診療一體化膠質(zhì)瘤靶向納米粒增效聲動力治療及多模態(tài)顯像：體外實驗研究

劉姝伶，郭大靜，冉海濤，鐘毅欣，侯靜馨，王俊銳，張 維*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，重慶 400010；2.超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010)

膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，手術(shù)難以完全切除，加之其滲透增強、滯留較弱及血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)等因素，導(dǎo)致化學(xué)治療藥物不能有效聚集于腫瘤部位[1-2]，手術(shù)切除輔以放射、化學(xué)治療，總體預(yù)后仍不容樂觀?；诩{米醫(yī)學(xué)診療方法已在膠質(zhì)瘤研究中嶄露頭角[3-4]。聲動力治療(sonodynamic therapy, SDT)具有非侵入性、深組織穿透性和高度聚焦性等優(yōu)點，用于治療深部腫瘤應(yīng)用前景廣闊[5-8]；但傳統(tǒng)有機聲敏劑不能有效聚集于腫瘤部位，分子生物利用度低，導(dǎo)致SDT治療效果較低而阻礙其臨床推廣[9]。多模態(tài)顯像是當前影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展趨勢[10]。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]為載體，包載具有腫瘤細胞靶向能力的熒光材料(IR780)和相變材料全氟戊烷(perfluoropentane, PFP)，構(gòu)建靶向診療一體化多模態(tài)顯像納米粒(IR780-PFP@PLGA)，并觀察其體外膠質(zhì)瘤細胞靶向能力、多模態(tài)顯像及體外增效SDT效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 PLGA(分子量12 000 Da，聚合比50∶50，濟南岱罡生物科技有限公司)；IR780、PFP、2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，美國Sigma 公司；單線氧熒光探針(SOSG，美國Thermo Fisher公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，中國碧云天公司)；鈣黃綠素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI，日本同仁公司)。Sonics 630-0435聲振儀，Malvern Zetasizer Nano ZS90粒徑測量儀，Hitachi S-3400N透射電子顯微鏡，島津UV2500 UV-VIS紫外可見分光光度計，低強度聚焦超聲(low-intensity focused ultrasound， LIFU)治療儀，Lecia TCSSP2 激光共聚焦顯微鏡，Visual Sonics Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)，PerkinElmer IVIS Lumina Series Ⅲ活體熒光成像儀，U87細胞株(人腦膠質(zhì)瘤細胞)購自中國上海細胞庫。

1.2 IR780-PFP@PLGA制備 采用雙乳化法。稱取50 mg PLGA和2 mg IR780加入2 ml CH2Cl2溶液并充分溶解，冰浴條件下向混合液中加入200 μl PFP，以聲振儀乳化3 min(50 W，振5 s停5 s)得到初乳，再加入8 ml 4% PVA進行第2次乳化，加入10 ml 2%異丙醇溶液混合均勻后置于磁力攪拌器冰浴下攪拌3 h，至有機溶劑完全揮發(fā)。4℃離心(10 000 rpm，5 min)洗滌數(shù)次，去除未包載的IR780，得到IR780-PFP@PLGA。制備過程中不加IR780或PFP，得到PFP@PLGA或IR780@PLGA。

1.3 基本特征檢測 將制備好的IR780-PFP@PLGA用雙蒸水適當稀釋后，于透射電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡下觀察其形態(tài)、分布特征及內(nèi)部結(jié)構(gòu)等。用粒徑儀檢測其粒徑、分布及表面電位，并監(jiān)測粒徑及電位變化7天。采用紫外分光光度計檢測不同濃度(0、1、2…9、10 μg/ml)IR780的吸光度，并根據(jù)最大吸收峰處吸光度繪制標準曲線。以紫外分光光度計記錄IR780、PFP@PLGA、IR780-PFP@PLGA的吸收光譜。對IR780-PFP@PLGA行低溫離心，直至澄清后取上清液測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算IR780包封率。

1.4 體外多模態(tài)顯像

1.4.1 光聲(photoacoustic, PA)顯像 取200 μl IR780-PFP@PLGA納米粒水溶液加入2%瓊脂糖凝膠模型中，以PA成像系統(tǒng)行全波長掃描(波長680～970 nm，步長5 nm)，尋找其PA顯像最佳激發(fā)波長。將不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml)IR780-PFP@PLGA水溶液(200 μl)加入凝膠模型中，以最佳激發(fā)波長激光輻照后采集PA圖像，定量分析PA信號值。

1.4.2 超聲(ultrasound, US)顯像 取1 ml IR780-PFP@PLGA水溶液(1 mg/ml)置于10 ml EP管內(nèi)，經(jīng)LIFU(2 W/cm2)輻照(0、5、10、15、20 min)后轉(zhuǎn)移至2%凝膠模型中，用US成像系統(tǒng)采集B模式和造影模式超聲聲像圖，以灰度量化分析軟件分析各靶區(qū)聲強值。

1.4.3 熒光(fluorescence, FL)顯像 將IR780-PFP@PLGA配置成不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml)水溶液，分別取200 μl加入96孔板中。用活體熒光成像系統(tǒng)、激發(fā)波長/發(fā)射波長為780 nm/850 nm進行掃描，以系統(tǒng)自帶軟件勾畫ROI，并測量熒光信號強度值。

1.5 細胞毒性及體外尋靶實驗

1.5.1 細胞毒性實驗 將U87細胞接種于96孔板，24 h后棄掉舊培養(yǎng)基，分別加入100 μl不同濃度(0、10…90、100 μg/ml)IR780-PFP@PLGA完全培養(yǎng)基稀釋液，每組3個復(fù)孔，共孵育24 h，以 CCK-8檢測細胞存活率。

1.5.2 體外尋靶實驗 將U87細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后棄掉舊培養(yǎng)基，加入1 ml含DiI標記的PFP@PLGA或IR780-PFP@PLGA(60 μg/ml)完全培養(yǎng)基稀釋液共同孵育(0.5、1.0、1.5 h)。以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗3次，加入100 μl DAPI溶液染色10 min，再以PBS沖洗，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 體外增效SDT效果

1.6.1 SOSG檢測活性氧(reactive oxygen species, ROS) 以SOSG為ROS指示劑，將IR780-PFP@PLGA稀釋至不同濃度(100、200、300、400、500 μg/ml)，各取200 μl與適量SOSG甲醇溶液充分混勻。以強度為2 W/cm2的LIFU輻照1 min后，用M3型多功能酶標儀檢測其熒光強度，激發(fā)波長/發(fā)射波長為488 nm/525 nm。

1.6.2 DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS 將U87細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后隨機分為4組，即對照組、IR780-PFP@PLGA組、LIFU組及IR780-PFP@PLGA+LIFU組；納米粒濃度60 μg/ml，孵育時間1.5 h，LIFU強度2 W/cm2(1 min)。處理后立即加入DCFH-DA探針繼續(xù)孵育30 min，以PBS洗滌3次后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6.3 JC-1法檢測線粒體膜電位 將U87細胞接種于6孔板內(nèi)，分組同1.6.2。行JC-1染色后，以流式細胞儀檢測線粒體膜電位。

1.6.4 Calcein-AM/PI染色觀察細胞存活情況及CCK-8檢測細胞存活率 將U87細胞接種于6孔板內(nèi)，24 h后隨機分為6組，即對照組、LIFU組、IR780-PFP@PLGA組、PFP@PLGA+LIFU組、IR780@PLGA+LIFU組及IR780-PFP@PLGA+LIFU組；納米粒濃度60 μg/ml，孵育1.5 h后，以PBS洗滌3次，LIFU(2 W/cm2，1 min)輻照后加入200 μl Calcein-AM/PI染色15 min，以PBS洗去多余染料，用熒光顯微鏡觀察細胞存活情況。將U87細胞接種于96孔板24 h后分組同上，每組3個復(fù)孔，處理后繼續(xù)孵育1～2 h，采用CCK-8檢測細胞存活率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本特性 IR780-PFP@PLGA在透射電鏡下呈大小均勻的圓形，中心顏色較淡(圖1A)；激光共聚焦顯微鏡下呈均勻紅色顆粒(圖1B)；其粒徑為(240.67±1.30)nm(圖1C)，電位為(-9.50±0.06)mV (圖1D)，且穩(wěn)定性在7天內(nèi)保持良好(圖1E、1F)。IR780最大吸收峰在近780 nm處，吸光度隨濃度升高而增加(圖1G、1H)；紫外吸收光譜顯示其保留了IR780的特征吸收峰(圖1I)，IR780包封率為(92.03±0.42)%。

圖1 IR780-PFP@PLGA基本表征 A.透射電鏡圖； B.激光共聚焦圖； C.粒徑分布圖； D.電位分布圖； E.粒徑穩(wěn)定性； F.電位穩(wěn)定性； G.IR780紫外可見光譜圖； H.IR780標準曲線； I.紫外吸收光譜

2.2 體外多模態(tài)顯像 PA顯像顯示IR780-PFP@PLGA在785 nm處PA信號最強，在此波長激發(fā)下，PA信號隨濃度遞增逐漸增強(圖2A)，呈線性改變(圖2B)。US顯像顯示IR780-PFP@PLGA經(jīng)LIFU輻照后，B模式和造影模式回聲隨時間延長，開始逐漸增強，再逐漸減弱(圖2C)，定量分析結(jié)果證實B模式和造影模式回聲強度均隨時間延長先上升再下降，且最強回聲強度均在15 min(圖2D、2E)。FL顯像顯示隨IR780-PFP@PLGA濃度增加，F(xiàn)L信號強度逐漸增強(圖2F、2G)。

圖2 IR780-PFP@PLGA多模態(tài)顯像 A.體外PA顯像圖； B.不同濃度PA值變化圖； C.不同LIFU輻照時間體外US顯像圖； D.不同LIFU輻照時間B模式回聲強度值變化圖； E.不同LIFU輻照時間造影模式回聲強度值變化圖； F.體外FL顯成像圖； G.不同濃度FL強度值變化圖

2.3 細胞毒性及體外尋靶實驗 濃度在10～60 μg/ml之間的IR780-PFP@PLGA與U87細胞共孵育24 h后，細胞存活率均高于90%(P>0.05，圖3)。共聚焦圖顯示，靶向組(IR780-PFP@PLGA)細胞膜周圍及細胞質(zhì)內(nèi)大量納米粒聚集，且隨時間延長逐漸增多；而非靶向組(PFP@PLGA)僅細胞膜周圍見少量納米粒聚集(圖4)。

圖3 IR780-PFP@PLGA對U87細胞的毒性

圖4 IR780-PFP@PLGA對U87細胞的主動靶向能力(×400)

2.4 體外增效SDT效果 SOSG實驗顯示，經(jīng)LIFU (2 W/cm2，1 min)輻照后，隨IR780-PFP@PLGA濃度增加，產(chǎn)生的ROS逐漸增多 (P<0.05，圖5)。DCFH-DA染色顯示，對照組、IR780-PFP@PLGA組和LIFU組綠色熒光均不明顯，而IR780-PFP@PLGA+LIFU組細胞內(nèi)綠色熒光明顯增強(圖6)。JC-1流式結(jié)果(圖7)顯示IR780-PFP@PLGA+LIFU組線粒體膜電位明顯低于對照組、IR780-PFP@PLGA組及LIFU組(P均<0.05)。Calcein-AM/PI 雙染結(jié)果顯示IR780-PFP@PLGA+LIFU組大量細胞死亡，呈紅色熒光；IR780@PLGA+LIFU組次之；其他各組均可見大量細胞存活，呈綠色熒光(圖8)。CCK-8檢測結(jié)果顯示IR780-PFP@PLGA+LIFU組細胞存活率[(31.12%±3.93)%]低于IR780@PLGA+LIFU組[(55.65%±5.77)%](P<0.05)，二者均低于對照組(P均<0.05)，其余各組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

圖5 不同濃度LIFU輻照后SOSG熒光強度變化

圖6 不同治療組LIFU輻照后細胞內(nèi)DCFH-DA熒光激光共聚焦圖(×400) A.對照組； B.IR780-PFP@PLGA組； C.LIFU組; D.IR780-PFP@PLGA+LIFU組

圖7 不同治療組流式JC-1分析 A.對照組; B.IR780-PFP@PLGA組; C.LIFU組; D.IR780-PFP@PLGA+LIFU組

圖8 不同治療組Calcein-AM/PI雙染熒光顯微鏡圖(×200)

3 討論

SDT利用US觸發(fā)聲敏劑，通過誘導(dǎo)單線態(tài)氧和羥基自由基等高毒性ROS生成，進而產(chǎn)生直接殺傷腫瘤細胞和間接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等一系列抗腫瘤作用，以治療腫瘤[11]。超聲波能量可高度聚焦，并傳遞到大腦深處區(qū)域[12]，使SDT用于治療膠質(zhì)瘤具有巨大潛能。為提高針對顱內(nèi)病變的藥物輸送效率，近年來探索通過超聲靶向微泡破壞(ultrasound-targeted microbubble destruction， UTMD)技術(shù)可逆性開放BBB[13-14]而提高療效。

作為一種聲敏劑，IR780在近紅外區(qū)的吸收較強，可用于PA和FL顯像[15]；同時，作為一種親脂性陽離子，IR780可通過腫瘤細胞線粒體膜電位和有機陰離子轉(zhuǎn)運肽等介導(dǎo)，在不添加任何特異性配體的前提下選擇性聚集于腫瘤部位[16]。PFP經(jīng)超聲輻照可發(fā)生聲致相變，按需生產(chǎn)微泡，不僅可增強US成像，且其聲致相變(acoustic droplet vaporization, ADV)有利于納米粒滲透到腫瘤深部以增強療效。ADV發(fā)生在BBB時，BBB通過UTMD技術(shù)而被可逆性打開，有利于藥物跨越BBB。

本研究利用兼具腫瘤細胞靶向能力和多模態(tài)顯像的聲敏劑IR780及相變材料PFP，制備的IR780-PFP@PLGA大小均勻，分散性好。PFP電子密度較低，透射電鏡顯示納米粒中心顏色較淡；共聚焦顯微鏡下其呈紅色顆粒，紫外吸收光譜顯示IR780-PFP@PLGA保留了IR780的特征吸收峰，提示IR780成功包載于PLGA內(nèi)。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與PFP@PLGA相比，IR780-PFP@PLGA能更多、更快地聚集于U87細胞，提示其具有較強的U87細胞靶向性。US顯像中，經(jīng)LIFU輻照后，隨時間延長，回聲強度先逐漸增強再減弱，表明納米粒在LIFU輻照后逐漸發(fā)生液-氣相變，使US顯像增強；但輻照一定時間后產(chǎn)生的微泡逐漸破裂，導(dǎo)致回聲強度減弱。

DCFH-DA染色顯示IR780-PFP@PLGA+LIFU組綠色較其他組明顯，表明細胞內(nèi)產(chǎn)生了大量ROS。JC-1法檢測顯示IR780-PFP@PLGA+LIFU組細胞線粒體膜電位較其他組明顯降低，提示大量細胞凋亡。Cacein-AM/PI染色及CCK-8檢測中，LIFU組、IR780-PFP@PLGA組及PFP@PLGA+LIFU組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明單獨LIFU、納米粒及ADV效應(yīng)對細胞存活無明顯影響；而IR780-PFP@PLGA+LIFU組較IR780@PLGA+LIFU組細胞死亡數(shù)量明顯增加，提示PFP所致AVD效應(yīng)可增強SDT殺傷效果。

總之，本研究成功構(gòu)建的靶向診療一體化IR780-PFP@PLGA可用于PA/US/FL多模態(tài)顯像，具有較強膠質(zhì)瘤細胞靶向能力和良好的增效SDT效果，有望用于多模態(tài)顯像指導(dǎo)下早期診斷、靶向精準治療腦膠質(zhì)瘤和評估療效。但本實驗對ADV增效SDT具體機制及UTMD技術(shù)對BBB的作用研究不足，有待進一步探討。