綠盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗體制備及在蛻皮激素誘導(dǎo)下的應(yīng)答

譚永安，趙旭東，姜義平，趙靜，肖留斌?，郝德君?

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，南京 210014；2南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/林學(xué)院，南京 210037

0 引言

【研究意義】綠盲蝽（Apolyguslucorum）屬半翅目（Hemiptera）盲蝽科（Miridae），寄主范圍廣泛，可危害棉花等多種經(jīng)濟作物[1-2]。20世紀(jì)90年代末以來，由于Bt棉的大面積推廣種植和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，綠盲蝽種群數(shù)量急劇上升，已成為棉田主要害蟲，并迅速波及棗樹、葡萄、櫻桃、桃等多種果樹，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及品質(zhì)。生產(chǎn)上對化學(xué)農(nóng)藥的長期依賴勢必會導(dǎo)致綠盲蝽的抗藥性日漸增強，從而造成防治效果下降[3-4]。因此，目前綠盲蝽防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，亟需開拓基于新靶標(biāo)的有效防控技術(shù)?！厩叭搜芯窟M展】雷帕霉素靶蛋白 （target of rapamycin，TOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞代謝、生長及增殖方面至關(guān)重要[5-6]。TOR可分為TOR復(fù)合物1（TOR complex 1，TORC1）和 TOR 復(fù)合物 2（TOR complex 2，TORC2）。TORC1是 TOR與 RapTOR（regulatory associated protein of mTOR）及mLST8（mammalian lethal with Sec13 protein 8）形成的一個對雷帕霉素敏感的復(fù)合物，可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等關(guān)鍵生理過程[7-8]。TORC2是由 RicTOR（rapamycin insensitive cornpanion of mTOR）、Sinl（也稱為 Mip1）與 mLST8、mTOR共同形成的對雷帕霉素不敏感的復(fù)合物，通過調(diào)控蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）和蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）的活化，主要參與細(xì)胞極性、空間及骨架結(jié)構(gòu)的形成[9]。在昆蟲中，TOR可通過直接耦合前胸腺中的營養(yǎng)感應(yīng)，從而在蛻皮激素（20E）生成及蛻皮過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。研究表明，抑制 TOR的表達可造成幼蟲發(fā)育歷期延長，同時與蛻皮激素合成相關(guān)基因的表達量下調(diào)，表明昆蟲在生長發(fā)育以及蛻皮變態(tài)時需要TOR的參與；此外，在幼蟲營養(yǎng)缺乏的條件下，TOR信號的激活會誘導(dǎo)蛻皮激素的生成，使幼蟲完成正常蛻皮及變態(tài)行為[12]。TOR信號也可受蛻皮激素的調(diào)控[13-14]。對黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)幼蟲攝入營養(yǎng)時，蛻皮激素抑制TOR信號介導(dǎo)調(diào)控胰島素樣肽（ILP）生成胰島素分泌細(xì)胞來調(diào)控果蠅的生長發(fā)育[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于TOR的研究多集中在植物、哺乳動物及一些模式昆蟲上[17-19]，對綠盲蝽AlTOR的相關(guān)研究尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用RACE技術(shù)從綠盲蝽中擴增AlTOR全長，運用生物信息學(xué)方法對該基因進行結(jié)構(gòu)分析和同源進化分析，并利用qRT-PCR闡明其時空表達動態(tài)及20E對其表達的影響，同時將其在原核細(xì)胞中進行高效表達，篩選最佳表達條件，以獲得純化蛋白，最后制備特異性的抗體，為在蛋白水平進一步研究該基因的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2018年9月至2019年12月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx

綠盲蝽于 2018年采自江蘇沿海棉區(qū)的大豐市蠶豆田（33.11°N，120.25°E），室內(nèi)用新鮮四季豆（Phaseolusvulgaris）續(xù)代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（27±0.5）℃，相對濕度（70±5）%，光周期 14L∶10D。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒（Promega），M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（寶生物工程（大連）有限公司），pCzn1表達載體、PFU DNA聚合酶（南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司），TOP10菌株（天根生化科技有限公司），大腸桿菌（Escherichiacoli）Arctic Express（DE3）（Agilent）；卡那霉素、咪唑、尿素（上海生工生物工程有限公司）；限制性內(nèi)切酶（TaKaRa），Protein Marker（Thermo），IPTG、Acr、Bis、Tris（Sigma），SDS（Amresco），TEMED（BIO-RAD），高糖、Tyrptone、Yeast Extract（OXOID），Agarose（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Ni2+IDA親和層析膠（Novagen），HexIOS分光光度計、Allegra 21R臺式高速冷凍離心機（Beckman），臺式高速離心機（Sorval），Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)（BIO-RAD），PTC-200基因擴增儀（MJ Research），20E、U73211（Sigma）。

1.3 AlTOR全長基因的克隆

基于實驗室構(gòu)建的綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及已報道昆蟲TOR進行BLAST搜索，篩選綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組中可能的TOR基因片段序列，從而進行克隆驗證。根據(jù)獲得的序列設(shè)計特異性引物（表1），進行AlTOR5′和3′端序列的克隆。取綠盲蝽3齡若蟲20頭，Trizol法提取總RNA后合成cDNA第1鏈，根據(jù)設(shè)計的特異性上游引物和下游引物，進行AlTOR5′和3′端序列的克隆。5′端序列的克隆采用巢式PCR，第一輪反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液 5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl23.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL、10 μmol·L-15′-AlTOR-1 2.0 μL、10 μmol·L-1通用引物 Abridged Anchor Primer 2.0 μL、cDNA 5.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.5 U，超純水補足至50.0 μL；第二輪反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液 5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl23.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL、10 μmol·L-15′-AlTOR-2 1.0 μL、10 μmol·L-1通用引物 Abridged Universal Amplification Primer 1.0 μL、第一輪 PCR 產(chǎn)物 5.0 μL、Taq DNA聚合酶0.5 U，超純水補足至50.0 μL；PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次，72℃延伸7 min。3′端序列的克隆也采用巢式PCR，第一輪反應(yīng)體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，cDNA 2.5 μL，10 μmol·L-13′-AlTOR-1 1.0 μL，10×UPM 5.0 μL，超純水補足至50.0 μL；第二輪反應(yīng)體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2.5 μL，10 μmol·L-13′-AlTOR-2 1.0 μL，10×UPM 5.0 μL，超純水補足至50.0 μL；PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃ 2 min，94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。將獲得的5′和3′端及保守區(qū)域進行拼接和測序（上海生工生物工程有限公司），最終獲得AlTOR全長。最后根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計全長基因克隆引物（AlTOR-F和AlTOR-R），進行AlTOR全長基因的克隆。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 AlTOR時空表達定量檢測

收集綠盲蝽不同日齡若蟲及羽化7 d后雌成蟲的不同組織（頭、胸、翅、足、中腸、卵巢和脂肪體）。其中不同日齡樣本每個處理15頭，不同組織樣本每個處理10頭雌成蟲，并設(shè)計3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。液氮處理樣品后-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。Trizol法提取總RNA，Prime ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。qRT-PCR試驗步驟按照SYBR Premix Ex Taq Kit說明書上進行。所用的AlTOR引物參見表1，并以綠盲蝽持家基因β-actin為內(nèi)標(biāo)對照基因[20]（GenBank登錄號：JN616391）。擴增體系：UltraSYBR Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 9.5 μL；擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，循環(huán)40次。

1.5 20E處理綠盲蝽若蟲

分別用 20E（2 μmol·L-1）、U73122（20E 抑制劑[21]，50 μmol·L-1）、20E+U73122 處理、乙醇（CK）浸泡切除兩端的四季豆1 min，晾干后飼喂初孵1齡若蟲。每處理綠盲蝽400頭，重復(fù)4次。按1.4方法收集綠盲蝽不同發(fā)育階段和不同組織樣本后，分析不同處理AlTOR表達量。

1.6 AlTOR序列分析與進化樹分析

AlTOR核苷酸序列分析使用 Expasy在線程序（http://web.expasy.org/compute_pi/）進行預(yù)測分析，蛋白結(jié)構(gòu)域分析運用SMART在線分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）；氨基酸序列比對軟件使用ClustalX進行；利用 MEGA 6.0軟件包中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進化樹，并1 000次重復(fù)構(gòu)建。

1.7 AlTOR在大腸桿菌中的表達

使用 DNASTAR-Protean軟件分析 AlTOR蛋白Antigenic index，選取抗原性較好的區(qū)域（72—381，蛋白質(zhì)理論分子量為35.83 kD）作為免疫原區(qū)域，使用原核表達獲得抗原蛋白?；?PAS（PCR-based accurate synthesis）的方法，在引物的兩端各設(shè)計保護性堿基合成基因6731-2S，將其連入pCzn1重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I及XhoI雙酶切后進行連接。酶切體系：兩種限制性內(nèi)切酶各0.25 μL，10×Buffer緩沖液1.0 μL，帶有合適酶切位點的基因片段3 μL，用ddH2O補足至10 μL，37℃水浴3 h。連接體系：酶切回收后的載體5.0 μL，基因片段10.0 μL，T4 DNA連接酶 1.0 μL，10×Buffer緩沖液 2.0 μL，用 ddH2O補足至20 μL，16℃反應(yīng)12—16 h。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后采用PCR篩選陽性克隆。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pCzn1-AlTOR轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Arctic Express感受態(tài)細(xì)胞，具體方法：將質(zhì)粒1 μL加入100 μL感受態(tài)細(xì)菌中，置冰上20 min；42℃熱激90 s，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培養(yǎng)液；37℃，220 r/min振搖1 h，離心后全部涂布于含50 μg·mL-1Amp的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化平板上的多克隆接種于含50 μg·mL-1Amp的3 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37℃ 220 r/min振搖過夜。次日按1∶100接種于50 μg·mL-1Amp的30 mL LB培養(yǎng)液中，37℃ 220 r/min 振搖至菌體 OD600為 0.6—0.8。取出1 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，20℃ 220 r/min振搖過夜，誘導(dǎo)融合蛋白表達。取出1 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。剩余培養(yǎng)物4 000 r/min，離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀；重懸液進行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。12% SDS-PAGE檢測分析，考馬斯亮藍染色顯帶。

1.8 包涵體蛋白的變性和復(fù)性

先將菌體沉淀重懸于20 mL裂解液（20 mmol·L-1Tris-HCl containing 1 mmol·L-1PMSF，pH 8.0）中，超聲破碎（功率400 W，工作4 s，間歇8 s，共20 min），收集沉淀。使用包涵體洗滌液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1%Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體3次。再使用溶解緩沖液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素，pH 8.0），溶解包涵體，4℃過夜。室溫，10 000 r/min離心 15 min，將上述溶液滴加緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0），逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于上述緩沖液中透析過夜。

1.9 融合蛋白的Ni柱親和純化

利用低壓層析系統(tǒng)，包涵體溶液以 0.5 mL·min-1流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱，Ni-IDA Binding-Buffer以 0.5 mL·min-1流速沖洗，至流出液 OD280值到達基線，再用Ni-IDA Washing-Buffer（ 20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）以1 mL·min-1流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；用 Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）以1 mL·min-1流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Ni-IDA Elution-Buffer進行透析過夜；12% SDS-PAGE分析后利用BSA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.10 AlTOR多克隆抗體的制備

取純化的AlTOR重組蛋白免疫新西蘭白兔 （江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供）。皮下注射，每次免疫量為400 μg，2—3周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫后在大白兔頸動脈采血，8 000 r/min離心8 min所得上清制備抗血清并準(zhǔn)備純化抗體。TOR蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將PBS與所得抗血清等量混合后緩慢上樣，待抗體抗原結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫得到所需純化抗體，并在PBS緩沖液 （pH 7.4）中進行透析過夜（4℃），隔日進行效價測定，BCA濃度測定試劑盒對所得抗體進行濃度測定。

1.11 效價測定

間接 ELISA法對抗體進行效價測定。以純化的AlTOR重組蛋白（5 g·mL-1）包被ELISA板，每孔加入 100 mL，4℃過夜。用 PBST（0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g NaHPO4·12H2O，8 g NaC1，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗滌3次，加入PBST封閉液（含5%牛血清白蛋白）于37℃封閉2 h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，用PBST洗板3次，加入用PBST連續(xù)倍比稀釋的AlTOR多克隆抗體和陰性血清每孔100 μL，37℃恒溫箱1 h。同上洗滌后，加入100 μL的用PBST以1∶5 000稀釋的二抗HRP-IgG，37℃放置1 h。用PBST洗板3次，每次5 min，最后加100 μL TMB底物液顯色，37℃顯色15 min，待終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀測定A450值。

1.12 AlTOR多克隆抗體的鑒定

檢測多克隆抗體的特異性Western blot測定按照SONG等[22]的方法進行并稍作修改。將原核表達的AlTOR重組蛋白及 3齡綠盲蝽若蟲總蛋白進行SDS-PAGE分析。轉(zhuǎn)印PVDF膜后封閉，一抗為上述制備的蛋白抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠HRP。

1.13 數(shù)據(jù)分析

不同處理的AlTOR相對表達量變化以 2-ΔΔCt[23]計算。差異顯著性采用統(tǒng)計軟件 SAS 8.0中的 Duncan氏新復(fù)極差法進行分析。

2 結(jié)果

2.1 AlTOR的克隆及序列分析

利用綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組篩選AlTOR基因序列，再利用 RACE方法，分別進行 5′和 3′末端的擴增，獲得了AlTOR的全長序列（圖1）。序列分析結(jié)果表明，AlTOR全長1 652 bp，包括一個208 bp的5′非翻譯區(qū)以及136 bp的3′端非翻譯區(qū)。AlTOR開放閱讀框含有1 308 bp的核苷酸，編碼435個氨基酸，理論等電點預(yù)測為7.16。結(jié)構(gòu)域分析表明，AlTOR基因翻譯后的氨基酸序列具有典型的 TOR特征，含有 N-末端的SIN1結(jié)構(gòu)域（288 bp）、高度保守的CRIM結(jié)構(gòu)域（390 bp）及脂質(zhì)與膜結(jié)合相關(guān)C-末端的PH域（363 bp）（圖2）。

2.2 多重聯(lián)比及進化樹分析

多重聯(lián)比結(jié)果如圖3所示，TOR在半翅目昆蟲中較為保守，尤其是CRIM結(jié)構(gòu)域，AlTOR的氨基酸序列與半翅目臭蟲科溫帶臭蟲（Cimexlectularius）以及蝽科茶翅蝽（Halyomorphahalys）的TOR氨基酸序列一致性相對較高，分別為 55.78%和 54.38%，與其他昆蟲的TOR基因序列一致性較低，如膜翅目的造紙胡蜂（Polistesdominula）（38.70%）及蕪菁葉蜂（Athalia rosae）（39.33%）。

利用MEGA 6.0軟件NJ法構(gòu)建了包括綠盲蝽在內(nèi)的5個目20種昆蟲TOR的系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果顯示，TOR作為高度保守的蛋白，在種間同源性較高；外聚群中，膜翅目、鱗翅目、蜚蠊目、纓翅目中聚類更為接近，屬于同一類分支。半翅目中，綠盲蝽與溫帶臭蟲、茶翅蝽同源性較高，親緣關(guān)系較為接近；與蚜蟲位于不同分支，同源性遠(yuǎn)低于同為半翅目的溫帶臭蟲和茶翅蝽。

2.3 AlTOR在綠盲蝽不同發(fā)育階段及組織中的表達

AlTOR在綠盲蝽1—16日齡蟲體中均有表達，表達量呈現(xiàn)波動式下降趨勢，其中在初孵若蟲（1日齡）表達量最高，8日齡若蟲表達量最低，此外，AlTOR在綠盲蝽各齡期蛻皮時表達量顯著升高（圖5）。AlTOR在綠盲蝽雌成蟲各組織中均有表達，其中在卵巢、中腸和脂肪體中高表達，而在頭、胸、足中表達量較低，AlTOR的表達具有組織特異性（圖6）。

2.4 不同處理對AlTOR相對表達量的影響

與CK（乙醇）相比，當(dāng)綠盲蝽分別發(fā)育至1齡蛻皮及2齡蛻皮時（4 d和6 d），20E顯著上調(diào)AlTOR的表達；U73122處理后，AlTOR的表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；此外，20E+U73122混合處理后，AlTOR的表達總體變化不大（圖7）。與CK（乙醇）相比，20E處理綠盲蝽雌成蟲后，各組織中AlTOR表達均顯著上調(diào)，其中頭、翅、卵巢和脂肪體中基因表達量分別顯著提高了200.00%、118.89%、20.53%和60.82%；而當(dāng) U73122處理后，綠盲蝽雌成蟲的頭、翅和足中AlTOR顯著上調(diào)，中腸、卵巢和脂肪體中AlTOR表達量則下調(diào)（圖8）。

2.5 重組蛋白AlTOR的表達、復(fù)性及純化

重組質(zhì)粒命名為pCzn1-AlTOR。隨后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express(DE3)表達菌株中，經(jīng)0.5 mmol·L-1IPTG 20℃誘導(dǎo) 12 h 后，12% SDS-PAGE檢測分析發(fā)現(xiàn)，pCzn1-AlTOR重組質(zhì)粒表達一個約36 kD的蛋白（圖9-A）。而不經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒無此蛋白表達，說明AlTOR可在大腸桿菌細(xì)胞中誘導(dǎo)表達。但誘導(dǎo)表達的pCzn1-AlTOR表達蛋白均分布在沉淀體中，上清液中幾乎沒有，說明pCzn1-AlTOR表達蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)體外溶解、復(fù)性后，利用SDS-PAGE電泳分析pCzn1-AlTOR表達蛋白的純化情況。用含 20 mmol·L-1咪唑的緩沖液洗脫包涵體，進一步復(fù)性和純化后在36 kD附近僅出現(xiàn)一條明顯的特異性條帶未見其他條帶，說明已得到純化的靶蛋白（圖 9-B）。采用蛋白定量試劑盒測定該蛋白的濃度為 0.2 mg·mL-1，SDS-PAGE電泳檢測該抗體的純度達到85%以上，并最終獲得了5.46 mg抗體，可以進行后續(xù)多克隆抗體制備工作。

2.6 AlTOR蛋白多克隆抗體的特異性鑒定

新西蘭白兔經(jīng)3次免疫后，用間接ELISA法檢測多克隆抗體的效價。AlTOR多克隆抗體和陰性血清（免疫前健康兔血清）按500×20—500×210連續(xù)倍比稀釋。結(jié)果表明當(dāng)AlTOR抗體稀釋5 120倍時，OD陽性/OD陰性＞2.0，其終效價可達1∶512 000。用制備的多克隆抗體分別檢測原核表達的 AlTOR重組蛋白及剛蛻皮的綠盲蝽3齡若蟲，Western blot分析表明，所制備的多克隆抗體不僅能與綠盲蝽總蛋白結(jié)合，還可特異性與AlTOR重組蛋白反應(yīng)（圖10），且條帶大小與預(yù)測的蛋白質(zhì)大小一致，說明制備的AlTOR多克隆抗體準(zhǔn)確、有效。

3 討論

TOR是一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，是真核細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境信號調(diào)控生長和代謝的關(guān)鍵因子[6]。自TOR蛋白在酵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)后，在其他真菌、昆蟲、植物以及哺乳動物中也相繼被發(fā)現(xiàn)。TOR信號通路高度保守，對有機體自身生長和發(fā)展至關(guān)重要[24]。研究發(fā)現(xiàn)，植物、蠕蟲、果蠅以及哺乳動物細(xì)胞中有一個TOR編碼基因，而釀酒酵母中存在兩個TOR編碼基因[25]。TOR在細(xì)胞生長的營養(yǎng)調(diào)控中能通過激活下游信號通路，介導(dǎo)4E-BP1、S6K、eEF2等一系列翻譯調(diào)節(jié)因子的磷酸化作用傳遞外界營養(yǎng)狀況、生長因子等生長刺激信號，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)核糖體的發(fā)生及蛋白質(zhì)的合成，進而綜合調(diào)控細(xì)胞的生長與增殖[24]。另外，TOR還可參與調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、細(xì)胞大小等與細(xì)胞生長密切相關(guān)的生理過程[26-28]。

本研究通過篩選綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，RACE法獲得了AlTOR的全長基因序列。序列分析結(jié)果表明，AlTOR的開放閱讀框含有1 308 bp的核苷酸，編碼435個氨基酸。多序列比對結(jié)果顯示與其他半翅目昆蟲TOR的氨基酸序列一致性在 40%—60%，含有 TOR作用靶標(biāo)相關(guān)的SIN1結(jié)構(gòu)域、CRIM結(jié)構(gòu)域以及PH結(jié)構(gòu)域。SIN1結(jié)構(gòu)域是哺乳動物mSIN1的同源物，也是TOR作用的靶標(biāo)之一，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的作用。CRIM結(jié)構(gòu)域位于TOR蛋白的中間位置，對TOR識別底物有著重要作用；另外CRIM結(jié)構(gòu)域不論是在酵母細(xì)胞還是哺乳動物體內(nèi)都高度保守。PH結(jié)構(gòu)域同樣也十分保守，其主要與脂質(zhì)與膜結(jié)合相關(guān)[28]。進化樹結(jié)果顯示半翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲的TOR較為分化，位于不同的分支上。分化的原因可能這些目昆蟲種類繁多、變態(tài)類型及由于不同的自然選擇壓造成的，如膜翅目、鱗翅目類昆蟲是完全變態(tài)類昆蟲，而半翅目昆蟲屬于不完全變態(tài)類昆蟲。

TOR是昆蟲體內(nèi)營養(yǎng)信號的中心，通過氨基酸（AA）作為其調(diào)節(jié)因子，對外界攝入營養(yǎng)進行感知。AA/TOR途徑廣泛存在于真核細(xì)胞中，如酵母細(xì)胞。研究表明，除了調(diào)控葡萄糖的合成，TOR還可以通過氨基酸控制類胰島素樣肽的合成以及分泌。在果蠅成蟲中，胰島素樣肽的分泌是由脂肪體產(chǎn)生的未配對細(xì)胞因子2（cytokine unpaired 2）遠(yuǎn)程調(diào)控從而響應(yīng)營養(yǎng)信號[15,29]。由此可見，由TOR發(fā)出的氨基酸信號代表著營養(yǎng)信號的第一階段，特別是對于需要蛋白質(zhì)來啟動產(chǎn)卵的昆蟲而言[30]。此外，TOR信號還參與雌性昆蟲生殖產(chǎn)卵，其作為營養(yǎng)信號的中心為雌蟲生殖以及產(chǎn)卵提供充足的能量供給[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，AlTOR在1—16日齡綠盲蝽中均有表達，表達量呈現(xiàn)波動式下降趨勢，以初孵若蟲（1日齡）中表達量最高；此外AlTOR在綠盲蝽雌成蟲各組織中均有表達，其中卵巢、中腸及脂肪體中高表達，表明AlTOR的表達存在組織和時空特異性。研究表明，雌性昆蟲的生殖需營養(yǎng)及能量資源的投入，在大多數(shù)昆蟲中，營養(yǎng)的攝取是啟動卵發(fā)育的關(guān)鍵觸發(fā)因素。而AA/TOR途徑和胰島素途徑作為營養(yǎng)傳感器，在昆蟲繁殖中起著至關(guān)重要的作用，影響生殖組織形成并調(diào)控JH和20E的生物合成[31-33]。TOR可刺激卵黃原蛋白在脂肪體的合成并激活卵發(fā)育；相反地，TOR途徑的失活會導(dǎo)致繁殖受到抑制。在埃及伊蚊（Aedesaegypti）以及褐飛虱（Nilaparvatalugens）中，通過雷帕霉素抑制TOR蛋白質(zhì)的合成以及RNAi介導(dǎo)的TOR基因沉默都會抑制卵黃原蛋白的表達，從而導(dǎo)致生殖力的降低[34-35]。在本研究中，AlTOR在若蟲蛻皮期以及成蟲羽化期表達水平顯著提高，暗示TOR可能參與綠盲蝽若蟲蛻皮以及羽化的變態(tài)行為；且AlTOR在卵巢、中腸及脂肪體中高表達暗示TOR可能參與綠盲蝽的生殖活動，這也是后續(xù)需要進行的研究工作。TOR可在蛻皮激素生成以及昆蟲蛻皮過程中發(fā)揮重要作用。同時，蛻皮激素也會抑制 TOR信號，在果蠅中，蛻皮激素會抑制幼蟲進食時脂肪體內(nèi)的TOR信號，進而產(chǎn)生未知信號，調(diào)節(jié)胰島素生成細(xì)胞中胰島素樣肽的產(chǎn)生，從而控制果蠅全身性生長[32]。對家蠶的研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素會在成蟲的不同發(fā)育階段在同一組織促進或抑制 TOR信號從而調(diào)控成蟲的生長發(fā)育[36]。在本研究中，綠盲蝽若蟲隨著齡期的增加，20E會顯著上調(diào)AlTOR的表達，卵巢和脂肪體中AlTOR的表達也會由于20E的刺激而顯著提高，表明AlTOR可能受20E調(diào)控，尤其是在“能量中心”脂肪體以及“生殖中心”卵巢中。細(xì)胞膜上的磷脂酶C是參與20E信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶，磷脂酶C可水解磷酯酰肌醇二磷酸成為第二信使IP3和DAG傳遞激素，神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子等信號行使其功能[37]。GU等研究表明，TOR信號參與家蠶前胸腺中促前胸腺激素誘導(dǎo)的20E合成，且磷脂酶C參與這個過程，當(dāng)使用U73122抑制磷脂酶C時，會導(dǎo)致20E的合成受阻[38-39]。在本研究中，20E抑制劑U73211處理后，AlTOR在中腸和脂肪體中表達量顯著下降，而 20E處理后，AlTOR在中腸和脂肪體中表達量顯著上調(diào)，暗示磷脂酶C可能參與20E對AlTOR的調(diào)控。

可溶性蛋白質(zhì)的異源表達已經(jīng)有較多的表達系統(tǒng)可用，目前很多可溶性蛋白以融合蛋白的形式得到成功表達[40-41]。本研究成功構(gòu)建了pCzn1-AlTOR原核表達載體，并發(fā)現(xiàn)在20℃ 0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)12 h的條件下可大量表達AlTOR蛋白，之后通過變性、復(fù)性、蛋白純化獲得了純化的靶蛋白。通過免疫新西蘭白兔4次之后，采血檢測，ELISA方法確定抗血清針對TOR蛋白的效價，通過ELISA檢測效價得出，TOR抗體效價在512 000左右，純度在85%以上，獲得純化的抗體為5.46 mg。Western blot分析結(jié)果也表明該多克隆抗體可同時與綠盲蝽總蛋白及 AlTOR重組蛋白特異性結(jié)合，為進一步在蛋白層面研究TOR的功能打下了良好基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

AlTOR在綠盲蝽體內(nèi)的表達譜顯示出發(fā)育階段特異性和組織特異性；20E及其抑制劑誘導(dǎo)后，AlTOR呈現(xiàn)出相反的應(yīng)答反應(yīng)；本研究獲得的AlTOR重組蛋白的多克隆抗體具有高特異性。