黃芪多糖對犬血清中白介素水平及腸道Toll樣受體信號通路的影響

舒迎霜，王承志，李思婷，賀濛初，夏曉冬,馮士彬，李 玉，王希春，吳金節(jié)

(安徽農業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230061)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類可以將特異性免疫和非特異性免疫聯系起來的重要蛋白質分子，其主要參與動物機體的天然免疫應答，在淋巴組織中表達較多，為動物機體免疫的第一道屏障[1-2]。TLRs最早在果蠅胚胎中被研究者們發(fā)現并命名，Toll樣蛋白與天然免疫分子白細胞介素1受體極為相似，隨后證實TLRs在果蠅真菌感染免疫過程中起重要作用，且果蠅細胞信號傳導途徑與哺乳動物類似[3-5]。目前在哺乳動物和人類中共發(fā)現了11個TLRs，Toll樣受體4(TLR4)是在細胞膜表面鑒定出的第一個蛋白質受體，廣泛表達于哺乳動物腸道、腎臟以及黏膜系統(tǒng)等，能夠識別革蘭氏陰性菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)；Toll樣受體7(TLR7)在多種免疫細胞以及淋巴組織中均有表達，在抗腫瘤、抗病毒和免疫調節(jié)等方面都有重要作用[6-8]。髓樣分化因子88(MyD88)是Toll樣受體信號通路中一個至關重要的銜接蛋白，在機體受到外界因素刺激時，TLR4和MyD88之間的TIR結構域會相互作用而激活MyD88依賴型信號通路，導致MyD88的死亡結構域與受體相關因子6(TRAF-6)相互作用并且活化激酶1(TAK1)，活化的TAK1通過MAPK信號通路激活轉錄因子激活蛋白-1(AP-1)，從而調節(jié)相關細胞因子的表達[9-10]。

黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)具有益氣固表之功效，可溶于水，并且在體內外均有顯著的免疫調節(jié)作用[11-12]。研究證實，APS可介導小鼠巨噬細胞表面TLR4信號通路，調節(jié)細胞因子的釋放，增強機體細胞免疫[13]。較多有關APS調節(jié)哺乳動物機體免疫功能的研究認為,TLR2、TLR4在APS調節(jié)機體免疫中扮演著重要角色，是APS的免疫識別受體，通過識別APS可激活機體細胞信號轉導途徑，從而增強對機體的免疫效果[14-15]。然而，APS介導Toll樣受體在動物機體內發(fā)揮免疫調節(jié)作用的機制仍不清楚，因此本研究以犬為對象，系統(tǒng)研究APS對犬的免疫調節(jié)作用，旨在探索TLR4信號通路在APS發(fā)揮免疫調節(jié)效應中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 18只比格犬，體質量約10 kg，由安徽農業(yè)大學動物醫(yī)院提供，試驗犬正常驅蟲及免疫，試驗前飼養(yǎng)2周，觀察是否健康。

1.1.2 試驗器材 電泳儀、凝膠成像儀，Biorad公司生產；TD-100小型提取濃縮機，浙江森力機械科技有限公司生產；MK3型半自動酶聯免疫分析儀，美國Thermo公司生產；LGJ-12N冷凍干燥機，北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司生產；CX31光學顯微鏡，日本OLYMPUS 公司生產；YD-1508 R輪轉式切片機，浙江金華益迪醫(yī)療設備廠生產。

1.1.3 主要試劑 黃芪飲片，購于安徽合肥梅山路立方大藥房；犬IL-2、IL-4和IL-6 ELISA試劑盒，購于上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、PBS緩沖液、多聚甲醛、枸櫞酸鈉、NaOH、食用酒精等，購于無錫展望化工試劑有限公司；SuperScript Ⅲ RT反轉錄試劑盒、Sybrqpcr mix，均購于ABI-invitrogen公司；TLR4、TLR7、MYD88、TRAF6、AP-1抗體，購于賽維爾生物科技有限公司；β-actin抗體，購于北京銳抗生物科技有限公司；山羊抗兔IgG抗體，購于北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 APS的制備 取黃芪飲片5 kg，充分清洗干凈，按質量(g)體積(mL)比為1∶10的比例加入食用酒精(乙醇含量為體積分數80%)，在約75 ℃下脫脂3次，每次1 h。將脫脂后的黃芪飲片在65 ℃左右烘干，按質量(g)體積(mL)比為1∶20的比例加入純凈水，超聲波提取80 min(超聲波功率為300 W，溫度80 ℃)，濃縮至4 L，添加12 L體積分數95%的酒精，靜置讓多糖充分沉淀，過濾去上清，向沉淀中加入足量純凈水溶解，加等量體積分數5%的三氯乙酸溶液，4 ℃放置1 d，以除去蛋白。次日，3 000 r/min離心5 min，取上清，用NaOH溶液調節(jié)至中性，濃縮至4 L，加酒精直至溶液中乙醇含量超過體積分數80%時停止，低溫靜置24 h左右，過濾，將得到的沉淀冷凍干燥，即得APS干燥粉。苯酚硫酸法測多糖質量分數為12.91%。

1.2.2 試驗分組及飼養(yǎng)管理 將18只比格犬隨機均分為對照組、APS低劑量組和APS高劑量組，分別飼喂基礎日糧、基礎日糧+質量分數1%的APS和基礎日糧+質量分數2%的APS。試驗期2周，期間每只犬單獨用籠，分開飼養(yǎng)，固定飲食，每日飼喂2次，每次150 g，自由飲水。

1.2.3 樣品采集 在試驗第0，7和14 天時，早間空腹采血，離心分離血清，用移液器將血清分裝保存于-20 ℃。第14 天，所有試驗犬麻醉放血后解剖，取十二指腸洗凈后分成2份，其中一份用40 g/L多聚甲醛溶液固定；另一份于凍存管中剪碎，放入液氮罐中速凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血清細胞因子的測定 采用ELISA試劑盒檢測犬血清中IL-2、IL-4和IL-6水平，根據試劑盒中標準品濃度以及測得的吸光值繪制標準曲線，計算得出待測樣品濃度。

1.2.5 TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白分布的檢測 采用免疫組化法檢測Toll樣受體相關蛋白(TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1)在犬十二指腸中的分布。從40 g/L多聚甲醛固定液中取出十二指腸包埋切片，將切片依次放入二甲苯、醇苯和酒精梯度溶液中進行脫蠟，用體積分數3%過氧化氫溶液孵育25 min，微波修復抗原，PBS沖洗4次；用PBS按體積比1∶200稀釋一抗(TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1抗體)后滴加到切片上，陰性對照用PBS代替一抗，4 ℃避光孵育過夜；次日將切片放入37 ℃烘箱復溫45 min，PBS沖洗4次，滴加二抗(山羊抗兔IgG抗體)，避光37 ℃孵育30 min，加DAB溶液終止染色，蘇木精復染4 min，體積分數1%鹽酸酒精分化液(1 mL濃鹽酸溶于99 mL無水乙醇)分化2 s，酒精梯度溶液脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠封片。待切片晾干后放置于Olympus顯微鏡下觀察拍照，最后將圖片導入軟件Image-Pro Plus 6.0，計算得到樣本蛋白表達平均光密度值，并用 GraphPad Prism繪制各個蛋白的光密度值柱狀圖。

1.2.6TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1基因mRNA相對表達量的檢測 以β-actin為內參基因，采用RT-qPCR法檢測犬十二指腸中TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1 mRNA的相對表達量。根據GenBank中發(fā)表的TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6、AP-1及β-actin基因序列(GenBank登錄號分別為NC_006593.3、NC_006597.3、NC_000019.10、NC_000022.11、NC_006600.3和NM_001003195.1)，采用Oligo 7軟件設計上、下游引物，引物序列如表1所示。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1 mRNA相對表達量檢測的qPCR引物參數Table 1 Detection qPCR primer parameters of TLR4,TLR7,MyD88,TRAF-6 and AP-1 mRNA

取出-80 ℃凍存的犬十二指腸樣本，液氮中磨碎，加1 mL Trizol繼續(xù)研磨，按提取試劑盒說明書中的步驟操作得到樣本的總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR反應體系：Sybrqpcr mix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL，dd H2O 6 μL，cDNA 2 μL。RT-qPCR反應程序：95 ℃預變性2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。對擴增結束后得到的數據采用2-ΔΔCt法進行分析，計算基因相對表達量。

1.2.7 TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白表達量的測定 取出-80 ℃保存的犬十二指腸組織，置于配制好的RAPI裂解液中，充分混勻裂解后4 ℃下12 000 g離心10 min，得到樣品總蛋白。采用Western Blots方法檢測TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白表達量，Western Blots上樣量為40 μg/孔，濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V，電泳時間約120 min。用準備好的PVDF膜以300 mA恒流轉膜26 min，將轉膜結束后的PVDF膜放入5% BSA溶液中，室溫于搖床上封閉2 h；用TBST稀釋一抗(TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1)，將膜放入一抗溶液中，放于冰箱4 ℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；加入稀釋后的辣根酶二抗溶液，室溫孵育30 min，TBST溶液清洗3次，每次5 min；將膜放入化學發(fā)光檢測儀中，加入顯色液，調整曝光條件開始檢測，通過軟件Quantity One測得條帶的灰度值，以β-actin為內參蛋白，待測蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值即待測蛋白的相對表達量。

1.2.8 數據分析 所有測得的數據均通過SPSS 軟件進行進一步分析，數據結果以“平均數±標準差”表示，采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)以及最小顯著差數(LSD)法對試驗數據進行數理統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 黃芪多糖(APS)對犬血清中IL-2、IL-4和IL-6含量的影響

由表2～4可知，第0 天時，3組犬血清IL-2、IL-4和IL-6質量濃度差異均不顯著(P>0.05)。第7 天時，APS低劑量組犬血清IL-2、IL-4和IL-6質量濃度較對照組顯著升高(P<0.05)；APS高劑量組較對照組極顯著升高(P<0.01)，較APS低劑量組顯著升高(P<0.05)。第14 天時，與對照組相比，APS低劑量組犬血清IL-2和IL-6質量濃度極顯著升高(P<0.01)，IL-4質量濃度顯著升高(P<0.05)；APS高劑量組IL-2、IL-4和IL-6質量濃度均極顯著升高(P<0.01)，但與APS低劑量組相比，APS高劑量組IL-4和IL-6質量濃度升高不顯著(P>0.05)，而IL-2顯著升高(P<0.05)。

表2 黃芪多糖(APS)對犬血清中IL-2水平的影響(n=6)Table 2 Effect of astragalus polysaccharide (APS) on IL-2 level in canine serum(n=6) pg/mL

表3 黃芪多糖(APS)對犬血清中IL-4水平的影響(n=6)Table 3 Effect of astragalus polysaccharide (APS) on IL-4 level in canine serum(n=6) pg/mL

表4 黃芪多糖(APS)對犬血清中IL-6水平的影響(n=6)Table 4 Effect of astragalus polysaccharide (APS) on IL-6 level in canine serum(n=6) pg/mL

2.2 黃芪多糖(APS)對犬十二指腸中5種Toll樣受體蛋白腸道分布的影響

免疫組化試驗中，目的蛋白陽性區(qū)域呈棕黃色，細胞核呈藍色，細胞膜不著色。檢測結果(圖1)顯示，TLR4、TLR7、MyD88、AP-1、TRAF-6蛋白均在十二指腸中表達，其主要表達區(qū)域為腸絨毛外側與腸壁細胞內。

圖1 不同劑量黃芪多糖影響下5種Toll樣受體蛋白在犬十二指腸中的分布Fig.1 Distribution of five Toll-like receptor proteins in duodenum of canine treated by different doses of astragalus polysaccharide

由圖2可知，APS低劑量組TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白分布量(即平均光密度值)顯著高于對照組(P<0.05)，APS高劑量組TLR4、MyD88 、TRAF-6和AP-1蛋白分布量顯著高于對照組(P<0.05)，TLR7極顯著高于對照組(P<0.01)。APS低劑量組與APS高劑量組相比，5種蛋白分布量均無顯著差異(P>0.05)。

圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),and different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01),the same below圖2 黃芪多糖(APS)對犬十二指腸中TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白分布量的影響Fig.2 Effect of APS on distribution of TLR4,TLR7,MyD88,TRAF-6 and AP-1 proteins in canine duodenum

2.3 黃芪多糖(APS)對犬十二指腸中5種Toll樣受體基因mRNA相對表達量的影響

由圖3可知，APS低劑量組TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1 mRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；APS高劑量組TLR4、TRAF-6和AP-1 mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，TLR7和MyD88 mRNA相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)。APS低劑量組與APS高劑量組相比，5種基因 mRNA的相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 黃芪多糖(APS)對犬十二指腸TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1基因mRNA相對表達量的影響Fig.3 Effect of APS on the relative expression of TLR4,TLR7,MyD88,TRAF-6 and AP-1 mRNA in canine duodenum

2.4 黃芪多糖(APS)對犬十二指腸中5種Toll樣受體蛋白表達量的影響

由圖4可知，與對照組相比，APS低劑量組十二指腸TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，TLR4蛋白表達量極顯著上升(P<0.01);APS高劑量組腸道TLR7和TRAF-6蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，TLR4、MyD88和AP-1蛋白表達量極顯著上升(P<0.01)。APS低劑量組與APS高劑量組相比，5種受體蛋白表達量差異均不顯著(P>0.05)。

圖4 黃芪多糖(APS)對犬十二指腸中TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和 AP-1蛋白表達量的影響Fig.4 Effect of APS on expression of TLR4,TLR7,MyD88,TRAF-6 and AP-1 proteins in canine duodenum

3 討 論

研究發(fā)現，黃芪多糖等中藥多糖可以使血液中細胞免疫因子IL-2、IL-4和IL-6水平升高[16]。而血清中IL-2、IL-6水平升高，可刺激T細胞活性且能促進其分泌干擾素γ(IFN-γ)，而且IL-2和IL-6可共同誘導細胞毒性T細胞增殖并延長其存活時間，從而起到抗腫瘤的作用[17]。IL-4在體內的主要作用為誘導淋巴B細胞增殖，增加免疫球蛋白分泌，提高機體體液免疫的能力[18]。因此，體內IL-2、IL-4、IL-6的適度提高可以增強機體免疫力，而過高的IL-2、IL-4、IL-6則會導致炎癥的產生[19]。另外，在日糧中添加黃芪多糖可以使犬血清中IgG、IgA、IgM水平顯著升高[20]。本研究發(fā)現，在犬日糧中加入1%和2%的黃芪多糖可以使血清IL-2、IL-4、IL-6水平顯著升高；在第7 天時，黃芪多糖高劑量組IL-2、IL-4、IL-6水平顯著高于黃芪多糖低劑量組；第14天時，黃芪多糖高劑量組IL-2水平顯著高于黃芪多糖低劑量組，IL-4、IL-6與黃芪多糖低劑量組差異不顯著。表明添加2%黃芪多糖可以短時間內使犬體內的IL-2、IL-4、IL-6升高至峰值，而添加1%黃芪多糖在飼喂14 d后也可以接近或達到添加2%黃芪多糖的效果。

Zhou等[21]研究證明，黃芪多糖可調節(jié)小鼠TLR4受體通路，并增加MyD88依賴型信號通路表達，Myd88蛋白可以通過影響下游蛋白TRAF-6與AP-1直接調節(jié)IL-6的分泌。另有研究表明，中藥多糖可結合雞淋巴細胞表面TLR4受體，介導TLR4通路下游TRIF依賴性途徑，從而調節(jié)細胞免疫[22]；TLR7受體蛋白通路則可以刺激淋巴B細胞產生IgG、IgA和IgM[23]。因此，Toll樣受體通路可以通過影響細胞因子和免疫球蛋白分泌參與犬體內多種免疫反應。本研究發(fā)現，飼喂黃芪多糖可以顯著提高犬腸道中TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6和AP-1蛋白及其mRNA的相對表達量，與之前研究結果相符，且這些蛋白及其mRNA相對表達量隨黃芪多糖添加量的增加而增大，而血清IL-2、IL-4、IL-6水平與TLR4受體蛋白的變化趨勢大致相符。

多項研究證明，日糧中添加黃芪多糖可有效提高動物的免疫力[24-25]。但關于黃芪多糖對Toll樣受體通路影響的研究主要集中于禽類、小鼠以及小鼠細胞，其他動物涉及較少。本研究通過體內試驗，探究了黃芪多糖對犬TLR4和TLR7受體通路的影響及對血清中IL-2、IL-4、IL-6水平的影響，但本研究目前只進行了體內飼喂試驗，下一步將進行細胞試驗，通過添加TLR4、TLR7通路蛋白抑制劑，驗證黃芪多糖與IL-2、IL-4、IL-6水平的直接關聯。

4 結 論

在犬日糧中添加黃芪多糖可顯著提高血清中IL-2、IL-4和IL-6水平，增加腸道中TLR4、TLR7、MyD88、TRAF-6、AP-1蛋白水平及mRNA水平的相對表達量，通過調節(jié)Toll樣受體信號通路提高機體免疫力。