黃瓜白化突變體分析與突變基因al的精細定位

牛玉倩，李 征

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌712100)

經過長期的栽培與馴化，黃瓜(CucumissativusL.)已經成為最主要的蔬菜作物之一，廣泛分布于世界各地。作為第一個進行基因組測序的蔬菜作物，黃瓜基因組較小，約為367 Mb，是研究葫蘆科的模式作物，也是研究葉色突變的理想植物。葉色突變在自然界普遍存在，由于葉色突變植株是研究葉綠素合成代謝、葉綠體發(fā)育結構及光合作用系統(tǒng)的理想材料，隨著分子生物學的進一步發(fā)展，對于葉色突變體的研究日漸深入。

植物白化突變體的形成大多是因為葉綠素缺失、葉綠體發(fā)育受阻、葉綠體內部結構異?；蚬夂献饔檬茏瓒a生的。突變體植株在缺乏葉綠素后不能進行正常的光合作用，導致苗期就表現(xiàn)出致死效應。目前，葉色白化突變體在許多植物中都有發(fā)現(xiàn)，如水稻[1-2]、擬南芥[3]等。黃瓜葉色突變體方面的報道甚少，迄今為止發(fā)現(xiàn)的葉色突變體的表現(xiàn)也不盡相同，其中已報道的致死突變體有4個：al、cd、gc和p[4]，非致死突變體有8個：g、lg-1、lg-2、v、vvi、yc-1、yc-2和yp[5]。隨著基因組學及分子育種的發(fā)展，我國關于黃瓜葉色突變體的研究也逐漸深入，如國艷梅等[6]和苗晗[7]在黃瓜雌性系9110Gt中發(fā)現(xiàn)了能夠穩(wěn)定遺傳的黃色突變體。進一步研究發(fā)現(xiàn)該突變體中葉綠體發(fā)育異常且受溫度影響較大，其由位于黃瓜6號染色體(Chr6)上的隱性位點v-1控制，最終將CsaCNGCs確定為候選基因[6-8]。李萬青等[9]和Gao等[10]利用EMS誘變獲得黃瓜葉綠素缺陷突變體C528，其葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及葉綠素總量相對于野生型均顯著降低，利用圖譜克隆技術最終將CsChlI確定為候選基因。李燕[11]發(fā)現(xiàn)的黃瓜黃綠葉色突變體Z3t的子葉表現(xiàn)為黃色，葉綠體結構異常，超氧化物歧化酶活性顯著高于對照，并由隱性核基因yl控制。胡亮亮等[12]對黃綠葉突變體C777進行光合特性分析發(fā)現(xiàn)，突變體的光合色素質量分數(shù)相對于野生型降低，導致其凈光合速率顯著降低。董翔宇[13]通過BSA法結合分子標記技術將自然突變葉色突變體yf的候選基因定位在第7條染色體Cucsa.099260基因上。

在前期研究中，本研究小組使用黃瓜野生型材料649經EMS誘變后獲得攜帶白化基因的雜合突變個體，在分別與黃瓜材料Gy14和9930構建的2個F2群體中均出現(xiàn)了白化致死突變個體。因其植株不能正常發(fā)育真葉，與已報道的黃瓜葉色突變體均不同，因此將其命名為白化albinocotyledons(簡稱al)突變體。初步觀察其表型發(fā)現(xiàn)突變植株子葉白化，苗期致死。本試驗通過對白化突變體的研究，以期發(fā)現(xiàn)調控葉綠素合成和葉綠體建成的關鍵基因，為進一步闡明影響黃瓜葉綠體發(fā)育的重要代謝或調控機制及光合作用機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃瓜親本材料Gy14、9930均來自西北農林科技大學園藝學院黃瓜課題組，黃瓜野生型材料649經EMS誘變后獲得攜帶白化基因的雜合突變材料，與Gy14、9930分別構建F2群體。試驗所用Gy14×649、9930×649的F1代種子來自西北農林科技大學園藝學院黃瓜課題組，2017年秋季種植于溫室中，用于自交并獲得F2分離群體，進行生理和遺傳分析。2018年春季擴大F2群體種植，進行基因精細定位研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 光合色素含量的測定 光合色素含量的測定方法參照《植物生理生化實驗原理與技術》(第3版)[14]并略有更改。分別取Gy14×649、9930×649 F2群體子葉展平期5和9 d苗齡的野生型及al植株各3株，各稱取新鮮葉片組織0.2 g，加入約5 mL 體積分數(shù)80%丙酮充分研磨，避光放置至葉片無色，過濾、定容至10 mL，搖勻備用。以體積分數(shù)80%丙酮為空白對照，分別在663和646 nm波長下測定其OD值，重復3次。按下式對植株子葉所含光合色素含量進行計算[15-16]：

Ca=(12.21A663-2.81A646)×V×N÷

(W×1 000)；

Cb=(20.13A646-5.03A663)×V×N÷

(W×1 000)；

Ca+b=Ca+Cb。

式中：A663、A646分別為植物葉綠體色素提取液在663和646 nm波長下的OD值，Ca、Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的含量(mg/g)，Ca+b為總葉綠素含量(mg/g)，V為提取液體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，W為樣品鮮質量(g)。

1.2.2 葉綠體結構的觀察 分別選取9930×649 F2群體野生型及突變體的子葉和真葉(突變體因無法長出真葉，故選取同時期生長點處新生嫩芽)，切取條狀、截面約1 mm×1 mm且體積不大于1 mm3的葉片組織，放置于預冷固定液(2.5%戊二醛磷酸緩沖液，4 ℃冰箱保存)中，抽真空30 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。每組材料重復3次，固定6 h后可送制樣。制樣試劑和樣品制備方法參考Leica公司提供的 《常規(guī)生物透射電鏡樣品制備概要》 (http://www.leica-microsystems.com)。用透射電鏡對細胞中的葉綠體進行觀察，透射電鏡的操作方法由西北農林科技大學北校區(qū)公共實驗平臺提供。

1.2.3 黃瓜白化表型的遺傳分析與精細定位 隨機選取Gy14×649、9930×649 F2群體擴繁的種子，統(tǒng)計白化個體和野生型個體數(shù)，并對統(tǒng)計結果進行χ2分析。用BSA法對目標突變基因進行初步定位，在Gy14×649、9930×649 F2分離群體中分別隨機選取野生型和突變體表型植株各10株，用CTAB法提取DNA后稀釋至50 ng/μL，構建野生型基因池和突變體基因池，利用這兩個池進行黃瓜白化突變基因的初定位，同時對這兩個基因池進行全基因組Bulk-seq測序，測序由諾禾致源生物科技有限公司完成。初定位所用黃瓜染色體引物由西北農林科技大學園藝學院黃瓜課題組提供。黃瓜染色體基因組SSR標記引物[17-19]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系為：2×Dining Mix(北京，Dining)5 μL，ddH2O 3 μL，上、下游引物(10 ng/μL)各0.5 μL， DNA模板(50 ng/μL)1 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，28個循環(huán)；72 ℃終延伸 5 min，終止溫度10 ℃ 保存。PCR產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色后統(tǒng)計帶型，從而進一步篩選多態(tài)性引物。

在SSR分子標記的基礎上，基于黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://cucurbitgenomics.org/)信息，結合重測序結果開發(fā)了單核苷酸多態(tài)性(SNP)和缺失/插入(InDel)標記。標記與目標基因的連鎖分析使用MAPMARKER/EXP 3.0程序，應用Kosambi函數(shù)將其轉化為遺傳圖距[20]。本研究中使用的PCR引物信息見表1。

表1 本研究用到的黃瓜基因定位PCR引物Table 1 Cucumber gene mapping related primers used in this study

2 結果與分析

2.1 黃瓜al突變體的表型觀察與分析

由于al突變體具有苗期致死性，因此最初該突變體是從Gy14×649和9930×649 F2分離群體中鑒定獲得的。對黃瓜al突變體表型進行觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，al突變體剛出土時子葉顏色淺黃，之后逐漸白化(圖1-A,B)。突變體在子葉期正常生長，在野生型進入真葉期的相同時段，突變體慢慢枯萎死亡(圖1-C)。對al突變體的觀察表明，該突變?yōu)橹滤劳蛔冃誀睢?/p>

A,B.分別為9930×649、Gy14×649 F2群體al突變體與野生型植株；C.同時播種后野生型長出真葉時，al突變體逐漸萎蔫死亡。WT.野生型；M.al突變植株A,B.al mutant plants and wild type in two F2 populations of 9930×649,Gy14×649，respectively;B.At the first-leaf period,the al mutant wilted and died.WT.Wild-type plants;M.al mutant圖1 黃瓜al突變體與野生型植株的表型觀察Fig.1 Observation of phenotypes of cucumber al mutant and wild type

2.2 黃瓜白化突變體光合色素含量的測定

與野生型相比，Gy14×649和9930×649兩個F2分離群體中的al突變體葉色呈淺黃或白色。分別對5和9 d苗齡的野生型及al突變體子葉的葉綠素含量進行測定,結果表明，9930×649 F2群體中，al突變體的總葉綠素含量極顯著低于野生型植株(圖2-A)。相較于野生型， 5 d苗齡(即子葉展平期)時，al突變體葉綠素a含量降低了94.18%，葉綠素b含量降低了90.44%；9 d苗齡時，al突變體葉綠素a含量降低了97.65%，葉綠素b含量降低了92.01%(圖2-B和圖2-C)。

**表示同一苗齡野生型與al突變體間差異極顯著(P<0.01)。下同** indicates significant difference between al mutant and wild type at same seedling age (P<0.01).The same below圖2 不同苗齡下黃瓜9930×649 F2群體中al突變體子葉光合色素含量的變化Fig.2 Changes in photosynthetic pigment content in cotyledon of cucumber al mutant in 9930×649 F2 populations at different seedling ages

在Gy14×649 F2群體中，al突變體的總葉綠素含量均極顯著低于野生型植株(圖3-A)。與野生型相比， 5 d苗齡時al突變體葉綠素a含量降低了92.31%，葉綠素b含量降低了88.13%；9 d苗齡時al突變體葉綠素a含量降低了98.93%，而葉綠素b含量幾乎無法測到(圖3-B和圖3-C)。

圖3 不同苗齡下黃瓜Gy14×649 F2群體中al突變體子葉光合色素含量的變化Fig.3 Changes in photosynthetic pigment content in cotyledon of cucumber al mutant in Gy14×649 F2 populations at different seedling ages

2.3 黃瓜白化突變體葉綠體結構的觀察

利用透射電鏡對野生型及al突變體子葉和真葉的葉綠體結構分別進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)野生型子葉中的葉綠體形態(tài)正常，呈橢球形，有正常堆疊的基粒片層結構(圖4-A，B)。但al突變體子葉葉肉細胞中未觀察到規(guī)則的葉綠體，偶爾會有幾個呈細長條形的異常葉綠體結構(圖4-C，D)。野生型真葉中的葉綠體相對于子葉中的葉綠體發(fā)育更為完全，形狀規(guī)則，排布整齊，可觀察到正常堆疊的基粒片層、淀粉粒等完整結構(圖4-E，F(xiàn))。在al突變體真葉(即同時期生長點處新生嫩芽)的葉肉細胞中幾乎不能觀察到葉綠體(圖4-G，H)。

A，B.野生型子葉；C，D.al突變體子葉； E，F(xiàn).野生型真葉；G，H.al突變體真葉。箭頭示葉綠體或葉綠體類囊體A,B.Wild-type cotyledon;C,D.al mutant cotyledon;E,F.Wild-type true leaf;G,H.al mutant true leaf.Arrows indicate chloroplasts or chloroplast thylakoids圖4 黃瓜野生型和al突變體子葉及真葉的葉綠體形態(tài)觀察Fig.4 Morphology of cucumber wild-type and al mutant cotyledons and true leaves

2.4 黃瓜白化表型的遺傳分析與精細定位

對黃瓜Gy14×649和9930×649兩個雜交組合的F1、F2群體進行表型觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1個體表型均正常。利用Gy14×649、9930×649 F2群體出現(xiàn)的分離表型進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)Gy14×649、9930×649 F2群體中野生型與突變型植株數(shù)的比值分別為76∶25和69∶21，χ2測驗結果P>0.05(表2)，表明分離群體符合孟德爾遺傳定律3∶1分離比，即突變個體的表型是由單基因控制的隱性性狀，因此可使用F2群體對al基因進行定位和克隆。

表2 黃瓜al突變體F1和F2群體的遺傳分析Table 2 Genetic analysis of cucumber al mutants in F1 and F2 populations

利用課題組原有的7條黃瓜染色體上的SSR分子標記，用Gy14×649、9930×649的F2分離群體分別混合構建的野生型基因池(AL_)和突變型基因池(alal)進行篩選，以每對標記組合均能在兩基因池中擴增出相應的清晰主帶為準，最終在7號染色體上篩選出連續(xù)多態(tài)性SSR標記12對(SSR7001、SSR7011、SSR7012、SSR7013、SSR7014、SSR7016、SSR7020、SSR7025、SSR7026、SSR7027、SSR7029、SSR7031)，故將目的基因初步定位于7號染色體上。

對Gy14×649、9930×649 F2分離群體中分別混合構建的野生型基因池(AL_)和突變型基因池(alal)進行全基因組Bulk-seq測序。根據(jù)池間△SNP index的結果，在黃瓜7號染色體上發(fā)現(xiàn)一個潛在的差異連鎖區(qū)間，與初定位結果相同，可在7號染色體上對目標基因al進行進一步定位。

選用Gy14×649 F2群體中的96個al突變體單株對目的基因進行進一步定位分析發(fā)現(xiàn)，SSR7016、SSR7026距離目的基因位點最近，分居al兩側，兩標記間距離約為5.7 cM；同時選用9930×649 F2群體中96個al突變體單株進行定位，發(fā)現(xiàn)SSR7020、SSR7027距離目的基因位點最近，分居al兩側，兩標記間距離約為5.2 cM(圖5-A)。綜合標記SSR7016、SSR7026、SSR7020、SSR7027在基因組上的位置分布及交換事件數(shù)量變化情況，將al基因定位于SSR7020和SSR7026之間，遺傳距離約為2.3 cM(圖5-A)。

A.利用小群體將突變基因al初步定位于標記SSR7020與SSR7026之間；B.擴大群體將突變基因al定位于標記UW048449與UW048542之間，而UW048450和UW048465與al共分離；C.開發(fā)標記，最終將突變基因al定位于標記SNP5044706與SNP4730918之間A.Using primary populations,al gene was mapped between marker SSR7020 and SSR7026;B.Using enlarged populations,al gene was mapped between marker UW048449 and UW048542,and co-segregated with UW048450 and UW048465;C.After developing markers,al gene was finally mapped between marker SNP5044706 and SNP4730918圖5 黃瓜白化突變基因al的精細定位Fig.5 Fine mapping of cucumber al gene

在初步定位的多態(tài)性標記SSR7020和SSR7026之間繼續(xù)設計SSR分子標記，利用親本9930、Gy14及Gy14×649、9930×649的F1雜合個體和F2突變個體的DNA對開發(fā)標記進行多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)7個SSR分子標記(UW048441、UW048446、UW048449、UW048450、UW048465、UW048542、UW048595)對Gy14×649 F2群體存在多態(tài)性，而9930×649 F2群體只有1個多態(tài)性分子標記UW048595。在Gy14×649 F2群體中，使用al基因兩側標記SSR7016和SSR7026篩選出288個交換株，并在上述7個多態(tài)性標記中進行分析，結合其表型觀察，將包含al基因的物理區(qū)間縮小到UW048449與UW048542之間，約177 kb的區(qū)間內，包含5個交換單株，而標記UW048450和UW048465與al位點共分離。在9930×649 F2群體中，使用al基因兩側標記SSR7020和SSR7027篩選出192個交換單株，并用多態(tài)性標記UW048595分析交換單株，結合其表型最終將目的基因定位于SSR7020與UW048595之間，包含33個交換單株。因該群體定位區(qū)間遠大于Gy14×649 F2群體定位區(qū)間，故以UW048449與UW048542定位區(qū)間為準(圖5-B)。

根據(jù)上述定位結果，由于標記UW048450和UW048465與al位點呈共分離，故根據(jù)黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫信息和全基因組Bulk-seq測序結果，在UW048449和UW048542兩個SSR分子標記間繼續(xù)開發(fā)具有多態(tài)性的SNP和InDel標記，用于進一步縮小目的區(qū)間。在UW048542側繼續(xù)向內開發(fā)標記，分別以兩個F2分離群體的突變體及F1雜合個體為對照，在標記位置附近設計引物，擴增包含標記在內的序列，測序確定其是否具有多態(tài)性。用獲得的多態(tài)性標記InDel5235596繼續(xù)篩選9930×649 F2群體的交換單株，將交換事件縮減至13個。以此標記為基礎，繼續(xù)開發(fā)多態(tài)性標記并對剩余群體的交換單株進行篩選，其中在9930×649 F2群體中篩選出具有多態(tài)性的標記為InDel5177313、InDel5155588、SNP5118521、SNP4733568、SNP4730918，在Gy14×649 F2群體中篩選出具有多態(tài)性的標記僅有SNP4730918。經過篩選，在9930×649 F2群體中，InDel5177313標記獲得8個交換單株，InDel5155588標記篩選到7個交換單株，SNP5118521標記篩選到5個交換單株，SNP4733568標記篩選到2個交換單株；在Gy14×649 F2群體中，SNP4730918標記篩選到1個交換單株。根據(jù)標記在基因組上所在位置以及不同標記上交換株的數(shù)目變化，可推斷目的基因現(xiàn)定位于標記SNP4730918與 UW048449之間。同時在UW048449側篩選到多態(tài)性標記InDel5029382和SNP5044706，以F2群體突變體及F1雜合個體為對照，在2個標記上各得到1個交換單株。根據(jù)標記間位置信息及交換數(shù)目，最終將al基因定位于SNP5044706與SNP4730918標記之間，區(qū)間大小為66 kb(圖5-C)。

3 討 論

已有研究表明，由于控制葉綠素生物合成或葉綠體發(fā)育的基因沉默或失活，直接或間接影響葉綠素的合成與降解，從而導致突變體葉片中的各色素含量發(fā)生變化，最終形成葉色突變體[21]。除此之外，葉綠體結構發(fā)育異常也是形成葉色突變體的重要因素，如水稻[22-23]、小麥[24]等。故對葉色突變體的研究可從葉綠素合成與降解途徑、葉綠體結構等方面進行。

本試驗對黃瓜al突變體和野生型的光合色素含量及葉綠體結構分別進行了測定與觀察，結果表明al突變體的光合色素含量相對于野生型極顯著降低，其葉綠體結構形態(tài)異常且數(shù)量大幅度減少，可以預測其候選基因與控制葉綠素合成或葉綠體結構發(fā)育相關。因白化突變體苗期致死，不能進行正常的生長發(fā)育，故本試驗通過構建Gy14×649、9930×649兩個F2群體獲得分離群體中的白化突變個體，從而保證了分子標記定位過程中隱性群體的數(shù)目。同時統(tǒng)計群體后代野生型與突變體數(shù)量進行遺傳分析，結果表明該白化突變性狀符合孟德爾遺傳定律3∶1分離比，證明該性狀是由單隱性核基因控制的。本試驗將兩個分離群體Gy14×649、9930×649通過BSA混池法結合基因組重測序，準確地將黃瓜白化突變基因定位于7號染色體上。之后根據(jù)黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫預測信息及全基因組重測序結果，進一步開發(fā)標記并進行定位，最終將候選基因定位于SNP5044706與SNP4730918標記之間約66 kb的區(qū)間內。之后在此區(qū)間內繼續(xù)擴大篩選突變個體數(shù)量，但不能篩選出更多的交換單株，可能是突變體基因組在這一區(qū)段發(fā)生交換重組事件的概率較低所致。

現(xiàn)有黃瓜葉色突變體相關報道表明，控制葉色突變性狀的基因多參與編碼葉綠素合成途徑或與控制葉綠體結構的正常發(fā)育相關，如李萬青等[9]和Gao等[10]發(fā)現(xiàn)，黃瓜葉綠素缺陷突變體C528的最終候選基因CsChlI參與編碼Mg-螯合酶的CHLI亞基；朱偉偉等[25]研究認為，黃瓜芽黃突變體的形成與CLpP相關，且CLpP參與調控葉綠體發(fā)育、相關蛋白積累及光形態(tài)建成。故后期對定位區(qū)段內候選基因進行預測時，可以根據(jù)該基因功能是否與葉綠素合成、葉綠體結構相關進行分析確定。董翔宇[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜葉黃突變體yf的形成，同負責編碼與類囊體合成途經蛋白的基因Cucsa.099260發(fā)生突變相關，該基因與本研究預測基因均位于黃瓜7號染色體上，但經過基因定位區(qū)間比對發(fā)現(xiàn)，該突變基因并不存在于本研究最終定位的66 kb區(qū)間內，說明本研究的目的基因與上述定位基因并非同一基因，后續(xù)試驗需進一步對區(qū)間內候選基因功能進行分析，從而確定目的基因。

本試驗利用共同親本649與不同背景的兩個黃瓜測序品種Gy14、9930分別構建群體，同時對同一候選基因進行定位，可觀察到在不同背景下獲得的多態(tài)性標記不盡相同，且即使有相同的多態(tài)性標記，兩群體在同一位點的交換單株數(shù)量也存在差異， 這可能是親本遺傳背景不同導致的遺傳效應不同，也有可能是等位基因間存在一定程度的互作效應，具體原因需進一步探究。在結合基因組位置信息的情況下，使用多背景材料進行基因定位，可以提供更多的多態(tài)性分子標記，有助于加快基因定位工作，具有較高的應用價值。

4 結 論

本試驗對黃瓜白化al突變體進行了光合色素含量測定和葉綠體結構觀察，發(fā)現(xiàn)al突變體葉綠素含量極顯著降低，且葉肉細胞中幾乎不能觀察到葉綠體。通過構建Gy14×649、9930×649兩個F2群體對突變體進行擴繁，同時利用SSR分子標記技術結合重測序結果開發(fā)標記對突變基因al進行精細定位，最終將候選基因定位于黃瓜第7號染色體上約66 kb的區(qū)間內。