黃曲霉毒素分解酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)與應(yīng)用

史敦勝 聶利波 宋洋洋 李元曉 李 旺

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物組成[1-4]，屬劇毒物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的致畸、致癌、致突變作用[5-6]。黃曲霉毒素分解酶(aflatoxin detoxification enzyme，ADTZ)是特異性分解黃曲霉毒素的活性物質(zhì)，近年來(lái)微生物酶降解黃曲霉毒素的方法被廣泛關(guān)注，但天然ADTZ由于含量低、活性差，很難從自然界中大量分離[7]。利用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)將ADTZ基因克隆并在不同宿主中進(jìn)行表達(dá)，可以提高ADTZ的產(chǎn)量和活性，對(duì)減輕黃曲霉毒素污染狀況有巨大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。ADTZ基因來(lái)源于真菌假密環(huán)菌(Armillariellatabescens)，表達(dá)產(chǎn)物為假密環(huán)菌的胞內(nèi)酶[8]，具有降解天然黃曲霉毒素的能力，為一個(gè)完整的基因序列，在大腸桿菌和酵母菌中均能表達(dá)出活性特異蛋白[9-11]，但在動(dòng)物益生菌枯草芽孢桿菌中的表達(dá)并無(wú)報(bào)道[12]。枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)是原核生物中重要的表達(dá)系統(tǒng)，具備完整的分泌表達(dá)機(jī)制，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域，是多種酶制劑的主要生產(chǎn)菌種和表達(dá)宿主[13]。本研究通過(guò)前期構(gòu)建的枯草芽孢桿菌整合表達(dá)載體和克隆的ADTZ基因，構(gòu)建ADTZ基因枯草芽孢桿菌整合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌基因組中進(jìn)行整合表達(dá)，并通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)黃曲霉毒素的降解能力，旨在為后續(xù)的霉菌毒素降解酶的開發(fā)和飼料的脫毒研究積累經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和引物

本試驗(yàn)所用生物材料及特征如表1所示，其中引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑

預(yù)染蛋白Marker(MP203)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、1 kb DNA Ladder(MD111)，購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；非預(yù)

染預(yù)染蛋白marker(SM0431)、DNA marker(SM0331)，購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；限制性內(nèi)切酶SacⅡ、BamHⅠ，購(gòu)于美國(guó)Promega公司；溶菌酶(L8120)，購(gòu)于北京所萊寶(Solarbio)生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1(AFB1)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；L-色氨酸(L-Trp)、水解酪蛋白、瓊脂糖等試劑，購(gòu)于洛陽(yáng)博冠商貿(mào)有限公司。

表1 本試驗(yàn)所用生物材料及特征

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ADTZ基因整合載體的構(gòu)建

對(duì)質(zhì)粒PGEM-Kmpgmt和質(zhì)粒Pm-ADTZ分別用SacⅡ、BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳回收，用T4DNA連接酶16 ℃連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coliDH5α)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆單菌落在液體溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行SacⅡ、BamHⅠ酶切鑒定后，測(cè)序。并將重組質(zhì)粒命名為PTM1M2-ADTZ。

1.2.2 野生型枯草芽孢桿菌(B.subtilisLN)感受態(tài)的制備

野生型B.subtilisLN感受態(tài)的制備參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行制備。

1.2.3 重組菌B.subtilisADTZ的構(gòu)建

取出野生型B.subtilisLN感受態(tài)細(xì)胞500 μL，加入10 μg的PTM1M2-ADTZ質(zhì)?；靹?，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)60 min，加入500 μL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 min使菌體復(fù)蘇。取100 μL菌液均勻涂布于含LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14～16 h。觀察野生型B.subtilisLN菌落形態(tài)，用革蘭氏染色進(jìn)行初步檢測(cè)。從平板上挑取重組菌單菌落，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取菌株全基因組，以材料中引物為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，將含有ADTZ的枯草芽孢桿菌陽(yáng)性菌記作B.subtilisADTZ。

1.2.4 重組菌B.subtilisADTZ菌液的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)

將重組菌B.subtilisADTZ菌液按1∶50比例接種于50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)約18 h；以野生型B.subtilisLN為對(duì)照組。菌液低速離心5 min，分別收集上清液和菌體。向菌體中加入5 mL的溶菌酶，用移液器重新制成混懸液，37 ℃培養(yǎng)30 min后取出，將溶液用超聲波破碎儀破碎10 min。分別取B.subtilisADTZ菌液上清液、菌體破碎樣品以及對(duì)照上清、菌體沉淀樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 重組菌對(duì)發(fā)霉玉米的脫毒試驗(yàn)

將500 g左右玉米加水至水分含量20%，室溫(25 ℃)放至能看到部分玉米胚有黑色霉變即為發(fā)霉玉米，將該玉米在65 ℃條件下烘干、粉碎，充分混合均勻后測(cè)定其AFB1含量為63 μg/kg，均勻稱取發(fā)霉玉米樣品9份，每份50 g，分別置于500 mL的錐形瓶中，加入450 mL的蒸餾水，121 ℃滅菌20 min后，將9個(gè)錐形瓶隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組，分別將50 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基、野生型B.subtilisLN菌液(活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)為5.0×109CFU/mL)、B.subtilisADTZ菌液(活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)為4.5×109CFU/mL)接種于上述發(fā)霉玉米中，35 ℃恒溫200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h，每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)束將試驗(yàn)樣品用黃曲霉毒素ELISA檢測(cè)試劑盒在酶標(biāo)儀上檢測(cè)AFB1的含量，并計(jì)算相應(yīng)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 11.5進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 整合載體PTM1M2-ADTZ的分析及鑒定

對(duì)提取到的整合載體PTM1M2-ADTZ進(jìn)行檢測(cè)，采用SacⅡ、BamHⅠ雙酶鑒定，結(jié)果如圖1所示。酶切后，其中2段大小均為2 000 bp左右，與ADTZ基因大小一致；另一段大小為6 000 bp左右，與質(zhì)粒PGEM-Kmpgmt的載體部分大小一致。

2.2 重組菌B.subtilis ADTZ的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鑒定

對(duì)整合構(gòu)建的重組菌B.subtilisADTZ的菌落進(jìn)行觀察，結(jié)果為菌落表面粗糙呈微乳白色，邊緣不齊，中間突起后平鋪，有不規(guī)則的褶皺，與枯草芽孢桿菌菌落形態(tài)一致。通過(guò)革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢結(jié)果為，在1 600×油鏡下觀察，菌體呈藍(lán)紫色，短桿狀，有芽孢，和野生型B.subtilisLN顯微鏡下的形態(tài)相符(圖2)。

2.3 重組菌B.subtilis ADTZ整合結(jié)果的檢測(cè)

提取重組菌B.subtilisADTZ的全基因組，以全基因組為模板，ADTZ基因上下游引物擴(kuò)增目的基因。將提取和擴(kuò)增結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其中泳道4、5、6為重組菌B.subtilisADTZ全基因電泳結(jié)果，電泳發(fā)現(xiàn)明顯的全基因組亮帶，表明成功提取重組菌B.subtilisADTZ全基因組；泳道1、2、3分別為重組菌B.subtilisADTZ的全基因PCR結(jié)果，擴(kuò)增出來(lái)的片

段大小為2 000 bp左右，與ADTZ基因片段大小(2 088 bp)相一致，初步驗(yàn)證ADTZ基因整合到重組菌B.subtilisADTZ基因組中。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果與ADTZ基因序列完全一致。說(shuō)明ADTZ基因完全整合到野生型B.subtilisLN基因組中，成功構(gòu)建了重組菌B.subtilisADTZ。

M1為1 kb marker，由上到下分別為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 kb；M2為DL2000 marker，由上到下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp；泳道1、2、3為PTM1M2-ADTZ的雙酶切鑒定。

M1 is 1 kb marker, from up to bottom are 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 kb, respectively; M2 is DL2000 marker, from up to bottom are 2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp, respectively; lanes 1, 2 and 3 are double enzyme digestion identification of PTM1M2-ADTZ.

圖1整合載體PTM1M2-ADTZ的雙酶切電泳圖

Fig.1 Double digestion digestion electrophoresis pattern of integrated vector PTM1M2-ADTZ

2.4 重組菌B.subtilis ADTZ基因表達(dá)結(jié)果

對(duì)重組菌B.subtilisADTZ進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，收集菌液和菌體，對(duì)菌體進(jìn)行破碎后和野生型B.subtilisLN進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在重組菌B.subtilisADTZ上清液中發(fā)現(xiàn)了約70 ku的蛋白條帶，與ADTZ基因的表達(dá)產(chǎn)物大小一致。而在野生型B.subtilisLN的發(fā)酵液樣品中沒(méi)有這個(gè)大小的蛋白條帶出現(xiàn)。在重組菌B.subtilisADTZ菌體的破碎液樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)較明顯的蛋白條帶。符合枯草芽孢桿菌胞外分泌表達(dá)的特點(diǎn)。根據(jù)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果，初步判定ADTZ基因在重組菌B.subtilisADTZ中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分泌到發(fā)酵液中。

A為B.subtilisADTZ菌落形態(tài)；B為B.subtilisLN染色圖；C為B.subtilisADTZ染色圖。

A isB.subtilisADTZ colony morphology; B is Gram staining result ofB.subtilisLN; C is Gram staining result ofB.subtilisADTZ.

圖2重組菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果

Fig.2 Colony morphology and Gram staining results of recombinant bacteria

M為10 000 bp Marker(MD111)；泳道1～3為B.subtilisADTZ的基因組目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖；泳道4～6為B.subtilisADTZ全基因組電泳圖。

M is DNA Marker (MD111); lanes 1 to 3 are target gene PCR product electrophoresis ofB.subtilisADTZ; lanes 4 to 6 are electrophoresis ofB.subtilisADTZ whole genome.

圖3重組菌B.subtilisADTZ的

全基因組及目的基因電泳圖

Fig.3 Electrophoresis result of whole genome and target gene of recombinedB.subtilisADTZ

2.5 重組菌B.subtilis ADTZ對(duì)發(fā)霉玉米AFB1的降解

按照試劑盒的要求將發(fā)酵試驗(yàn)的各樣品進(jìn)行處理，酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果通過(guò)ELISA分析軟件分析并整理計(jì)算后，如表2所示。從表中可以看出，通過(guò)微生物發(fā)酵發(fā)霉玉米樣品中的AFB1含量均降低，用重組菌B.subtilisADTZ菌種發(fā)酵的試驗(yàn)1組AFB1含量顯著低于其他2組(P<0.05)，AFB1降解率顯著高于試驗(yàn)2組(P<0.05)。用野生型B.subtilisLN菌種發(fā)酵也能降解一部分AFB1，但與重組菌B.subtilisADTZ發(fā)酵相比AFB1含量和AFB1降解率均差異顯著(P<0.05)。

泳道1～3為B.subtilisADTZ發(fā)酵上清液，泳道4為野生型B.subtilisLN發(fā)酵上清液，M為Protein Marker(由上到下分別為116、66、45、35、25、18、14 ku)，泳道5為B.subtilisADTZ菌體破碎樣品。

Lanes 1 to 3 are fermentation supernatant ofB.subtilisADTZ, lane 4 is fermentation supernatant ofB.subtilisLN, M is Protein Marker (from top to bottom are 116, 66, 45, 35, 25, 18, and 14 ku, respectively), lane 5 is bacteria body protein ofB.subtilisADTZ.

圖4重組菌B.subtilisADTZ發(fā)酵液SDS-PAGE圖

Fig.4 The SDS-PAGE picture of recombinedB.subtilisADTZ fermentation broth

3 討 論

3.1 ADTZ基因在不同宿主中的表達(dá)

ADTZ基因來(lái)源于真菌假密環(huán)菌(Armillariellatabescens)，已有報(bào)道ADTZ基因與載體pMAL-c2x重組，導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素在大腸桿菌中的異源融合表達(dá)，并檢測(cè)出活性蛋白[10]。隨后成功克隆并重組表達(dá)了一種具有AFB1轉(zhuǎn)化功能的黃曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase，AFO)[17]，進(jìn)一步驗(yàn)證了ADTZ基因的完整性，使ADTZ基因能夠在真核細(xì)胞畢赤酵母菌中進(jìn)行表達(dá)[11]。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建整合表達(dá)載體使ADTZ基因在動(dòng)物益生菌枯草芽孢桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，在對(duì)動(dòng)物飼料的處理上更具可行性。

表2 重組菌B.subtilis ADTZ對(duì)發(fā)霉玉米AFB1的降解

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

本試驗(yàn)利用的表達(dá)宿主野生型B.subtilisLN[15]，是從羚牛的新鮮糞便中分離篩選得到，進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定，可作為動(dòng)物益生菌添加劑使用。野生型B.subtilisLN作為一種益生菌，不產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)毒素，可改善飼料品質(zhì)，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道的微生物平衡，改善飼料的適口性[18-19]?？莶菅挎邨U菌可將外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過(guò)細(xì)胞的分泌通道直接分泌到細(xì)胞外，簡(jiǎn)化了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的破壁、純化及回收過(guò)程，作用更直接。本試驗(yàn)通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組菌B.subtilisADTZ菌液中有特異性蛋白條帶，且與文獻(xiàn)報(bào)道的ADTZ蛋白條帶大小一致[20]，而在對(duì)照組野生型B.subtilisLN和菌體樣品中未發(fā)現(xiàn)特異性蛋白條帶，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果符合芽孢桿菌胞外分泌表達(dá)的特性。這種特性有利于重組蛋白正確折疊，有效減少包涵體形成，簡(jiǎn)化純化工序[13，21]，從而更有利于ADTZ蛋白的表達(dá)。與真核生物表達(dá)系統(tǒng)相比，枯草芽抱桿菌具有發(fā)酵條件簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短、無(wú)明顯的密碼子偏好性、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[22]。

3.3 降解黃曲霉毒素的微生物及酶

國(guó)內(nèi)外對(duì)降解黃曲霉毒素的微生物及酶做了很多研究。Doyle等[23]發(fā)現(xiàn)，寄生曲霉在生長(zhǎng)14 h后，菌絲能產(chǎn)生一種乳過(guò)氧化物酶降解AFB1，其產(chǎn)物為黃曲霉毒素B2a(AFB2a)的衍生物和另一種水溶性衍生物，該產(chǎn)物的毒性遠(yuǎn)低于AFB1。Motomura等[24]從平菇中分離獲得蛋白大小約為90 ku的降解黃曲霉毒素的酶，通過(guò)熒光含量的測(cè)定，表明這種酶是從真菌假密環(huán)菌的胞內(nèi)提取的一種氧化酶。雷元培等[25]對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行降解黃曲霉毒素的生物活性、抗菌性及抗逆性的研究，結(jié)果表明，發(fā)酵后的上清液中存在解毒活性組分，對(duì)解毒活性物質(zhì)進(jìn)行加熱和蛋白酶K變性處理后，解毒活性顯著降低，表明起解毒作用的活性物質(zhì)是其分泌的一種胞外酶。陸續(xù)的報(bào)道介紹枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)液的降解率達(dá)到70%～80%[26-28]。本試驗(yàn)中采用發(fā)霉玉米作為脫毒對(duì)象，其毒素含量和存在方式較標(biāo)準(zhǔn)液有很大區(qū)別。重組菌B.subtilisADTZ與野生型B.subtilisLN對(duì)黃曲霉毒素均有降解作用，但差異顯著。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌具備降解黃曲霉毒素的能力，但是會(huì)隨著菌株特性不同有較大差異。通過(guò)基因工程的重組表達(dá)會(huì)極大提高野生菌種的降解黃曲霉毒素的能力。

4 結(jié) 論

ADTZ基因可成功整合到野生型B.subtilisLN中，并進(jìn)行了胞外分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性，能有效地降解AFB1。

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Abstract: This experiment was conducted to study the expression and application of aflatoxin detoxification enzyme (ADTZ) gene in Bacillus subtilis (B.subtilis). TheADTZgene was transformed into wild-typeB.subtilisLN genome by constructing an integrated vector ofB.subtilis. The expression of ADTZ protein was detected by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). And the recombinantB.subtiliswere inoculated in moldy corn as fermentation strains for the fermentation experiment, and the content of aflatoxin B1(AFB1) in moldy corn samples was detected to validate the expression effect ofADTZgene inB.subtilis. The results showed that theADTZgene was successively integrated into wild typeB.subtilisgenome by constructing integrative expression vector. The recombinedB.subtiliscould secrete the specific protein and it was detected by SDS-PAGE. The content of AFB1in the fermented moldy corn of recombinedB.subtilishad significant difference with the fermented moldy corn of uninoculated and wild typeB.subtilisLN(P<0.05). It showed that theADTZgene is successfully integrated into wild typeB.subtilisLN and expressed in extracellular. The expressed product has biological activity, and can degrade AFB1effectively.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2018,30(5)：1981-1987]

Keywords: aflatoxin decomposition enzyme; gene recombination;Bacillussubtilis; fermentation