3種蛋白酶對蘇淮斷奶仔豬生長性能、營養(yǎng)物質表觀消化率和血清生化指標的影響

侯玉煌 丁宏標* 李 強

(1.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081；2.生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京 100081；3.新淮豬資源開發(fā)中心，淮安 223000)

相對于動物蛋白質，植物性蛋白質原料(如豆粕等)因其價廉、易得、儲運方便等優(yōu)點在飼料配方中的比例日漸增多。但植物性蛋白質原料中也存在大量的抗營養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白等，極易造成動物(尤其是幼齡動物)的營養(yǎng)性腹瀉。外源蛋白酶不僅可以補充動物內源蛋白酶的不足，降解大豆抗營養(yǎng)因子[1]，防治營養(yǎng)性腹瀉，還可以提高營養(yǎng)物質的消化利用率，因此關于飼用蛋白酶的研究備受關注[2]。研究結果表明，添加蛋白酶可以提高斷奶仔豬的日增重，降低料重比(F/G)，提高營養(yǎng)物質的表觀消化率[3]。但目前的研究多以復合酶為主，未見有單一蛋白酶使用效果對比的報道。因此，本研究旨在對比酸性、中性和堿性蛋白酶對蘇淮斷奶仔豬的生長性能、營養(yǎng)物質表觀消化率以及血清生化指標的影響，集中探討不同蛋白酶對營養(yǎng)性腹瀉情況改善的效果，為飼料配方中蛋白酶的合理使用提供科學依據，也為蘇淮豬的健康養(yǎng)殖提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酸性、中性和堿性蛋白酶均購自山東隆科特酶制劑有限公司。酸性蛋白酶：產自黑曲霉，活性100 000 U/g，有效pH為2.0～6.0，最適pH為2.5～3.5；中性蛋白酶：產自枯草芽孢桿菌，活性100 000 U/g，有效pH為5.5～8.5，最適pH為6.8～7.0；堿性蛋白酶：產自地衣芽孢桿菌，活性200 000 U/g，有效pH為6.0～11.0，最適pH為9.5～10.5。

1.2 試驗飼糧與營養(yǎng)水平

試驗所用的飼糧配方參照NRC(1998)并結合蘇淮豬的營養(yǎng)特點設計而成，試驗料為機配粉狀料?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，選擇健康、平均體重為(9.24±0.84) kg的蘇淮斷奶仔豬120頭，按體重、性別基本一致的原則隨機分為4組，每組6個重復，每個重復5頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別飼喂在基礎飼糧中添加0.2 g/kg酸性蛋白酶、0.2 g/kg中性蛋白酶和0.1 g/kg堿性蛋白酶的飼糧。試驗預試期5 d，正試期45 d。試驗豬舍為封閉式豬舍，豬欄為半漏縫地板式。飼養(yǎng)管理方式采用常規(guī)方式(每天喂料3次，分別為07:00、14:00和17:00)，定期消毒、免疫、驅除蚊蟲，試驗豬自由采食和飲水。

1.4 樣品采集與指標測定

1.4.1 生長性能

于正試期第1天和最后1天08:00空腹稱重，得到平均初重和平均末重，計算出每頭豬的平均日增重(ADG)；每周準確記錄每組飼糧的投放量和剩余量，計算出每頭豬的平均日采食量(ADFI)；根據ADG和ADFI計算F/G。

1.4.2 血清生化指標

于試驗最后1天晨飼前進行采血，每個重復隨機選取2頭仔豬(公母各1頭)從頸靜脈采血10 mL，采血后立即3 000 r/min離心20 min，取血清裝入1.5 mL EP管內，-20 ℃冷凍保存，待測。血清生化指標測定方法：采用雙縮脲終點法檢測總蛋白(TP)含量；采用溴甲酚綠比色法檢測白蛋白(ALB)含量；采用分光光度法檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性；采用酶劑法檢測甘油三酯(TG)含量；采用脲酶法檢測尿素氮(UN)含量。上述指標測定所用試劑盒均購自北京金海科隅生物科技發(fā)展有限公司。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 8 000 IU，VD32 000 IU，VE 28 IU，VB13.2 mg，VB28 mg，VB62.5 mg，VB120.3 mg，VK32.8 mg，煙酸 niacin 18 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 20 mg，葉酸 folic acid 1.2 mg，氯化膽堿 choline chloride 320 mg，Cu 80 mg，Fe 120 mg，Zn 100 mg，Mn 45 mg，I 0.8 mg，Se 0.28 mg。

2)實測值。Measured values.

1.4.3 腹瀉率與糞便指數

試驗開始后以每個重復為單位，每天觀察記錄每欄仔豬的腹瀉情況并進行糞便評分，評分標準：外觀條形或粒狀為正常，評分記0；軟糞，能成形為輕度腹瀉，評分記1；稠狀，不成形，糞水無分離現象為中度，評分記2；液狀，不成形，糞水有分離現象為嚴重，評分記3。當仔豬糞便評分≥2時，開始使用抗生素或止瀉藥進行治療。試驗結束時計算腹瀉率與糞便指數，用腹瀉率、糞便指數等指標反映腹瀉程度。腹瀉相關計算公式：

腹瀉率=100×腹瀉頭數/總頭數

(單個重復的總頭數)；糞便指數=糞便評分之和/總頭數。

1.4.4 營養(yǎng)物質表觀消化率

于試驗結束前1周進行消化試驗，為期7 d，其中3 d適應期，4 d試驗期。每個重復選取1頭進行全收糞，記錄每日采食量、每日產糞總重。每天收集100 g糞便，加入10 mL 10%硫酸溶液混勻冷凍保存，結束后再將4 d的糞樣混勻，-20 ℃冷凍保存，待測。測定飼糧中和糞樣中的干物質(DM)、有機物(OM)、粗蛋白質(CP)和粗脂肪(EE)含量。營養(yǎng)物質表觀消化率計算公式：

營養(yǎng)物質表觀消化率(%)=100×[食入的
營養(yǎng)物質含量(g)-糞中該物質含量(g)]/
食入的營養(yǎng)物質含量(g)。

1.5 數據處理

試驗數據通過Excel 2003進行初步處理后，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的ANOVA過程進行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進行多重比較，結果表示為平均值±標準差，P<0.05作為差異顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 3種蛋白酶對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，酸性蛋白酶組(Ⅰ組)的ADG和ADFI均顯著高于對照組(P<0.05)，F/G低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；堿性蛋白酶組(Ⅲ組)的ADG顯著高于對照組(P<0.05)，F/G顯著低于對照組(P<0.05)；中性蛋白酶組(Ⅱ組)的ADG高于對照組，F/G低于對照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 3種蛋白酶對斷奶仔豬生長性能的影響

同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 3種蛋白酶對斷奶仔豬營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

由表3可知，試驗組的DM表觀消化率和OM表觀消化率均顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅰ組和Ⅲ組的DM消化率和OM表觀消化率顯著高于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ組的CP表觀消化率顯著高于對照組、Ⅱ組和Ⅲ組(P<0.05)。

表3 3種蛋白酶對斷奶仔豬營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

2.3 3種蛋白酶對斷奶仔豬腹瀉情況的影響

由表4可知，各試驗組的腹瀉率和糞便指數均低于對照組。在試驗第31～45天這一時期，各試驗組的腹瀉率和糞便指數均顯著低于對照組(P<0.05)，Ⅲ組的腹瀉率和糞便指數最低。

表4 3種蛋白酶對斷奶仔豬腹瀉情況的影響

2.4 3種蛋白酶對斷奶仔豬血清生化指標的影響

由表5可知，Ⅱ組血清AST活性顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組和對照組(P<0.05)；各試驗組血清中UN含量都低于對照組，但只有Ⅰ組與對照組差異顯著(P<0.05)。

表5 3種蛋白酶對斷奶仔豬血清生化指標的影響

3 討 論

3.1 3種蛋白酶對斷奶仔豬生長性能的影響

幼齡動物的胃腸道發(fā)育不完善，哺乳仔豬斷奶后，體內消化酶活性大幅度降低，如胃蛋白酶[4]等，故在飼糧中添加外源蛋白酶尤為重要。Han等[5]研究發(fā)現，將含有酸性蛋白酶的飼用復合酶添加到保育豬飼糧中，增強了腸道相關消化酶的活性，提高了保育豬的生長性能。本試驗中，各試驗組的生長性能均優(yōu)于對照組，這與Zuo等[6]的結果一致，其中Ⅰ組的末重、ADG和ADFI都顯著高于對照組，F/G降低了4.78%；Ⅱ組的末重、ADG和ADFI較對照組分別提高5.81%、8.80%和4.27%，F/G較對照組降低4.07%；Ⅲ組的ADG顯著高于對照組，末重和ADFI較對照組分別提高3.63%和2.56%，F/G顯著低于對照組。本試驗中，Ⅰ組的末重較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高了2.63%和4.80%，ADG較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高了4.35%和1.94%，ADFI較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高了3.28%和5.00%，可見酸性蛋白酶在生長性能方面的效果優(yōu)于中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這與盧晨等[7]的試驗中中性蛋白酶優(yōu)于酸性蛋白酶的研究結果不一致。原因可能是本試驗采用的蛋白酶均為普通粉劑，未做任何包被處理，只有酸性蛋白酶可以適應胃液的酸性條件，能優(yōu)先發(fā)揮作用，使飼糧中CP在胃中初步消化分解的作用增強，促進營養(yǎng)物質在小腸內的消化吸收；而中性和堿性蛋白酶不能適應胃部酸性環(huán)境，被部分破壞分解，酶活降低，使得效果低于酸性蛋白酶。且本試驗酶活水平較盧晨等[7]試驗酶活水平高一個數量級，極大地補充了胃蛋白酶的不足，增強了胃消化功能。在自由采食條件下，仔豬未完善的消化系統(tǒng)難以充分消化攝入的營養(yǎng)物質，酸性蛋白酶可增強胃的消化功能，降低小腸的消化負擔，提高生長性能。

3.2 3種蛋白酶對斷奶仔豬營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

李同洲等[8]研究發(fā)現，在斷奶仔豬飼糧中添加含有蛋白酶的復合酶，可以提高CP的消化率，最佳可提高1.52%，并且指出蛋白酶是斷奶仔豬酶制劑配方的首選成分。本試驗中，Ⅰ組的CP表觀消化率較對照組提高5.32%，較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高4.99%和3.72%。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組DM表觀消化率分別較對照組提高6.14%、3.22%和5.79%，Ⅰ組和Ⅲ組又顯著高于Ⅱ組；Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組OM表觀消化率較對照組提高4.81%、2.22%和4.38%，Ⅰ組和Ⅲ組也顯著高于Ⅱ組；從數據可以看出，Ⅰ組的DM表觀消化率、OM表觀消化率和CP表觀消化率都高于Ⅱ組和Ⅲ組。本試驗中各試驗組的CP表觀消化率較對照組均有提高，這與Yu等[9]的結果一致。有研究表明，蛋白酶使用可提高CP和氨基酸在回腸的消化率[10]，在Zuo等[6]的試驗中，營養(yǎng)物質消化率也獲得提高。外源添加蛋白酶也可能因作用位點等方面的不同，將一些動物內源蛋白酶難以消化的蛋白質水解為肽和氨基酸，進而提高動物對飼糧CP的消化率。單一蛋白酶制劑在畜禽行業(yè)內的使用較少，但單一酶的使用可以更好地對比酶的作用效果，還可探究單一酶在動物不同的生長時期的添加水平，更詳細地分析不同時期的消化代謝特點。育肥豬比仔豬具有完善的消化功能，可以很好地消化營養(yǎng)物質[11]，使得蛋白酶在仔豬上的使用效果優(yōu)于育肥豬。

3.3 3種蛋白酶對斷奶仔豬腹瀉情況的影響

斷奶仔豬由于應激導致消化系統(tǒng)紊亂，消化酶分泌的不足進一步影響斷奶仔豬的消化能力，從而降低仔豬健康狀況[12]。添加酶制劑可彌補內源消化酶分泌的不足，幫助消化腸道內營養(yǎng)物質，減少過敏反應的發(fā)生，降低腹瀉率[13]。郭建來等[14]在探究酸性蛋白酶對仔豬生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響時對仔豬的腹瀉情況也進行了記錄，酸性蛋白酶組的腹瀉率較對照組降低了65.47%，減少腹瀉效果明顯。本試驗中，試驗組的腹瀉率和糞便指數均低于對照組，在試驗第31～45天時期試驗組的腹瀉率和糞便指數與對照組有最明顯差異。其中，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的腹瀉率分別比對照組低70.44%、76.67%和77.78%，糞便指數分別比對照組低56.00%、66.73%和75.82%；而Ⅱ組的腹瀉率和糞便指數分別比Ⅰ組降低了21.05%和24.81%；Ⅲ組的腹瀉率和糞便指數分別比Ⅱ組降低了4.76%和27.32%?？梢钥闯鲋行缘鞍酌负蛪A性蛋白酶的防治腹瀉效果優(yōu)于酸性蛋白酶，推測是由于中性蛋白酶和堿性蛋白酶在腸道中發(fā)揮的作用更明顯。斷奶仔豬飼糧為高蛋白質飼糧，斷奶早期的仔豬消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育均不完善，腸道微生物區(qū)系平衡尚未建立，會對飼糧中的CP產生消化障礙，未消化的蛋白質進入腸道后段被細菌降解成胺類等有害物質，造成仔豬營養(yǎng)性腹瀉[15]。同時腸道對飼糧抗原產生免疫反應，引起腸道形態(tài)結構的損傷性變化，破壞仔豬腸道的免疫功能，引起腸道局部過敏反應，加劇仔豬營養(yǎng)性腹瀉的爆發(fā)[16]。中性蛋白酶的最適pH為6.8～7.0，更適應小腸內的pH條件[17]。中性蛋白酶進入小腸后補充了胰蛋白酶分泌的不足，促進胰蛋白酶對腸道內蛋白質的分解，減少抗原引起的免疫應激，有效降低營養(yǎng)性腹瀉的發(fā)生。據報道，大豆副產品中抗營養(yǎng)因子的殘留量很高，如豆粕、膨化豆粕，而膨化大豆經高溫雖然可以去除熱敏性的抗營養(yǎng)因子，但無法去除豆粕中熱穩(wěn)定性的大豆抗原蛋白等抗營養(yǎng)因子[18-19]，使其成為造成仔豬營養(yǎng)性腹瀉的一大因素。有研究發(fā)現堿性蛋白酶不僅可以改善豆粕中大豆蛋白的溶解性，也能快速地將大部分大豆抗原蛋白降解為21 ku以下的肽，很好地改善了豆粕的使用安全性[20]。亦有報道認為枯草芽孢桿菌分泌的中性蛋白酶可以降解大豆蛋白，提高CP消化率，是枯草芽孢桿菌益生作用的機理之一[21]。堿性蛋白酶在腸道內雖不能達到最適酶活條件，但弱堿性環(huán)境處于其能發(fā)揮酶活條件內。堿性蛋白酶能更好地降解飼糧中的抗營養(yǎng)因子，如抗原蛋白等[1]，大分子、難降解的蛋白質經堿性蛋白酶的降解變成小分子的肽進入組織內，減少了飼糧中抗營養(yǎng)因子引起的仔豬腸道免疫反應，從而達到防治營養(yǎng)性腹瀉的效果。

3.4 3種蛋白酶對斷奶仔豬血清生化指標的影響

李元鳳等[22]在研究角蛋白酶對仔豬生長性能、血清生化指標及抗氧化指標影響時發(fā)現外源添加角蛋白酶可顯著降低血清中ALT的活性。ALT和AST主要存在于細胞液中，在心臟和肝臟組織中含量較高。轉氨酶活性可反映肝臟結構和功能完整性[23]，當肝臟受損時，大量的轉氨酶進入血中導致血清中轉氨酶含量偏高。本試驗中，Ⅱ組血清AST活性顯著高于對照組、Ⅰ組和Ⅲ組，與相關試驗結果不一致，原因尚不清楚。本試驗Ⅰ組血清UN含量顯著低于對照組，血液中的尿素是通過鳥氨酸循環(huán)合成的，是蛋白質分解的最終產物，可以反映蛋白質的代謝。單胃動物血清UN含量與飼糧的氮利用率成反比，可以衡量飼糧蛋白質的生物學價值，UN含量越低表明飼糧蛋白質的利用率越高[24]。本試驗中，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中血清TP含量較對照組分別提高了1.69%、2.78%、2.42%，但差異不顯著。而TP有運輸營養(yǎng)物質、維持滲透壓，參與體液免疫的功能，TP含量升高可增強營養(yǎng)物質的運輸，維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡。

4 結 論

此試驗中，在飼糧中添加酸性、中性和堿性蛋白酶提高了蘇淮斷奶仔豬的生長性能和營養(yǎng)物質表觀消化率，也使得腹瀉率得到降低。其中Ⅰ組的末重、ADG、ADFI、DM表觀消化率、OM表觀消化率和CP表觀消化率較Ⅱ組和Ⅲ組都有所提高，而Ⅱ組和Ⅲ組在腹瀉率和腹瀉指數方面要低于Ⅰ組。可見酸性蛋白酶在提高生長性能和提高營養(yǎng)物質表觀消化率方面效果好，中性蛋白酶和堿性蛋白酶在降低營養(yǎng)性腹瀉方面的效果好。

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