高效液相色譜法測定飼料及寵物食品中?；撬?/h1>
2021-06-01 07:42:38侯林叢李賢陸靜單慧燕王彩杰蘭尊海
江西畜牧獸醫(yī)雜志 2021年2期
侯林叢，李賢，陸靜，單慧燕，王彩杰，蘭尊海*
（1.河南海瑞正檢測技術(shù)有限公司,河南鄭州450001;2.河南工業(yè)大學生物工程學院）
?；撬嵊址Qβ-氨基乙磺酸，最早由牛黃中分離出來，故得名。牛磺酸是一種含硫的非蛋白氨基酸，在動物體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成，但與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)。大量的畜禽研究表明，?；撬峋哂刑岣咝笄萆L、繁殖性能，促進機體腦組織發(fā)育，增強機體免疫力，提高神經(jīng)傳導。近年來，?；撬嵩谪i、雞、水產(chǎn)飼料及飼料添加劑和寵物食品中被廣泛應用，隨著人類對?；撬峁δ艿牟粩嗵剿骱驼J識，?；撬岬氖袌鰸摿Σ粩鄶U大。因此建立?；撬岬臏y定方法具有重要意義[1～3]。
目前?；撬岬臏y定方法主要有中和滴定法[4～5]、離子色譜法[6]、分光光度法[7～11]、電位滴定法[12～13]、高效液相色譜法[14～22]、薄層色譜法[23]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[24～27]、氨基酸自動分析儀法等[28～30]。其中分光光度法是傳統(tǒng)方法，操作復雜，所需試劑較多，結(jié)果有偏差故而不能廣泛應用，氨基酸自動分析儀法對儀器和人員的要求較高，在一定程度上增加了檢測的成本。本方法在大量實驗基礎(chǔ)上優(yōu)化了?；撬岬母咝б合嗌V法測定條件，以期為基層檢測機構(gòu)及飼料生產(chǎn)企業(yè)的檢驗人員提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測器購自沃特世科技（上海）有限公司；BSA224S分析天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；電熱恒溫干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司；超聲波購自昆山超聲儀器；離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；混勻器購自江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。
牛磺酸標準品（純度≥99%）購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、醋酸鈉（優(yōu)級純）、碳酸氫鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、N，N-二甲基甲酰胺（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）；2，4-二硝基氟苯(DNFB)；實驗用水為蒸餾水、高純水。
配合飼料、濃縮飼料、飼料添加劑、寵物食品等均為客戶委托檢驗的樣品。
1.2 實驗方法
1.2.1 溶液的配制。亞鐵氰化鉀溶液：150g/L；乙酸鋅溶液：30g/L；磷酸鹽緩沖液（pH=7）：稱取磷酸二氫鈉3.4 g于500 mL容量瓶中，加入0.1 moL/L氫氧化鈉145.5 mL，用水定容；醋酸鈉緩沖液（0.05 moL/L）：稱取3.4 g醋酸鈉，加入800 mL超純水，10 mL N，N-二甲基甲酰胺，用20%冰醋酸調(diào)pH至6.4，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，即得。
1.2.2 標準溶液的配制。?；撬針藴寿A備液（1mg/mL）：準確稱取100 mg牛磺酸標準品于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解定容，搖勻配制成標準貯備液，4℃密封避光保存，有效期6個月。?；撬針藴适褂靡海悍謩e移取一定體積的?；撬針藴寿A備液于100 mL棕色容量瓶中，用水定容，配制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.2.3 樣品前處理
1.2.3.1 樣品溶液的制備。精密稱取樣品適量（精確到0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加70 mL水，超聲提取20分鐘，放冷，加1mL亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入1mL乙酸鋅溶液，混勻，用水定容至刻度，搖勻，取上清液以4000 r/min離心10min，備用。
1.2.3.2 衍生反應.精密吸取標準溶液和樣品溶液各10μL于杜氏小管中，抽干，依次加入0.5 moL/L碳酸氫鈉溶液20μL、1%2，4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液20μL，混勻，置于60℃電熱恒溫干燥箱中避光衍生35min，取出，稍冷，加入磷酸鹽緩沖液（pH=7）160μL，混勻，用微孔濾膜過濾，取10μL進樣。
1.2.4 色譜條件。色譜柱：C18柱，長250 mm，內(nèi)徑4.5 mm，粒徑5μm；流動相：醋酸鈉緩沖液∶乙腈（85∶15,V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。
1.2.5 計算公式
式中：X—樣品中?；撬岬暮?mg/kg；
c—由標準曲線得出的試樣溶液中?；撬岬馁|(zhì)量濃度,μg/mL；
V—試樣定容體積,mL；
m—試樣質(zhì)量,g。
2 結(jié)果與分析
2.1 前處理條件的優(yōu)化
2.1.1 衍生試劑的選擇。本研究在選擇衍生試劑時，比較了2，4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯、鄰苯二甲醛等幾種衍生試劑的特點，其中鄰苯二甲醛是測定游離氨基酸最常用的一種衍生化試劑，其靈敏度高，但是存在衍生物不穩(wěn)定、衍生化時間要求苛刻等缺陷。在考慮到實驗誤差的問題上，選用了2，4-二硝基氟苯(DNFB)作為衍生試劑，3組不同衍生試劑的特點見表1。
表1 不同衍生試劑的特點
2.1.2 衍生時間的選擇。本研究選擇衍生時間時，比較了15min、35min、60min三種不同時間的衍生結(jié)果，衍生結(jié)果排序為60min≥35min＞15min，在考慮到實驗效率的問題上，選用了35min作為衍生時間，3組樣品不同衍生時間的回收率及相對標準偏差結(jié)果見表2。
表2 不同衍生時間的結(jié)果 min、%
2.1.3 流動相的選擇。本研究比較了醋酸鈉緩沖液∶乙腈（85∶15,V∶V）、醋酸鈉緩沖液∶乙腈（60∶40,V∶V）、醋酸鈉緩沖液∶乙腈（40∶60,V∶V）3種流動相對標準溶液及樣品溶液進行分離測定，通過調(diào)節(jié)流動相中各組分的比例，使流動相的極性發(fā)生變化，改變分離效率，結(jié)果表明，不同流動相的色譜峰保留時間及峰型各有不同，隨著乙腈比例的增大，?；撬岜Ａ魰r間不斷提前，峰型變得尖銳。當流動相為醋酸鈉緩沖液∶乙腈（85∶15,V∶V）時，色譜峰峰型較好，保留時間為15 min左右，?；撬針藴嗜芤汉蜆悠啡芤荷V圖見圖1、圖2。
圖1 ?；撬針藴嗜芤荷V圖
圖2 牛磺酸樣品溶液色譜圖
2.2 方法的線性關(guān)系和檢出限
分別移取標準使用溶液注入高效液相色譜儀中，以其濃度值為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。濃度范圍在2.0～100.0μg/mL時，溶液濃度和色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，Y=2870.8X-869.12，r2=0.9999。
取空白樣品，按照樣品處理程序處理后上機測定。另取多份空白樣品，加入不同的較低濃度的?；撬針藴使ぷ饕?，按照樣品處理程序處理后上機測定，對比結(jié)果，將引起3倍信噪比時的濃度定義為方法檢出限，當樣品稱樣量為2 g時，該方法檢出限為5.0 mg/kg，方法靈敏度較高。
2.3 方法精密度
選取配合飼料、濃縮飼料、飼料添加劑、寵物食品等4種不同的產(chǎn)品進行精密度試驗（n=6），測定結(jié)果見表3，可以看出，4種不同產(chǎn)品的RSD均不大于5.0%，說明該方法的準確度較高。
表3 精密度測定結(jié)果 mg/kg、%
2.4 穩(wěn)定性試驗
將同一樣品衍生液放置24h、48 h和96h，分別取這3個時間段的衍生液，平行3次進行上機測定，結(jié)果表明，樣品衍生液密閉冷藏放置48 h內(nèi)，牛磺酸結(jié)果變化不大，?；撬嵘V峰面積及相對標準偏差（RSD）見表4。
表4 穩(wěn)定性測定結(jié)果 h、%
2.5 回收率實驗結(jié)果
取同一基質(zhì)的樣品為本底樣品，分別添加2.0、5.0、10.0 mg/kg 3個不同濃度的牛磺酸標準溶液，按照本方法進行實驗操作，平行測定3次，回收率在90.8%～95.8%之間，RSD為1.08%～2.73%，方法回收率較高，詳見表5。
表5 回收率測定結(jié)果 mg/kg、%
3 結(jié)論與討論
本研究建立了飼料及寵物食品中?；撬岬母咝б合嗌V測定方法。通過對樣品處理和實驗條件進行了優(yōu)化，分別對配合飼料、濃縮飼料、飼料添加劑、寵物食品等4種不同的樣品進行了精密度、準確度及靈敏度實驗，測得6組數(shù)據(jù)的相對標準偏差在1.36%～3.60%之間，不同添加量的平均回收率在90.8%～95.8%之間，方法的檢出限為5.0 mg/kg。優(yōu)化后的方法重復性好，準確度高，基質(zhì)干擾小。通過實際樣品的檢測，說明該方法有較廣泛的適用范圍，除配合飼料、濃縮飼料和飼料添加劑之外，也適用于寵物食品中牛磺酸的檢測。
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?；撬嵊址Qβ-氨基乙磺酸，最早由牛黃中分離出來，故得名。牛磺酸是一種含硫的非蛋白氨基酸，在動物體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成，但與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)。大量的畜禽研究表明，?；撬峋哂刑岣咝笄萆L、繁殖性能，促進機體腦組織發(fā)育，增強機體免疫力，提高神經(jīng)傳導。近年來，?；撬嵩谪i、雞、水產(chǎn)飼料及飼料添加劑和寵物食品中被廣泛應用，隨著人類對?；撬峁δ艿牟粩嗵剿骱驼J識，?；撬岬氖袌鰸摿Σ粩鄶U大。因此建立?；撬岬臏y定方法具有重要意義[1～3]。
目前?；撬岬臏y定方法主要有中和滴定法[4～5]、離子色譜法[6]、分光光度法[7～11]、電位滴定法[12～13]、高效液相色譜法[14～22]、薄層色譜法[23]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[24～27]、氨基酸自動分析儀法等[28～30]。其中分光光度法是傳統(tǒng)方法，操作復雜，所需試劑較多，結(jié)果有偏差故而不能廣泛應用，氨基酸自動分析儀法對儀器和人員的要求較高，在一定程度上增加了檢測的成本。本方法在大量實驗基礎(chǔ)上優(yōu)化了?；撬岬母咝б合嗌V法測定條件，以期為基層檢測機構(gòu)及飼料生產(chǎn)企業(yè)的檢驗人員提供參考。
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1.1 實驗材料
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牛磺酸標準品（純度≥99%）購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、醋酸鈉（優(yōu)級純）、碳酸氫鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、N，N-二甲基甲酰胺（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）；2，4-二硝基氟苯(DNFB)；實驗用水為蒸餾水、高純水。
配合飼料、濃縮飼料、飼料添加劑、寵物食品等均為客戶委托檢驗的樣品。
1.2 實驗方法
1.2.1 溶液的配制。亞鐵氰化鉀溶液：150g/L；乙酸鋅溶液：30g/L；磷酸鹽緩沖液（pH=7）：稱取磷酸二氫鈉3.4 g于500 mL容量瓶中，加入0.1 moL/L氫氧化鈉145.5 mL，用水定容；醋酸鈉緩沖液（0.05 moL/L）：稱取3.4 g醋酸鈉，加入800 mL超純水，10 mL N，N-二甲基甲酰胺，用20%冰醋酸調(diào)pH至6.4，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，即得。
1.2.2 標準溶液的配制。?；撬針藴寿A備液（1mg/mL）：準確稱取100 mg牛磺酸標準品于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解定容，搖勻配制成標準貯備液，4℃密封避光保存，有效期6個月。?；撬針藴适褂靡海悍謩e移取一定體積的?；撬針藴寿A備液于100 mL棕色容量瓶中，用水定容，配制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.2.3 樣品前處理
1.2.3.1 樣品溶液的制備。精密稱取樣品適量（精確到0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加70 mL水，超聲提取20分鐘，放冷，加1mL亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入1mL乙酸鋅溶液，混勻，用水定容至刻度，搖勻，取上清液以4000 r/min離心10min，備用。
1.2.3.2 衍生反應.精密吸取標準溶液和樣品溶液各10μL于杜氏小管中，抽干，依次加入0.5 moL/L碳酸氫鈉溶液20μL、1%2，4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液20μL，混勻，置于60℃電熱恒溫干燥箱中避光衍生35min，取出，稍冷，加入磷酸鹽緩沖液（pH=7）160μL，混勻，用微孔濾膜過濾，取10μL進樣。
1.2.4 色譜條件。色譜柱：C18柱，長250 mm，內(nèi)徑4.5 mm，粒徑5μm；流動相：醋酸鈉緩沖液∶乙腈（85∶15,V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。
1.2.5 計算公式
式中：X—樣品中?；撬岬暮?mg/kg；
c—由標準曲線得出的試樣溶液中?；撬岬馁|(zhì)量濃度,μg/mL；
V—試樣定容體積,mL；
m—試樣質(zhì)量,g。
2 結(jié)果與分析
2.1 前處理條件的優(yōu)化
2.1.1 衍生試劑的選擇。本研究在選擇衍生試劑時，比較了2，4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯、鄰苯二甲醛等幾種衍生試劑的特點，其中鄰苯二甲醛是測定游離氨基酸最常用的一種衍生化試劑，其靈敏度高，但是存在衍生物不穩(wěn)定、衍生化時間要求苛刻等缺陷。在考慮到實驗誤差的問題上，選用了2，4-二硝基氟苯(DNFB)作為衍生試劑，3組不同衍生試劑的特點見表1。
表1 不同衍生試劑的特點
2.1.2 衍生時間的選擇。本研究選擇衍生時間時，比較了15min、35min、60min三種不同時間的衍生結(jié)果，衍生結(jié)果排序為60min≥35min＞15min，在考慮到實驗效率的問題上，選用了35min作為衍生時間，3組樣品不同衍生時間的回收率及相對標準偏差結(jié)果見表2。
表2 不同衍生時間的結(jié)果 min、%
2.1.3 流動相的選擇。本研究比較了醋酸鈉緩沖液∶乙腈（85∶15,V∶V）、醋酸鈉緩沖液∶乙腈（60∶40,V∶V）、醋酸鈉緩沖液∶乙腈（40∶60,V∶V）3種流動相對標準溶液及樣品溶液進行分離測定，通過調(diào)節(jié)流動相中各組分的比例，使流動相的極性發(fā)生變化，改變分離效率，結(jié)果表明，不同流動相的色譜峰保留時間及峰型各有不同，隨著乙腈比例的增大，?；撬岜Ａ魰r間不斷提前，峰型變得尖銳。當流動相為醋酸鈉緩沖液∶乙腈（85∶15,V∶V）時，色譜峰峰型較好，保留時間為15 min左右，?；撬針藴嗜芤汉蜆悠啡芤荷V圖見圖1、圖2。
圖1 ?；撬針藴嗜芤荷V圖
圖2 牛磺酸樣品溶液色譜圖
2.2 方法的線性關(guān)系和檢出限
分別移取標準使用溶液注入高效液相色譜儀中，以其濃度值為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。濃度范圍在2.0～100.0μg/mL時，溶液濃度和色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，Y=2870.8X-869.12，r2=0.9999。
取空白樣品，按照樣品處理程序處理后上機測定。另取多份空白樣品，加入不同的較低濃度的?；撬針藴使ぷ饕?，按照樣品處理程序處理后上機測定，對比結(jié)果，將引起3倍信噪比時的濃度定義為方法檢出限，當樣品稱樣量為2 g時，該方法檢出限為5.0 mg/kg，方法靈敏度較高。
2.3 方法精密度
選取配合飼料、濃縮飼料、飼料添加劑、寵物食品等4種不同的產(chǎn)品進行精密度試驗（n=6），測定結(jié)果見表3，可以看出，4種不同產(chǎn)品的RSD均不大于5.0%，說明該方法的準確度較高。
表3 精密度測定結(jié)果 mg/kg、%
2.4 穩(wěn)定性試驗
將同一樣品衍生液放置24h、48 h和96h，分別取這3個時間段的衍生液，平行3次進行上機測定，結(jié)果表明，樣品衍生液密閉冷藏放置48 h內(nèi)，牛磺酸結(jié)果變化不大，?；撬嵘V峰面積及相對標準偏差（RSD）見表4。
表4 穩(wěn)定性測定結(jié)果 h、%
2.5 回收率實驗結(jié)果
取同一基質(zhì)的樣品為本底樣品，分別添加2.0、5.0、10.0 mg/kg 3個不同濃度的牛磺酸標準溶液，按照本方法進行實驗操作，平行測定3次，回收率在90.8%～95.8%之間，RSD為1.08%～2.73%，方法回收率較高，詳見表5。
表5 回收率測定結(jié)果 mg/kg、%
3 結(jié)論與討論
本研究建立了飼料及寵物食品中?；撬岬母咝б合嗌V測定方法。通過對樣品處理和實驗條件進行了優(yōu)化，分別對配合飼料、濃縮飼料、飼料添加劑、寵物食品等4種不同的樣品進行了精密度、準確度及靈敏度實驗，測得6組數(shù)據(jù)的相對標準偏差在1.36%～3.60%之間，不同添加量的平均回收率在90.8%～95.8%之間，方法的檢出限為5.0 mg/kg。優(yōu)化后的方法重復性好，準確度高，基質(zhì)干擾小。通過實際樣品的檢測，說明該方法有較廣泛的適用范圍，除配合飼料、濃縮飼料和飼料添加劑之外，也適用于寵物食品中牛磺酸的檢測。
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