| 街头女战士在线观看网站| 男女无遮挡免费网站观看| 六月丁香七月| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| 99久国产av精品国产电影|