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    白藜蘆醇抗切除卵巢大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松的作用研究

    2021-05-31 10:11:30游麗娟葸慧榮高玉海楊芳芳陳克明
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:藿苷白藜蘆醇骨密度

    游麗娟 葸慧榮 高玉海 楊芳芳 陳克明*

    1.甘肅省婦幼保健院健康管理中心,甘肅 蘭州 730050 2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院骨研所,甘肅 蘭州 730050

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病[1]。絕經(jīng)后的婦女由于雌激素缺乏往往會(huì)發(fā)生骨丟失和骨質(zhì)量下降現(xiàn)象從而引發(fā)骨折甚至死亡[2],目前臨床上關(guān)于OP的治療主要采用西藥雙膦酸鹽、甲狀旁腺類等藥物,長期服用價(jià)格昂貴、副作用大,因此,急需尋找副作用小、療效好的中藥替代藥物從而降低用藥成本[3]。

    白藜蘆醇是一種結(jié)構(gòu)類似雌激素己烯雌酚的天然多酚類化合物,廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[4]。研究顯示,白藜蘆醇在體外與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體,類似植物雌激素,發(fā)揮抗OP作用[5]。據(jù)報(bào)道,白藜蘆醇可調(diào)節(jié)血脂,具有抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤等諸多生物學(xué)活性[4-5]。淫羊藿苷是中草藥淫羊藿的主要有效成分,諸多文獻(xiàn)證明,淫羊藿苷具有穩(wěn)定的抗OP作用,目前已有開發(fā)的淫羊藿總黃酮膠囊在我國上市用于治療原發(fā)性O(shè)P[6-7]。雖然也有白藜蘆醇對去卵巢大鼠發(fā)生OP影響報(bào)道,但這些文章大多發(fā)表于幾年前,其評價(jià)手段不全面,仍缺乏綜合系統(tǒng)性評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)以去卵巢大鼠為OP模型,白藜蘆醇為目標(biāo)研究藥物,淫羊藿苷為陽性對照藥物,利用骨密度、生物力學(xué)、血清生化指標(biāo)、骨形態(tài)計(jì)量檢測等方法全面綜合探討白藜蘆醇抗OP作用,以期能為中醫(yī)藥白藜蘆醇更好地運(yùn)用于臨床OP的治療提供依據(jù)。

    1 主要儀器、試劑盒與藥品

    LUNAR Prodigy雙能X線骨密度測量儀(GE公司,美國),AG-IS生物力學(xué)萬能試驗(yàn)機(jī)(島津公司,日本),SP1600硬組織切片機(jī)(LEICA公司,德國),BX51倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS,日本);EPOCH酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司,美國)。骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(IDS公司,丹麥,Lot分別為:AC-12F1,SB-TR102);白藜蘆醇(純度≥98%,寶雞辰光生物公司,中國,Lot:20140207);淫羊藿苷(純度≥98%,寶雞辰光生物公司,中國,Lot:20170125-2)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

    6月齡SPF級Wistar雌性大鼠40只,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院下屬蘭獸研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(甘)2014-0006-152)。大鼠造模前按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,每組10只,分別為假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)、淫羊藿苷組(I)及白藜蘆醇組(R)。除Sham組切除卵巢體積相同脂肪外,其余各組均由背部行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后及時(shí)青霉素粉末涂抹傷口并肌肉注射青霉素消炎,后連續(xù)注射青霉素3 d繼續(xù)消炎。休整1周后開始灌胃給藥。I組給藥劑量為25 mg/(kg·d),R組給藥劑量為8.4 mg/(kg·d),Sham組和OVX組均給予等體積蒸餾水(1 mL/200 g),灌胃劑量依據(jù)來源于前期實(shí)驗(yàn)[8]。灌胃時(shí)間為每周一至周六早上9:00~11:00,每天灌胃1次。每2周稱1次大鼠體質(zhì)量,并根據(jù)體質(zhì)量對灌胃劑量進(jìn)行微調(diào)整。每4周檢測一次全身骨密度,待組間全身骨密度出現(xiàn)顯著性差異,禁食禁水24 h后處死所有大鼠并取材。

    2.2 骨密度檢測

    用10%水合氯醛3 mL/kg的劑量腹腔注射逐個(gè)麻醉大鼠,后放置于雙能X線骨密度儀治療床上檢測全身骨密度值;大鼠處死后,將分離的右側(cè)股骨和椎骨分別置于骨密度儀上檢測其各自離體骨密度值。

    2.3 生物力學(xué)檢測

    將分離的左側(cè)股骨置于AG-IS萬能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn),跨距16 mm,加載速度10 mm/min,計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄最大載荷和彈性模量的值。將分離的大鼠第5腰椎骨(L5)進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)開始前將椎骨用2000目砂紙打磨成近似上下兩平面平行的圓柱體,打磨后的樣本垂直放于不銹鋼金屬平臺(tái)正中央,逐漸加載壓力,加載速度為2 mm/min,記錄最大載荷和彈性模量的值。

    2.4 血清生化指標(biāo)分析

    麻醉后的大鼠剝離腹主動(dòng)脈抽取血樣后在室溫下靜置30 min,然后5 000 r/min離心8 min,將上層血清分裝于100 μL小管并做好分組標(biāo)記,凍存于-80 ℃待檢測。采用骨鈣素(osteocalcin,OC)、酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)ELISA試劑盒分別檢測血清OC和TRACP-5b的OD值,按說明書制作各自標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各自的濃度,單位分別為ng/mL和U/L。

    2.5 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

    新鮮分離的左側(cè)脛骨用4%多聚甲醛固定后4周后,每組取6只軟骨組織剝離完整的脛骨,切取帶近心干骺端1.5 cm骨組織,用樹脂包埋于直徑為2 cm高度為8 cm的玻璃瓶中。待樹脂冷卻凝固后取出包埋塊置于LEICA SP1600鋸式切片機(jī)切成約50 μm的骨片,封固,砂紙打磨,然后進(jìn)行品紅-苦味酸(van gilson,VG)染色,用IPP6.0軟件分析系統(tǒng)選擇各組圖片并導(dǎo)入軟件,并根據(jù)圖片分辨率選擇對應(yīng)標(biāo)尺,后運(yùn)用測量工具中長度、面積、顏色等選取功能分析骨小梁相關(guān)參數(shù),包括Tb.N、Tb.Th、Tb.SP和BV/TV等,并觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 對大鼠體質(zhì)量及器官指數(shù)的影響

    實(shí)驗(yàn)期間大鼠正常進(jìn)水進(jìn)食,精神狀態(tài)良好。如圖1所示,隨時(shí)間變化大鼠體質(zhì)量變化不大,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如圖2所示,各組間大鼠的肝、脾、肺、腎的器官指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。OVX組大鼠子宮系數(shù)顯著低于Sham組(P<0.05),I組和R組子宮系數(shù)顯著高于OVX組(P<0.05)。子宮組間差異說明大鼠切除卵巢后由于雌激素缺乏,子宮發(fā)生萎縮,子宮系數(shù)降低,而I和R組均可抑制此作用的發(fā)生。

    圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.1 The changing curve of the body weight of rats

    圖2 各組大鼠主要臟器的器官指數(shù)Fig.2 The organ index of main organs in rats注:與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與OVX組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    3.2 對大鼠骨密度的影響

    如表1所示,4周全身骨密度結(jié)果顯示,各組間骨密度變化不大,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);8周全身骨密度結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組大鼠全身骨密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與OVX組相比,I組、R組全身骨密度均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如表2所示,通過檢測椎骨和左側(cè)股骨骨密度,結(jié)果呈現(xiàn)與全身骨密度相同的趨勢(P<0.01)。R組與I組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),只是平均值略低于I組,這一結(jié)果表明R可預(yù)防骨密度丟失。

    表1 各組大鼠全身骨密度檢測結(jié)果

    表 2 各組大鼠離體骨密度檢測結(jié)果

    3.3 對大鼠生物力學(xué)的影響

    如表3、4所示,OVX組與Sham組相比,大鼠股骨、椎骨的最大載荷和彈性模量均顯著降低(P<0.01);I、R組與OVX組相比,股骨、椎骨的最大載荷、彈性模量均顯著增加(P<0.01)。I與R相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果表明去卵巢后大鼠的生物力學(xué)性能下降,而I和R組都能抑制這一下降趨勢。R組與I組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),平均值略低于I組,說明R也可增加去勢大鼠生物力學(xué)性能。

    表 3 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    表4 實(shí)驗(yàn)大鼠椎骨壓縮試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The compression test results of the vertebrae

    3.4 對大鼠血清生化指標(biāo)的影響

    如表5所示,OVX組與Sham組相比,血清中OC含量降低而TRACP-5b含量增加(P<0.01);I、R組與OVX組相比,OC含量均顯著增加而TRACP-5b含量均顯著下降(P<0.01)。這一結(jié)果表明I、R組都可通過促進(jìn)骨形成抑制骨吸收來預(yù)防切除卵巢引起的骨丟失。I和R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),只是平均值略低于I組,說明R也可改變骨形成和骨吸收相關(guān)的分子機(jī)制。

    表5 大鼠血清中OC、TRACP-5b含量

    3.5 對大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響

    如圖3所示,OVX組與Sham組相比,骨小梁數(shù)量和致密性明顯降低,且骨小梁分離度明顯變寬;I組、R組與OVX組相比,骨小梁數(shù)量、網(wǎng)狀交聯(lián)度明顯增加,骨小梁分離度明顯減小,連續(xù)性好。I與R肉眼識(shí)別無明顯差別。這一結(jié)果表明,I、R藥物均可通過提高骨組織密度而增加骨質(zhì)量。如表6所示,OVX與Sham組相比,其骨小梁數(shù)量和面積百分比明顯降低而骨小梁分離度明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);I組和R組與OVX相比,其其骨小梁數(shù)量和面積百分比明顯升高而骨小梁分離度明顯降低,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。R與I相比,各指標(biāo)相差不大,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖3 不同干預(yù)組大鼠脛骨近心干骺端骨組織形態(tài)學(xué)比較(40×)Fig.3 Morphological comparison of proximal tibial metaphysis among different intervention groups (40×)

    表6 各組大鼠脛骨近心干骺端組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)比較Table 6 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

    4 討論

    OP作為一種老年性疾病,絕經(jīng)后婦女是主要分布人群常常會(huì)因骨質(zhì)量嚴(yán)重下降喪失生活自理能力甚至縮短壽命,這給國家及家庭財(cái)力、人力造成了巨大的負(fù)擔(dān)[9]。雌激素被認(rèn)為是治療絕經(jīng)后OP最有效的藥物。但使用雌激素后會(huì)引起一系列副作用,如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心血管等疾病的發(fā)生等[10]。淫羊藿苷作為陽性對照藥物,其來源于中草藥淫羊藿,以其為主要成分開發(fā)的淫羊藿苷總黃酮膠囊早已在我國南方上市,但其原料藥物的稀缺目前仍不能在全國普及。尋找能代替雌激素的更多中草藥以此降低用藥成本及副作用無疑會(huì)給廣大OP患者帶來福音。OVX大鼠模型很好地模擬了絕經(jīng)后婦女的OP模型,是OP研究的經(jīng)典動(dòng)物模型,目前最為常用。

    根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn),卵巢摘除后的大鼠其進(jìn)食量會(huì)明顯增加,本研究統(tǒng)一進(jìn)行了飲食的控制,排除飲食對其骨密度的影響,根據(jù)體質(zhì)量結(jié)果顯示,各組間體質(zhì)量無顯著性差異。但卵巢摘除后,正常情況下由于雌激素缺乏造成子宮萎縮,如OVX子宮系數(shù)所示,與Sham組具有顯著差異。當(dāng)藥物治療后,發(fā)揮了類雌激素的作用,其萎縮程度得到大量緩解,如I組和R組所示,與OVX相比,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    本實(shí)驗(yàn)中OVX組8周后全身及離體骨密度、生物力學(xué)性能均顯著低于假手術(shù)組。這表明卵巢摘除后機(jī)體不能產(chǎn)生雌激素從而導(dǎo)致其骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度明顯下降,骨流失嚴(yán)重。血清生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)其骨形成降低而骨吸收增加,進(jìn)一步從分子水平進(jìn)行了佐證。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的觀察和靜態(tài)參數(shù)的測量分析,確證了OP模型的成立。

    骨密度是骨質(zhì)量檢測的黃金指標(biāo),通過骨密度檢測可以直觀判定骨質(zhì)量的好壞[11]。骨密度結(jié)果顯示,藥物灌胃8周后I組和R組其全身骨密度、離體股骨和椎骨骨密度也有顯著增加,說明I和R均可以預(yù)防因卵巢切除而引起的骨丟失作用。I組作為陽性對照平均值略微高于R組,但幾乎無區(qū)別,說明R也能預(yù)防OP模型大鼠的骨密度的丟失,從而增加骨質(zhì)量。骨的微結(jié)構(gòu)和幾何形態(tài)決定骨的力學(xué)性能,不受大小和形狀的影響,它反映了骨的韌性和強(qiáng)度[12]。骨生物力學(xué)結(jié)果顯示,R組股骨和椎骨最大載荷均顯著高于OVX組,也再一次驗(yàn)證了此藥物對增加OVX大鼠骨強(qiáng)度的顯著影響。血清生化指標(biāo)反映的是骨代謝的本質(zhì),是骨形成和骨吸收的直觀反映,能客觀地評價(jià)骨轉(zhuǎn)換率[13]。血清骨代謝生化指標(biāo)較模型組而言,骨形成因子骨鈣素活性水平顯著提高,骨吸收因子抗酒石酸酸性磷酸酶活性水平顯著下降,表明R可通過增加OVX大鼠骨骨形成的活性且抑制破骨細(xì)胞的活性從而抑制了骨質(zhì)的流失。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)是評價(jià)骨組織微結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo),反映機(jī)體組織形態(tài)學(xué)的變化情況。本實(shí)驗(yàn)通過品紅-苦味酸染色客觀反映了各組間骨組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果顯示,OVX組由于卵巢切除,其骨小梁數(shù)量和致密度較Sham組顯著降低,而藥物治療后的R組骨小梁數(shù)量明顯增加,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密,說明藥物對其骨量有顯著增加的影響。通過骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的分析比較,R組大鼠較OVX組在Tb.N、Tb.SP以及BV/TV數(shù)值上均有明顯增加的結(jié)果,再次驗(yàn)證了R可通過改善骨組織、增加骨密度從而提高骨質(zhì)量。數(shù)據(jù)中Tb.Th只是平均值有增加,但統(tǒng)計(jì)結(jié)果無意義,也有增加的趨勢??赡苁且?yàn)槠溆盟帟r(shí)間并未達(dá)到較為理想的效果。各項(xiàng)指標(biāo)I組和R組相比,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明R可作為中藥替代藥物治療骨質(zhì)疏松,且其作用效果不次于公認(rèn)骨質(zhì)疏松治療藥物淫羊藿苷。

    綜上所述,R可通過提高大鼠骨密度、改變生物力學(xué)性能,增加骨形成的同時(shí)降低骨吸收,增加骨組織致密結(jié)構(gòu)來抑制切卵巢大鼠的骨量流失。但仍有諸多問題需進(jìn)一步研究,比如延長R用藥是否效果更為理想還是作用效果消失?R藥物作用的具體分子機(jī)制是什么?R藥物的毒理實(shí)驗(yàn)等還有待進(jìn)一步研究。但該研究結(jié)果為OP治療尋找替代中藥提供了理論依據(jù),從而為更多更好的中藥治療OP研究和臨床推廣奠定基礎(chǔ)。

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