宏基因組第二代測序技術(shù)對重癥監(jiān)護兒童支氣管肺炎的病原學(xué)研究

楊偉健 唐遠(yuǎn)平 朱歡歡 姚仲偉 蘇淑芬 吳松 韓爭爭 張亮 鄭亦男

2016年WHO數(shù)據(jù)顯示5歲以下兒童，下呼吸道感染的死亡人數(shù)達108萬[1]。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測，高達60%病例無法明確病原體[2]。2008年起mNGS開始臨床應(yīng)用[3-4]。2016年美國FDA等機構(gòu)發(fā)布mNGS行業(yè)指引[5]。2019年中國發(fā)布《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識》，明確重癥患者應(yīng)用mNGS適應(yīng)證、樣本采集及實驗方法。共識推薦下呼吸道感染的重癥患者，需要在下呼吸道的感染部位取材，而非血液樣本[6]。有關(guān)下呼吸道取材病原mNGS研究，除了少數(shù)成人研究，缺乏兒童內(nèi)容[7-11]。收治重癥監(jiān)護室的支氣管肺炎兒童，有迫切的病原學(xué)診斷壓力。因此，本研究探討mNGS對重癥監(jiān)護支氣管肺炎兒童的病原診斷價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年4月10日至2019年10月10日，廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫(yī)院)兒童重癥醫(yī)學(xué)科收治支氣管肺炎的臨床資料。支氣管肺炎診斷，依據(jù)呼吸道癥狀、體征及肺部影像學(xué)改變[12]。低氧性呼吸衰竭診斷，依據(jù)改良氧合指數(shù)(P/F)低于300mmHg[13]。塑形性支氣管炎診斷，依據(jù)支氣管鏡檢查[14]。兒童急性呼吸窘迫綜合征診斷，依據(jù)2015國際小兒急性呼吸窘迫綜合征專家共識[15-16]。本研究通過廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(廣東省婦幼保健院醫(yī)倫201801085)，監(jiān)護人均知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1 支氣管鏡檢查

支氣管鏡檢查適應(yīng)證、操作規(guī)范參考2018年國家衛(wèi)生健康委員會人才交流服務(wù)中心兒科呼吸內(nèi)鏡診療技術(shù)專家組等的總結(jié)[17]。設(shè)備采用奧林巴斯外徑2.8 mm電子支氣管鏡。肺泡灌洗：0.9%氯化鈉溶液1～2 mL/kg灌洗實變肺段或支氣管開口堵塞的肺葉段，回收率50%左右。

2 宏基因二代測序

肺泡灌洗液的存儲及運輸參考專家共識[6]。樣品外送廣州微遠(yuǎn)基因科技有限公司，完成DNA和RNA雙程序測序。檢測RNA程序時，使用rRNA deletion probes試劑盒(微遠(yuǎn)基因產(chǎn)品)去除宿主的核糖體RNA。實驗環(huán)節(jié)包括核酸提取、文庫構(gòu)建、測序和信息分析。基于Illumina高通量測序平臺，涵蓋9945種細(xì)菌、6760種病毒、1551種真菌、144種分枝桿菌、107種支原體/衣原體及305種寄生蟲。目前臨床沒有統(tǒng)一的陽性評判標(biāo)準(zhǔn)，參考相關(guān)文獻[4, 8-9, 18-20]，本研究的陽性標(biāo)準(zhǔn)：1)在排除正常皮膚等菌群之后，相對豐度位于前5位的屬，每個屬又選前2位的種；2)細(xì)菌、真菌和病毒，當(dāng)特異性序列數(shù)≥3 reads時判斷為陽性；對于寄生蟲，特異性序列數(shù)≥10 reads判讀為陽性。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，特異性序列數(shù)≥1 reads，即判斷為陽性；3)有經(jīng)驗的醫(yī)師討論符合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)改變，排除可能定植、污染病例；4)針對性治療后，患兒病情改善。

3 其他實驗室檢查

與mNGS同時取材的肺泡灌洗液送廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫(yī)院)檢驗科、產(chǎn)前診斷遺傳醫(yī)學(xué)中心，完善傳統(tǒng)培養(yǎng)、病原核酸qPCR檢測(CMV、EBV、MP、TB、hEnV、RSV、BoCV、hRhV、AdV)。

注：CMV，巨細(xì)胞病毒cytomegalovirus；EBV，EB病毒EB virus；MP，支原體mycoplasma；TB，結(jié)核分支桿菌mycobacterium tuberculosis；hEnV，人腸道病毒human enterovirus；RSV，呼吸道合胞病毒respiratory syncytial virus；BoCV，博卡病毒boca virus；hRhV，人鼻病毒human rhinovirus；AdV，腺病毒adenovirus。

4 影像學(xué)檢查

廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫(yī)院)2名副主任醫(yī)師以上職稱影像學(xué)醫(yī)生對胸片、增強CT作出描述、診斷。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般資料

(見表1)。

表1 一般資料

二、病原學(xué)資料

1 病原分類(見表2)。

表2 病原分類

2 mNGS病原分屬、混合感染(見表3)。

表3 mNGS病原分屬、混合感染

3 mNGS塑形性支氣管炎 人腺病毒7B型(3/5例)，人副流感病毒3型(2/5例)，乙型流感病毒(1/5例)。

4 mNGS兒童急性呼吸窘迫綜合征 人腺病毒7B型(2/2例)。

5 mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)比較(見表4)。

表4 mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)(細(xì)菌、真菌)比較(n)

6 mNGS與qPCR比較(見表5)。

表5 mNGS與qPCR(呼吸道病原9項)比較(n)

三、低氧組與非低氧組的單因素比較

1 一般資料

性別、年齡、體重、喘息、病程2周以上及彌漫性改變均無差異，P>0.05；a/APO2、PCO2>50mmHg及有創(chuàng)機械通氣例數(shù)存在差異，P<0.05(t=9.373，χ2=5.390，χ2=8.792)(見表1)。

2 mNGS分屬兩組均無差異，P>0.05(見表3)。

討 論

兒童重癥監(jiān)護室(PICU)收治的支氣管肺炎病例，病情較重，可較短時間惡化致呼吸衰竭、兒童急性呼吸窘迫綜合征及膿毒癥等嚴(yán)重后果[12, 21-22]。本研究中重癥、病情遷延的病例占多數(shù)(表1)，其中影像學(xué)彌漫性改變、抗生素療效不佳及呼吸衰竭的，有迫切的診斷壓力。然而肺炎病因復(fù)雜，感染、免疫失調(diào)、腫瘤、氣道結(jié)構(gòu)異常和系統(tǒng)性因素(神經(jīng)、肌肉、循環(huán)及消化等)摻雜。相似的臨床表現(xiàn)，可能為混合感染，可能有非感染因素。例如CT呈彌漫性磨玻璃樣改變，原因可能為CMV等病毒感染、耶氏肺孢子菌感染、過敏性肺炎及肺泡蛋白沉著癥等。主治醫(yī)生的診斷思路常常是，先排查感染。確定病原體感染，包括直接證據(jù)、間接證據(jù)。直接證據(jù)包括病理、培養(yǎng)及核酸檢測，間接證據(jù)有特異性抗體檢測。有研究顯示使用傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法高達60%的病例無法明確病原體[2]。大量的檢測耗費時間，患兒可能延誤救治。病原微生物宏基因二代測序技術(shù)(mNGS)屬于核酸檢測，作為臨床病原學(xué)診斷的新方法，本研究將其應(yīng)用于重癥監(jiān)護支氣管肺炎兒童的肺泡灌洗液，探討其應(yīng)用價值，從取材、病原學(xué)特征及診斷效能上，與傳統(tǒng)培養(yǎng)、qPCR比較。

首先，mNGS工作原理、流程不依賴培養(yǎng)，不像PCR預(yù)設(shè)感染立場。本研究重癥患兒只需要接受一次肺泡灌洗取材，標(biāo)本量1.5到3毫升送檢，2到3天結(jié)果回報。mNGS可避免重癥患兒反復(fù)大量地取材，節(jié)省檢測項目和時間。

接著我們研究重癥監(jiān)護支氣管肺炎兒童的病原學(xué)特征，(表2)顯示mNGS診斷病原分類：病毒多見(40/60例)，細(xì)菌(19/60例)、真菌(15/60例)及支原體(9/60例)感染亦有相當(dāng)比例；(表3)顯示mNGS診斷混合感染：2種以上微生物感染31/60例，2類以上微生物感染20/60例?？梢娧芯咳巳旱牟≡V寬廣。傳統(tǒng)培養(yǎng)的檢測范圍是細(xì)菌、真菌。qPCR的檢測范圍是預(yù)設(shè)的感染項目，本研究為呼吸道病原9項?？梢妭鹘y(tǒng)培養(yǎng)、PCR非廣譜，如希望擴大范圍，標(biāo)本量、時間及經(jīng)濟成本隨之升高。mNGS的檢測范圍是其最大的應(yīng)用優(yōu)勢，涵蓋了9945種細(xì)菌、6760種病毒、1551種真菌、144種分枝桿菌、107種支原體/衣原體及305種寄生蟲，尤其適用于排查混合、少見及難以培養(yǎng)的感染(例如表3的百日咳博德特菌屬、肺孢子菌屬)。mNGS不僅可辨別病原屬、種，還可分型。分型對抗感染治療、流行病學(xué)調(diào)查具有指導(dǎo)意義[23]。分屬水平，mNGS發(fā)現(xiàn)低氧組與非低氧組無差異(表3)，但分型時發(fā)現(xiàn)PB、PARDS的病例發(fā)生腺病毒7B型感染較多(3/5例、2/2例)。本研究病例收集于2019年4月至2019年10月。當(dāng)時廣東存在腺病毒肺炎疫情，國家衛(wèi)生健康委于2019年6月制定《兒童腺病毒肺炎診療規(guī)范(2019年版)》，指出人腺病毒7B型是2019年我國南方發(fā)病地區(qū)的主要流行株[24]。另外，病原微生物存在天然耐藥性(例如表3的念珠菌屬中，光滑念珠菌、克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥；單胞菌屬中，嗜麥芽窄食單胞菌對碳青霉烯類抗生素天然耐藥[25])，mNGS診斷微生物屬種型，迅速幫助醫(yī)生選用合適的抗感染方案。

最后我們研究mNGS的診斷效能。對于細(xì)菌、真菌，傳統(tǒng)培養(yǎng)檢出率21.7%(13/60例)，mNGS為41.7%(25/60例)，高于傳統(tǒng)培養(yǎng)(χ2=5.188，P<0.05)。原因是傳統(tǒng)培養(yǎng)受病原體活性、數(shù)量、培養(yǎng)環(huán)境及抗生素使用等因素的影響。mNGS為核酸測序，則不受微生物活性、抗生素使用的影響。mNGS對厭氧菌、傳統(tǒng)培養(yǎng)困難的細(xì)菌、真菌更有優(yōu)勢，所以檢出率更高。對于病毒、支原體及結(jié)核分枝桿菌，qPCR檢出率79.5%(35/44例)，mNGS檢出率63.6%(28/44例)，低于qPCR(χ2=13.49，P<0.05)。原因是工作原理的差異。qPCR使用特異性引物對目標(biāo)核酸進行擴增后再檢測，而mNGS對目標(biāo)核酸不經(jīng)擴增直接檢測，而且檢出率與選擇的檢測深度有關(guān)，故qPCR對目標(biāo)核酸更敏感。當(dāng)mNGS檢測陽性時，有時使用qPCR對其進行驗證。mNGS的敏感性(假陰性問題)、特異性(假陽性問題)以及符合率如何？本研究以傳統(tǒng)培養(yǎng)、qPCR為金標(biāo)準(zhǔn)，mNGS與兩種方法比較(表4、5)，mNGS表現(xiàn)出較高的敏感性、特異性及符合率，尤其在與qPCR比較時【敏感性77.1%(95% CI 0.610～0.879)，特異性88.9%(95% CI 0.565～0.994)，符合率79.5%(35/44例)】。結(jié)果與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院的成人呼吸道危重癥肺泡灌洗液的研究相近(敏感性77.8%，特異性70%[20])。mNGS假陰性的原因有：(1)病原的載量低于mNGS的檢測深度。mNGS的檢測深度是可調(diào)整的，從75bp的短序列到10000bp的長序列。深度越大，獲取序列越多，敏感性越高。(2)宿主、微生態(tài)的背景基因序列太高。有文獻指出，宏基因序列中超過99%為人體、微生態(tài)的基因序列，病原微生物僅占不到1%[26]。人體強烈免疫反應(yīng)時，白細(xì)胞升高，取材樣品中人的基因序列更多。實驗室需應(yīng)用去除人體基因序列的技術(shù)以富集病原體基因序列。(3)微生物具有厚膜壁。例如結(jié)核分枝桿菌，mNGS較難獲取核酸序列，需要應(yīng)用破壁技術(shù)。可見，mNGS的假陰性能通過實驗室提高技術(shù)而減少，同時，臨床醫(yī)師如果預(yù)斷感染為厚壁膜的微生物，最好加上培養(yǎng)、PCR等方法，避免漏診。判讀mNGS結(jié)果時，尤其是細(xì)菌類微生物，需要注意假陽性的問題。因為呼吸道并非無菌，存在微生態(tài)，本研究建議mNGS的陽性標(biāo)準(zhǔn)綜合以下條件：(1)相對豐度、特異性序列數(shù)符合一定條件(相對豐度位于前5位的屬，每個屬又選前2位的種；細(xì)菌、真菌和病毒特異性序列數(shù)≥3 reads；寄生蟲特異性序列數(shù)≥10 reads；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性序列數(shù)≥1 reads)。(2)排除常見的上/下呼吸道的微生態(tài)菌群(背景菌)[27-28]。(3)盡量采取DNA、RNA雙程序測序。(4)有經(jīng)驗的臨床醫(yī)師討論，審視取材，結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像、傳統(tǒng)檢驗結(jié)果及對應(yīng)療效的評價。另外，有文獻提出宿主基因轉(zhuǎn)錄的改變[8]、病原核酸序列分布的彌散程度[29]及微生態(tài)多樣性的改變[30]，均有助于區(qū)分感染、定植、污染及背景菌，是mNGS有待研究的方向。

綜上，收治重癥監(jiān)護室的支氣管肺炎兒童，需要短時間內(nèi)排查混合、少見感染。肺泡灌洗液宏基因二代測序技術(shù)具有廣譜、花時較少、高診斷效能等優(yōu)勢，適合危重兒童使用。