EPO及EPOR在成年牦牛菱腦中的表達(dá)與分布

雷玉琪，劉霞，米曉鈺，杜曉華

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種分子量為30 400 U的肽類激素糖蛋白，其最主要的功能是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的生成[1-2].促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)是無酪氨酸激酶活性的細(xì)胞因子受體超家族的一員，在紅系祖細(xì)胞發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[3-4].研究顯示，當(dāng)EPO與EPOR結(jié)合形成同源二聚體后，可激活許多下游蛋白激酶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，并進(jìn)一步通過核因子啟動(dòng)特異目的基因表達(dá)，從而調(diào)控紅細(xì)胞的增值和分化[5].高海拔低氧環(huán)境能夠刺激血漿中EPO表達(dá)水平的提升，進(jìn)而促進(jìn)紅細(xì)胞的生成以改善缺氧引起的生理反應(yīng)，而紅細(xì)胞增多又可反饋性地抑制EPO表達(dá)，從而控制紅細(xì)胞量精確適應(yīng)機(jī)體需要[6].一般來說，在正常動(dòng)物機(jī)體腦組織中，EPO、EPOR均呈低表達(dá)狀態(tài)，但是當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)，腦內(nèi)EPO、EPOR表達(dá)量會(huì)顯著增加，進(jìn)而促進(jìn)腦損傷的神經(jīng)功能恢復(fù)[7].已有研究表明，當(dāng)人腦受到損傷時(shí)，EPO及其受體在腦中不同區(qū)域和不同細(xì)胞類型中都有表達(dá)，二者相互結(jié)合，可以共同對腦的發(fā)育和成熟發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8-9].

高原環(huán)境作為一種特殊的自然地理?xiàng)l件，其主要特點(diǎn)包括低氣壓、低氧、低溫、大風(fēng)和強(qiáng)輻射，其中低氧是引起急性高原反應(yīng)、特別是急性高原腦損傷的主要致病因素之一[10-12].牦牛(Bosgrunniens)作為適應(yīng)高海拔、高寒氣候的特有物種，常年棲息在海拔3 000～6 000 m的高原地區(qū)[13-14]，經(jīng)過長期自然選擇，對高原低氧環(huán)境形成了獨(dú)特的適應(yīng)結(jié)構(gòu)與生理機(jī)制[15-16].菱腦作為哺乳動(dòng)物腦的重要功能組分，在參與機(jī)體運(yùn)動(dòng)以及調(diào)節(jié)呼吸和循環(huán)等生理功能方面發(fā)揮著無可替代的作用[17]，可以推測，牦牛菱腦在高原低氧環(huán)境中能夠正常發(fā)揮功能，必然也有其特殊的生理機(jī)制.EPO及其受體作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與低氧密切相關(guān)的兩種重要因子，探究其在牦牛腦中表達(dá)及其功能關(guān)聯(lián)對于揭示牦牛中樞神經(jīng)系統(tǒng)在高原低氧環(huán)境下的運(yùn)作機(jī)制具有重要的研究價(jià)值.截至目前，國內(nèi)外尚未有EPO及其受體在牦牛菱腦中表達(dá)與分布的研究報(bào)道.本試驗(yàn)以成年牦牛為研究對象，利用qRT-PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)對EPO及其受體在牦牛菱腦中的表達(dá)與分布特征進(jìn)行研究，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討EPO和EPOR的生理功能及其與牦牛低氧適應(yīng)性之間的關(guān)聯(lián)提供有價(jià)值的理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自甘肅省甘南藏族自治州合作市屠宰場采集健康成年牦牛(3～4歲)5頭，迅速開顱獲取完整腦組織，依據(jù)李云慶等[18]有關(guān)菱腦分區(qū)的描述，對菱腦組織進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)采樣，具體包括延髓、腦橋、小腦半球皮質(zhì)、蚓前葉、蚓后葉及蚓小葉.一部分樣品放入液氮罐中，待返回實(shí)驗(yàn)室再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA；一部分樣品置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片制備和免疫組化染色分析.

1.2 試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：AG RNAex Pro RNA提取試劑、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型 qPCR試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含去除gDNA試劑)、Rox染料均購自北京瑞珍生物技術(shù)有限公司；SP試劑盒(包括試劑1：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，試劑2：封閉用正常山羊血清工作液，試劑3：生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，試劑4：辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)底物顯色試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Rabbit Anti-EPO Polyclonal Antibody(bs-2343R)、Rabbit Anti-EPOR Polyclonal Antibody(bs-1424R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司.

儀器設(shè)備：常規(guī)的手術(shù)器械、恒溫水浴鍋、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、水平電泳槽、電泳儀、移液槍等均為國產(chǎn)儀器，生物組織包埋機(jī)購自金華科迪儀器公司，Olympus-71 型光學(xué)顯微鏡購自日本，高壓鍋購自上海申安公司，高速冷凍離心機(jī)購自韓國HANSON公司，羅氏Light Cycler 96熒光定量儀購自北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司，梯度PCR儀購自美國ABI公司，CBV-1500A型超凈工作臺(tái)購自上海瑞仰公司.

1.3 牦牛菱腦不同區(qū)域組織EPO及EPOR mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

嚴(yán)格按照Trizol法步驟及Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行樣品總RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄，分裝1～2 μL cDNA用超微量分光光度計(jì)(Implen公司，德國)測定濃度及光密度值(optical density,OD值)，其余產(chǎn)物于-20 ℃保存.根據(jù)測定結(jié)果，將-20 ℃保存的cDNA質(zhì)量濃度調(diào)至600 ng/μL，再保存于-20 ℃，用于后續(xù)qRT-PCR的試驗(yàn).

根據(jù)NCBI已收錄的牦牛EPO (GenBank No.EF_374049)、牦牛EPOR(GenBank No.NM_001205601.1)和牦牛內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，GenBank No.NM_173979.3)序列，利用Blast分別比對并選取牦牛EPO、EPOR及β-actin基因完全相同的基因序列，利用 Premier 5.0 對所選序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并送往生工(上海)合成，引物信息列于表1.使用 QuantStudio 5 儀器進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn).反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR Green ProTaq10 μL、上下游引物(0.2 μmol/mL)各0.8 μL、Rox染料0.4 μL、模板cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL.反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 2 min預(yù)熱；95 ℃ 2 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 34 s 退火，40個(gè)循環(huán).為保證目的基因相對表達(dá)量的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)(n=3)，結(jié)果取平均值.

1.5 數(shù)據(jù)處理

表1 qRT-PCR引物信息

1.4 牦牛菱腦不同區(qū)域組織的EPO及EPOR免疫組化染色定位

石蠟切片脫蠟處理后，先用 0.03% H2O2孵育10 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，然后按照免疫組織化學(xué)過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin/peroxidase,SP)法進(jìn)行染色.其中EPO及EPOR抗體(博奧森,北京)稀釋比例為1∶500，4 ℃ 孵育過夜，然后用羊抗兔IgG覆蓋組織于37 ℃烘箱孵育15 min，最后加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)于37 ℃烘箱孵育15 min.以上各步驟之間均使用0.01 mol/L PBS(pH= 7.3)漂洗 3 次，每次5 min.二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色2 min，然后進(jìn)行脫水和透明處理，以中性樹膠封片.應(yīng)用Olympus-71 型光學(xué)顯微鏡(日本)觀察并拍照，所有陰性對照用 PBS取代一抗進(jìn)行孵育，其余步驟和條件相同.

2 結(jié)果與分析

2.1 EPO mRNA在牦牛菱腦不同區(qū)域的表達(dá)

以β-actin基因作為內(nèi)參，對牦牛菱腦不同區(qū)域EPO mRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測.結(jié)果表明(圖1)：EPO mRNA在牦牛菱腦不同區(qū)域中均有表達(dá)，其中蚓前葉表達(dá)量最高，顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，腦橋表達(dá)量次之，也顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，其他依次是：蚓后葉、延髓、蚓小葉、小腦半球皮質(zhì).其中，腦橋、蚓前葉、蚓后葉、延髓、蚓小葉、小腦半球皮質(zhì)彼此間表達(dá)差異顯著(P<0.05)；小腦半球皮質(zhì)EPO mRNA的表達(dá)量最低.

2.2 EPOR mRNA 在牦牛菱腦不同區(qū)域的表達(dá)

以β-actin基因作為內(nèi)參，對牦牛菱腦不同區(qū)域EPOR mRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測.結(jié)果表明：EPOR mRNA 在牦牛菱腦不同區(qū)域中均有表達(dá)，其中蚓小葉表達(dá)量最高，顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，小腦半球皮質(zhì)和蚓前葉表達(dá)量次之，也顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，其他依次是：腦橋、蚓后葉、延髓.其中，蚓前葉、腦橋、小腦半球皮質(zhì)彼此間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，其余各區(qū)域彼此間均差異顯著(P<0.05)；延髓EPOR mRNA的表達(dá)量最低(圖2).

相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05).Date in the same column with the same letter means no significant difference(P>0.05)，with different letter means difference significantly(P<0.05).圖1 菱腦組織EPO mRNA表達(dá)的qRT-PCR 分析Figure 1 qRT-PCR analysis of EPO mRNA level in Rhombencephalon tissues

相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05).Date in the same column with the same letter means no significant difference(P>0.05)，with different letter means difference significantly(P<0.05).圖2 腦組織EPOR mRNA 表達(dá)的qRT-PCR 分析Figure 2 qRT-PCR analysis of EPOR mRNA level in Rhombencephalon tissues

2.3 EPO及EPOR蛋白在牦牛菱腦不同區(qū)域的定位

對牦牛菱腦不同區(qū)域的石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果表明：EPO蛋白免疫陽性著色均定位于細(xì)胞胞質(zhì)中，陰性對照(圖3-a～f)均無表達(dá).延髓和腦橋中的EPO蛋白主要分布于神經(jīng)元胞質(zhì)中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘及軸突無明顯陽性反應(yīng)著色(圖3-A1；圖3-C1).小腦半球皮質(zhì)分子層的籃狀細(xì)胞內(nèi)存在少量陽性表達(dá)；浦肯野氏細(xì)胞的樹突細(xì)胞胞質(zhì)以及顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)中均有較強(qiáng)的EPO陽性表達(dá)(圖3-B1).小腦蚓部各浦肯野氏細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、顆粒細(xì)胞胞質(zhì)均有EPO陽性表達(dá)，其中浦肯野氏細(xì)胞陽性反應(yīng)著色最強(qiáng)；髓質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中亦可見少量EPO陽性表達(dá)(圖3-D1；圖3E-1；圖3-F1)，

對牦牛菱腦不同區(qū)域的石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果表明：EPOR蛋白陽性表達(dá)同EPO蛋白類似，均定位于神經(jīng)元胞質(zhì)中，陰性對照(圖a～f)均無表達(dá)，而在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘及軸突無明顯陽性反應(yīng)著色(圖3-A2；圖3-C2).小腦半球皮質(zhì)分子層的籃狀細(xì)胞內(nèi)存在少量陽性表達(dá)，浦肯野氏細(xì)胞的樹突細(xì)胞胞質(zhì)與顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中亦有較強(qiáng)的EPOR陽性表達(dá)(圖3-B2).小腦蚓部各區(qū)域的浦肯野氏細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、顆粒細(xì)胞胞質(zhì)均有EPOR陽性表達(dá)，其中浦肯野氏細(xì)胞陽性反應(yīng)著色最強(qiáng)；髓質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中亦可見少量EPOR陽性表達(dá)(圖3-D2；圖3-E2；圖3-F2).

3 討論

促紅細(xì)胞生成素(EPO)除了可以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的生成，還可以維持動(dòng)物長時(shí)間處于高原低氧環(huán)境時(shí)腦組織氧化還原穩(wěn)態(tài)，作為保護(hù)腦組織免受缺氧性損傷而發(fā)揮重要作用的一種神經(jīng)保護(hù)性因子[19-20].本研究首次將牦牛菱腦區(qū)域單獨(dú)作為研究對象進(jìn)行EPO表達(dá)的檢測，結(jié)果顯示，EPO基因在牦牛菱腦不同區(qū)域均有表達(dá)，這與陳勤玲等[21]的研究結(jié)果類似，進(jìn)一步說明缺氧時(shí)，EPO在促進(jìn)紅細(xì)胞生成的同時(shí)可以起到加快血液攜氧運(yùn)輸?shù)哪芰?，從而使腦組織免受損傷.牦牛小腦蚓前葉EPO基因的表達(dá)量最高，并顯著高于延髓及小腦其他各區(qū)域(P<0.05)，有研究表明，小腦蚓前葉可以接受來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息并處理關(guān)于機(jī)體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的作用[18]，推測菱腦各區(qū)域在功能銜接過程中，小腦蚓前葉區(qū)域可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.此外，牦牛腦橋EPO基因的表達(dá)量僅次于小腦蚓前葉，有研究表明腦橋在機(jī)體運(yùn)動(dòng)和平衡中發(fā)揮的重要作用[22]，進(jìn)一步說明EPO的表達(dá)可能參與了牦牛在低氧環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)過程.另有文獻(xiàn)顯示，EPO基因的表達(dá)高低與相應(yīng)區(qū)域?qū)θ毖毖醯拿舾行猿守?fù)相關(guān)[23]，結(jié)合本研究結(jié)果，相比于菱腦其他區(qū)域，小腦蚓前葉可能是對缺血缺氧敏感性強(qiáng)的區(qū)域.

A1、A2、a：延髓；B1、B2、b：小腦半球皮質(zhì)；C1、C2、c：腦橋；D1、D2、d：蚓前葉；E1、E2、e：蚓后葉；F1、F2、f：蚓小葉；A1～F1：EPO陽性免疫組織化學(xué)結(jié)果；A2～F2：EPOR陽性免疫組織化學(xué)結(jié)果；a～f：陰性對照；NCB：神經(jīng)元胞體；GL：顆粒層；PCL：浦肯野細(xì)胞層；ML：分子層.A1、A2、a：Medulla oblongata；B1、B2、b：Cerebellum cortex；C1、C2、c：Pons；D1、D2、d：Archicrebellum；E1、E2、e：Neocerebellum；F1、F2、f：Palaeocerebellum；A1～F1：Immunohistochemical results of EPO protein；A2～F2：Immunohistochemical results of EPOR protein；a～f：Negative control；NCB：Neuronal cell body；GL：Granular layer；PCL：Purkinje cell layer；ML：Molecular layer.圖3 EPO、EPOR在菱腦不同區(qū)域組織的免疫組化染色結(jié)果Figure 3 Immunohistochemical results of EPO、EPOR protein in different regions of yak rhombencephalon

促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)是促紅細(xì)胞生成素發(fā)揮作用的重要來源，當(dāng)腦組織處于高寒低氧的環(huán)境時(shí)，同樣是保護(hù)腦組織免受缺氧性損傷而發(fā)揮重要作用的一種神經(jīng)保護(hù)性因子[19-20].本研究結(jié)果顯示，EPOR基因在牦牛菱腦不同區(qū)域均有表達(dá)，說明在缺氧時(shí)，EPOR同樣可以保護(hù)腦組織免受損傷.其中，EPOR在牦牛菱腦蚓小葉的表達(dá)量最高，并顯著高于延髓及小腦其他各區(qū)域(P<0.05)，小腦蚓小葉可以接受來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息并處理維持機(jī)體正常運(yùn)動(dòng)的作用[18]，提示蚓小葉可能是牦牛菱腦在適應(yīng)高寒低氧環(huán)境過程中代謝最旺盛的組織區(qū)域.此外，牦牛蚓前葉EPOR基因的表達(dá)量僅次于蚓小葉，鑒于二者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的解剖位置不同，說明EPOR在腦中發(fā)揮作用可能具有滯后性.

利用免疫組織化學(xué)法對牦牛菱腦不同區(qū)域EPO和EPOR蛋白的分布特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)二者的分布規(guī)律總體一致，這與Jingli等[24]的研究結(jié)果相似.延髓、腦橋中EPO及EPOR蛋白主要分布在神經(jīng)元胞質(zhì)，結(jié)合延髓與腦橋?qū)C(jī)體呼吸、運(yùn)動(dòng)、感覺等生理功能的調(diào)節(jié)作用[18]，說明EPO和EPOR在這些區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用.在小腦半球皮質(zhì)、小腦蚓部等不同區(qū)域的皮質(zhì)層中，越靠近浦肯野氏細(xì)胞的部分，EPO及EPOR陽性表達(dá)量越高，說明分子層在功能上與浦肯野氏細(xì)胞層有關(guān)聯(lián)，此外，EPO及EPOR均主要表達(dá)于浦肯野氏細(xì)胞胞質(zhì)，提示浦肯野氏細(xì)胞作為小腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中唯一的傳出神經(jīng)元對缺氧敏感度最高.

本研究對牦牛菱腦同一區(qū)域中EPO及EPOR在基因和蛋白水平的表達(dá)情況也進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，牦牛菱腦小腦蚓部EPO及EPOR基因的高表達(dá)，與其蛋白表達(dá)定位于浦肯野氏細(xì)胞數(shù)量較多的小腦蚓部區(qū)域呈正相關(guān).在菱腦的腦橋、延髓等區(qū)域，EPO和EPOR在基因及蛋白水平的表達(dá)趨勢不一致，基因水平的表達(dá)較蛋白水平低，但二者差異不顯著，可能與各區(qū)域?qū)θ毖醯拿舾行杂嘘P(guān).總體而言，EPOR在小腦半球皮質(zhì)和蚓小葉的表達(dá)量明顯高于EPO在同一區(qū)域的表達(dá)量，這可能與缺氧時(shí)各區(qū)域發(fā)揮作用的滯后性有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究.同時(shí)，牦牛菱腦中EPOR的表達(dá)量總體上高于EPO的表達(dá)量，這與梁文昌[25]等在肝細(xì)胞癌中的研究一致，這可能與EPOR是作為EPO的受體存在所發(fā)揮的生理功能有關(guān)，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對牦牛菱腦不同區(qū)域EPO及EPOR表達(dá)與分布的研究發(fā)現(xiàn)，EPO及EPOR在小腦蚓前葉的表達(dá)量最高，因此牦牛在低氧狀況下其小腦蚓前葉可能發(fā)揮更重要的功能作用，其具體調(diào)控機(jī)制有待更進(jìn)一步研究.