Toll樣受體2和相關(guān)炎癥因子在金黃色葡萄球菌致慢性骨髓炎中的作用

王馥香， 徐東克， 王成昆， 李 靜， 楊 杰

骨髓炎是由于創(chuàng)傷、局部缺血或異物的存在，引起大量細(xì)菌的侵襲所致的進(jìn)行性炎癥反應(yīng)[1-2]。抗菌治療和外科清創(chuàng)術(shù)是骨髓炎治療的主要方式[3]。但這些方式可能會延長患者住院時(shí)間，并且增加患者的醫(yī)療費(fèi)用。盡管外科手術(shù)和藥物治療取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但骨髓炎的治療仍十分困難，臨床治療時(shí)需綜合考慮宿主因素和解剖因素，這對外科治療和藥物治療均提出了挑戰(zhàn)。本研究探究分析了Toll樣受體2（TLR2）和相關(guān)炎癥因子在金黃色葡萄球菌感染所致的慢性骨髓炎發(fā)展中的作用，為后期進(jìn)一步探究骨髓炎的發(fā)病機(jī)制，并研發(fā)金黃色葡萄球菌所致慢性骨髓炎的針對性藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般臨床資料

收集2015年5月—2019年7月，至南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院治療的金黃色葡萄球菌感染所致慢性骨髓炎患者60例，作為研究組。同時(shí)收集60例健康體檢者，作為對照組。研究組患者年齡30～60歲，平均（45.5±5.5）歲。對照組年齡29～58歲，平均（46.2±4.5）歲。兩組入選者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡25～60歲；②患者均表現(xiàn)局部疼痛、紅腫和竇道形成，并經(jīng)X線攝片診斷為慢性骨髓炎，并取傷口分泌物進(jìn)行致病菌培養(yǎng)和鑒定，確診為金黃色葡萄球菌感染；③無其他重大疾??；④意識清晰，自主簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性/亞急性骨髓炎；②患有其他重大疾?。虎叟R床數(shù)據(jù)不全或治療后失聯(lián)；④無法自主簽署知情同意書。

小鼠MC3T3-E1細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923由本院檢驗(yàn)科提供。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測蛋白表達(dá)水平 使用人TLR2檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，中國）檢測受檢者血清和細(xì)胞上清液中的TLR2水平。使用人白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒（北京方程生物，中國）檢測受檢者血清和細(xì)胞上清液中的IL-6水平。使用人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（北京方程生物，中國）檢測受檢者血清和細(xì)胞上清液中的TNF-α水平。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉-PBS孵育PVDF膜1.5 h，然后使用相應(yīng)一抗于4℃孵育過夜，次日使用對應(yīng)二抗孵育1 h，然后使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天，中國）顯影。

1.2.3 RT-PCR法檢測mRNA水平 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用一步法RT-PCR試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，中國）進(jìn)行RTPCR檢測TLR2 mRNA水平，所用正向引物為“5’-CACTGGGGGTAACATCGCTT-3’”,反 向 引物為“5’-GCTGACTTCACTACGGGCA-3’”。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（Invitrogen，USA）檢測細(xì)胞凋亡。使用流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD Bioscience USA）對樣品進(jìn)行凋亡測定，并使用Flowjo軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 慢性骨髓炎患者血清TLR2表達(dá)和炎癥因子水平

比較研究組患者和對照組血清TLR2表達(dá)和炎癥因子IL-6和TNF-α水平。與健康體檢者相比，慢性骨髓炎患者血清TLR2、IL-6和TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 金黃色葡萄球菌感染促使細(xì)胞凋亡

使用80 MOI金黃色葡萄球菌感染小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，在感染前（0 h）和感染后6 h、12 h、24 h、36 h和48 h檢測細(xì)胞凋亡情況，并設(shè)置未感染的小鼠MC3T3-E1細(xì)胞為未感染組。

表1 慢性骨髓炎患者血清TLR2表達(dá)和炎癥因子水平Table 1 Serum levels of TLR2 and inflammatory factors in patients with chronic osteomyelitis

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌感染顯著促使小鼠MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，且與時(shí)間呈正相關(guān)。感染12 h時(shí)，感染組細(xì)胞凋亡比例 （19.5%）顯著高于未感染組（2.6%），P＜0.05，且在48 h時(shí)，感染組細(xì)胞凋亡比例達(dá)到50.5%，顯著高于未感染組（3.5%），P＜0.05。此外，金黃色葡萄球菌感染后，細(xì)胞促凋亡基因bax表達(dá)水平顯著升高，抗細(xì)胞凋亡基因bcl-2表達(dá)量顯著下降，且表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，進(jìn)一步證實(shí)了金黃色葡萄球菌對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響。見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌感染促使細(xì)胞凋亡Figure 1 Staphylococcus aureus infection promotes cell apoptosis

2.3 金黃色葡萄球菌感染時(shí)TLR2和炎癥因子的變化

分別檢測經(jīng)80 MOI金黃色葡萄球菌感染前和 感 染 后6 h、12 h、24 h、36 h、48 h的 小 鼠MC3T3-E1細(xì)胞的TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)。

金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞后，顯著提高了TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），見圖2，并促進(jìn)了炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)（P＜0.05），見圖3。

2.4 抑制 TLR2 可降低金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的IL-6 和 TNF-α 表達(dá)

為探究TLR2在金黃色葡萄球菌感染中所起的作用，實(shí)驗(yàn)使用TLR2阻斷抗體孵育80 MOI金黃色葡萄球菌感染的小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，并設(shè)置未處理組作為對照。處理24 h后，檢測細(xì)胞的TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，比較兩組細(xì)胞中的TLR2 表達(dá)水平變化。

經(jīng)TLR2阻斷抗體處理的細(xì)胞中的TLR2 表達(dá)水平顯著低于未處理組（P＜0.05），見圖4。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)IL-6 和 TNF-α表達(dá)水平也顯著低于未處理組（P＜0.05），見圖5。

圖2 金黃色葡萄球菌感染增強(qiáng)細(xì)胞TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)Figure 2 Staphylococcus aureus infection enhances the expression of TLR2 protein in cells*P < 0.05 compared with the baseline level before infection. TLR2, Toll-like receptor 2.

圖3 金黃色葡萄球菌感染促進(jìn)TNF-α和IL-6的表達(dá)升高Figure 3 Staphylococcus aureus infection stimulates the expression of TNF-α and IL-6

圖4 TLR2阻斷抗體處理抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞TLR2 表達(dá)Figure 4 TLR2 blocking antibody treatment inhibits the expression of TLR2 induced by Staphylococcus aureus in cell experiments

圖5 抑制 TLR2 降低金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的IL-6 和 TNF-α表達(dá)Figure 5 Blocking TLR2 reduces the expression of IL-6 and TNF-α induced by Staphylococcus aureus

3 討論

慢性和復(fù)發(fā)性感染是臨床的嚴(yán)重問題，特別是骨組織的細(xì)菌感染,更傾向于演變成慢性病，增加治療難度[4]。根據(jù)細(xì)菌感染骨組織的途徑，可以將不同類型的骨髓炎進(jìn)行分類，例如血腫性骨髓炎，這是由于創(chuàng)傷后局部感染的持續(xù)蔓延或足部潰瘍引起的[5]。所有不同類型的骨髓炎均可發(fā)展為慢性和復(fù)發(fā)性病程，在感染后數(shù)周至數(shù)月仍有癥狀。金黃色葡萄球菌是臨床骨髓炎中最常見的致病菌之一。本研究發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌所致慢性骨髓炎中，患者血清TLR2水平和炎癥因子（IL-6、TNF-α）水平均顯著升高。

為了進(jìn)一步探究TLR2所起的作用，研究使用金黃色葡萄球菌感染小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用顯著，并顯著提高了TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)了炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)。

TLR信號傳導(dǎo)是啟動針對人類和動物中入侵微生物的宿主免疫防御機(jī)制的研究最充分的途徑之一[6]。TLR是先天性和適應(yīng)性免疫的重要介質(zhì)，可對多種微生物配體和宿主在感染過程中產(chǎn)生的“危險(xiǎn)信號”做出反應(yīng)[7-8]。已有的研究數(shù)據(jù)表明，表達(dá)的TLR具有誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生，或激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（NF-kB、p38和ERK）的功能[9-10]。本研究為證實(shí)在金黃色葡萄球菌感染中TLR2對炎癥因子IL-6和TNF-α的調(diào)控作用，采用了TLR2阻斷抗體處理感染后的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR2 蛋白的減少顯著降低了IL-6和TNF-α的表達(dá)。

綜上所述，本課題探究了TLR2在金黃色葡萄球菌所致骨髓炎發(fā)展中所起的作用，證實(shí)在金黃色葡萄球菌所致的慢性骨髓炎患者中血清TLR2、IL-6和TNF-α水平都顯著升高，同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)TLR2在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起的作用，并在這一過程中TLR2的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，且呈正反饋?zhàn)饔茫瑸檫M(jìn)一步探究骨髓炎的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)針對性藥物提供了理論基礎(chǔ)。