頭孢他啶-阿維巴坦對腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌的體外殺菌活性研究

孫 玥， 鄭永貴， 隗志翔， 楊 洋， 吳 湜， 郭 燕， 尹丹丹， 胡付品

頭孢他啶-阿維巴坦（ceftazidime-avibactam）是目前臨床治療碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）、銅綠假單胞菌所致感染的新型酶抑制劑合劑之一。其組分阿維巴坦是一種對A類、C類和部分D類β內(nèi)酰胺酶具有抑制作用的新型β內(nèi)酰胺酶抑制劑，能恢復(fù)頭孢他啶在治療產(chǎn)上述β內(nèi)酰胺酶細(xì)菌所致感染時的抗菌活性。為觀察了解頭孢他啶-阿維巴坦在體外的殺菌作用，課題組進(jìn)行了頭孢他啶-阿維巴坦對腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌臨床分離菌株的時間-殺菌曲線研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌株 6株臨床菌株分別來源于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院、上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、甘肅省人民醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，均為已確定基因型與耐藥表型的保存菌株。其中，腸桿菌科細(xì)菌4株，包括肺炎克雷伯菌2株（表達(dá)blaESBL：17-W37-40；表達(dá)blaKPC：17-R01-39）、大腸埃希菌2株（表達(dá)blaESBL：17-W09-26；表達(dá)blaKPC：18-W01-29），銅綠假單胞菌2株（碳青霉烯類敏感：17-W07-23；碳青霉烯類耐藥：17-W48-62）。肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 700603和銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所保存菌種。

1.1.2 受試藥物與培養(yǎng)基 受試藥物溶液由阿維巴坦對照品粉劑（藥明康德），頭孢他啶標(biāo)準(zhǔn)品粉劑（中國藥品生物制品檢定所）配制。Mueller-Hinton（MH）瓊脂和營養(yǎng)瓊脂為英國OXIOD公司商品；陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯（CAMHB）為美國BD公司商品。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗(yàn)和最低殺菌濃度（MBC）測定 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）M100-S28和CLSI文件M26-A標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，采用肉湯微量稀釋法對受試菌進(jìn)行頭孢他啶-阿維巴坦藥物敏感性試驗(yàn)并進(jìn)行結(jié)果判讀。判讀最低抑菌濃度（MIC）結(jié)果后，對所有未見細(xì)菌生長孔中的菌藥混合液取0.1 mL加至無藥營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于35℃溫箱過夜培養(yǎng)。若受試菌在平板上生長的菌落數(shù)≤0.1%接種菌量，即可認(rèn)為該藥物濃度為MBC。MBC/MIC≤4時，認(rèn)為該藥物具殺菌作用[3]。

1.2.2 時間-殺菌曲線試驗(yàn) 參考CLSI文件M26-A等[2,4]所述方法對受試標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離的共8株菌株進(jìn)行時間-殺菌曲線試驗(yàn)。

受試菌菌液制備用無菌接種環(huán)輕輕接觸3個經(jīng)純分單菌落的頂部，然后將接種環(huán)上的受試菌接種于CAMHB中過夜增菌培養(yǎng)，次日按0.2%接種量重懸于CAMHB，37℃ 150 r/min震蕩孵育2 h后，稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋⒃贑AMHB中進(jìn)一步1∶1 000稀釋得到受試菌菌液。

抗菌藥物制備依據(jù)受試菌的MIC，使用頭孢他啶儲備液對倍稀釋制備得0.5MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC、32MIC系列濃度，并加入固定濃度的阿維巴坦溶液使其阿維巴坦終濃度為4 mg/L。

取一管未加抗生素的菌液作為生長對照，并對其進(jìn)行菌落計數(shù)，記錄為0 h（t0）的菌落數(shù)。系列濃度藥物與受試菌液混合，于37℃，150 r/min條件下震蕩溫育。在2、4、6、10、24 h 5個時間點(diǎn)對所有管取樣0.1 mL，經(jīng)相應(yīng)10倍、100倍稀釋后加至無藥營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面并使用一次性涂布棒涂勻。將所有平板置于35℃溫箱過夜培養(yǎng)18 h，次日進(jìn)行菌落計數(shù)以繪制時間-殺菌曲線。

以細(xì)菌存活數(shù)為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，以t0點(diǎn)為抗菌藥物溶液加入受試菌菌液時間點(diǎn)，使用繪圖軟件Prisim繪制時間-殺菌曲線。細(xì)菌存活數(shù)下降≥3 lgCFU/mL值，則認(rèn)為頭孢他啶-阿維巴坦在該濃度下對受試菌有殺菌作用。

2 結(jié)果

2.1 MIC與MBC

頭孢他啶-阿維巴坦對8株受試菌的MIC與MBC結(jié)果如表1所示。受試腸桿菌科細(xì)菌MIC范圍為0.25～1 mg/L，銅綠假單胞菌MIC范圍為1～2 mg/L，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，所有受試菌均對頭孢他啶-阿維巴坦敏感。頭孢他啶-阿維巴坦對腸桿菌科細(xì)菌的MBC均在相應(yīng)MIC的4倍及以下，具有良好的殺菌效果。而頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌的殺菌效果不如腸桿菌科細(xì)菌，盡管受試菌17-W07-23與17-W48-62對頭孢他啶-阿維巴坦敏感，其MBC/MIC＞4。

2.2 殺菌曲線試驗(yàn)

2.2.1 腸桿菌科細(xì)菌 頭孢他啶-阿維巴坦對受試的兩種基因型（blaESBL和blaKPC）的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌及質(zhì)控菌株均具有較強(qiáng)的殺菌效果，殺菌曲線見圖1～3。在其相應(yīng)的4倍及以上MIC藥物濃度時，腸桿菌科受試菌殺菌曲線下降趨勢與時間成正相關(guān)，且不隨藥物濃度改變有明顯改變。所有菌株在0～6 h內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)均減少了≥3 lgCFU/mL，殺菌率達(dá)99.9%。當(dāng)藥物濃度小于4 MIC時，盡管在部分時刻殺菌率可達(dá)99.9%，但或?qū)l(fā)生未殺滅細(xì)菌再次增殖的現(xiàn)象，（t+24）h可觀察到大量存活細(xì)菌。在1MIC藥物濃度下，大腸埃希菌blaESBL陽性株17-W09-26于（t+4） h附近，肺炎克雷伯菌blaKPC陽性株17-R01-39及質(zhì)控菌肺炎克雷伯菌ATCC 700603于（t+6）h附近開始出現(xiàn)曲線反跳；在2MIC藥物濃度下，肺炎克雷伯菌ATCC 700603于（t+10）h附近開始出現(xiàn)曲線反跳。

表1 受試菌株最低抑菌濃度與最低殺菌濃度Table 1 Minimum inhibitory and bactericidal concentrations of ceftazidime-avibactam for the strains tested

圖1 頭孢他啶-阿維巴坦對肺炎克雷伯菌臨床分離株17-R01-39和17-W37-40的時間-殺菌曲線Figure 1 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of K. pneumoniae 17-R01-39 and 17-W37-40

圖2 頭孢他啶-阿維巴坦對大腸埃希菌臨床分離株17-W09-26和18-W01-29 的時間-殺菌曲線Figure 2 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of E. coli 17-W09-26 and 18-W01-29

2.2.2 銅綠假單胞菌 頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌受試菌18-W01-29與質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853殺菌效果較好，但對受試菌17-W07-23殺菌效果不佳，殺菌曲線見圖3、4。受試菌18-W01-29與質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853在藥物濃度大于4 MIC時，所有試驗(yàn)菌株的存活細(xì)胞數(shù)呈時間依賴性減少，4條曲線基本重合，殺菌率達(dá)99.9%。與腸桿菌科細(xì)菌類似，當(dāng)藥物濃度小于4 MIC時，頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌的殺菌曲線存在反跳現(xiàn)象。此外，臨床分離株17-W07-23各濃度曲線均出現(xiàn)反跳，在32MIC高濃度頭孢他啶-阿維巴坦條件下仍無法被有效殺滅。

圖3 頭孢他啶-阿維巴坦對標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603和銅綠假單胞菌ATCC 27853的時間-殺菌曲線Figure 3 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against reference strains K.pneumoniae ATCC 700603 and P.aeruginosa ATCC 27853

圖4 頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌臨床分離株17-W07-23和17-W48-62的時間-殺菌曲線Figure 4 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of P. aeruginosa 17-W07-23 and 17-W48-62

3 討論

自上世紀(jì)90年代起，全球范圍內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各菌屬耐碳青霉烯類細(xì)菌[5-7]。耐碳青霉烯類細(xì)菌的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了碳青霉烯類藥物的療效，其引起的侵襲性感染與病死率高度相關(guān)。如今，世界衛(wèi)生組織已將CRE及耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌列為首批最為重要的病原體，新型抗菌藥物的研發(fā)與投入使用成為了當(dāng)前的迫切需求。碳青霉烯酶屬于β內(nèi)酰胺酶的一種，是CRE最主要的耐藥機(jī)制之一[8]。故將新型β內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦與對銅綠假單胞菌有著抗菌活性優(yōu)勢的第三代頭孢菌素頭孢他啶聯(lián)用，此聯(lián)合對CRE及耐碳青霉烯類的銅綠假單胞菌均具有良好療效。

國內(nèi)外一些針對頭孢他啶-阿維巴坦的體外抗菌活性研究進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)與分析[9-10]，阿維巴坦是一種對廣譜β內(nèi)酰胺酶以及A類、C類和部分D類β內(nèi)酰胺酶具有活性的新型β內(nèi)酰胺酶抑制劑，可有效提高多重耐藥和泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌對頭孢他啶的敏感率。本研究將體外MBC作為靜態(tài)參考指標(biāo)，使用時間-殺菌曲線方法對0.5～32 MIC系列濃度下頭孢他啶-阿維巴坦的體外殺菌效果進(jìn)行動態(tài)評估。受試菌MBC≤4 MIC時[3]，認(rèn)為頭孢他啶-阿維巴坦對其具有較好的殺菌作用。體外殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，頭孢他啶-阿維巴坦對產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶和KPC酶的腸桿菌科細(xì)菌及部分敏感銅綠假單胞菌具有良好的殺菌活性。殺菌曲線與相應(yīng)的MBC結(jié)果基本一致。對于多數(shù)菌株，頭孢他啶-阿維巴坦藥物濃度為0.5、1 MIC時不具有殺菌效果，而藥物濃度≥4 MIC時，各濃度曲線基本重合，殺菌效果顯著。Zhang等[11]的研究同樣顯示，頭孢他啶-阿維巴坦對產(chǎn)KPC酶、部分OXA酶的肺炎克雷伯菌具有顯著的殺菌效果。該研究還表明，頭孢他啶-阿維巴坦與氨曲南聯(lián)用對產(chǎn)NDM酶的肺炎克雷伯菌有較強(qiáng)的協(xié)同殺菌作用 。

本研究顯示，當(dāng)頭孢他啶-阿維巴坦藥物濃度低于菌株相應(yīng)的MBC時，受試菌存活細(xì)菌數(shù)在短時間下降后再次增多，殺菌曲線出現(xiàn)反跳。對于這種反跳現(xiàn)象，Keepers等[4]研究認(rèn)為，β內(nèi)酰胺酶復(fù)合制劑殺菌曲線的反跳可能與β內(nèi)酰胺酶抑制劑的濃度以及不同菌株不同的β內(nèi)酰胺酶表達(dá)水平相關(guān)。文獻(xiàn)報道對大部分菌株而言，當(dāng)阿維巴坦用量大于4 mg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度時，頭孢他啶-阿維巴坦的抗菌效果不隨阿維巴坦的濃度增加而明顯增加[12-13]，但將阿維巴坦?jié)舛日{(diào)整為8 mg/L或在6 h時加入額外的阿維巴坦溶液可抑制個別菌株24 h時的曲線反跳[4]。

總之，頭孢他啶-阿維巴坦對本實(shí)驗(yàn)中多重耐藥及泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌具有較好的體外殺菌活性，其抗菌作用與和細(xì)菌接觸的時間在一定時間內(nèi)呈正相關(guān)，屬于時間依賴性抗生素。如若劑量不足，其殺菌曲線仍可能在幾小時后出現(xiàn)反跳，提示在臨床治療中可采取適當(dāng)縮短給藥間隔的方式維持其血藥濃度以達(dá)到更好的療效。