促微管聚合蛋白3在人胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

錢曉蘭，陳志鵬，盧瑋冬，朱惠平

（蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院腫瘤科，江蘇 張家港 215600）

促微管聚合蛋白3（TPPP3）是促微管聚合蛋白家族（TPPPs）成員之一，又稱為TPPP/p20、p20或p25-7，包含有176 個氨基酸，由TPPP3基因唯一編碼，定位在第16號染色體上(16q22.1)。TPPPs能與微管蛋白結(jié)合，促使微管聚集，維持微管系統(tǒng)的穩(wěn)定性和完整性。TPPP3的功能區(qū)主要在其羧基段的一個保守的p25-α結(jié)構(gòu)域[1-2]，具有促進(jìn)微管蛋白聚合和組裝的能力。

最近研究表明，TPPP3和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。Zhou等[3]研究發(fā)現(xiàn)TPPP3在宮頸癌HeLa細(xì)胞中高表達(dá)，隨后，Zhou等[4]證實在裸鼠移植瘤模型中抑制TPPP3表達(dá)能干擾細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而阻遏腫瘤細(xì)胞的增殖。Pastor等[5]發(fā)現(xiàn)肺癌患者中TPPP3含量明顯增加。李建華等[6]研究發(fā)現(xiàn)肝癌中TPPP3過表達(dá)，并通過凋亡依賴的方式調(diào)控細(xì)胞增殖。此外，TPPP3還可調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤生長。Li等[7]通過對非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者進(jìn)行組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)，TPPP3在肺癌組織中的表達(dá)較癌旁組織高，且與患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)外實驗表明TPPP3可能在NSCLC中起癌基因的作用。Li等[8]發(fā)現(xiàn)TPPP3的上調(diào)與NSCLC的轉(zhuǎn)移能力增加相關(guān)。異位表達(dá)TPPP3可顯著增強體外細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長。此外，過表達(dá)TPPP3顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲，同時在體內(nèi)外上調(diào)Twist1。Ye等[9]發(fā)現(xiàn)敲低TPPP3可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Shen等[10]發(fā)現(xiàn)抑制TPPP3可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，Ren等[11]發(fā)現(xiàn)TPPP3沉默可抑制NF-κB/COX2信號通路，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，表明TPPP3在結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中起重要作用。

以上研究報道表明，TPPP3在肝癌、結(jié)直腸癌、NSCLC等腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織，可能與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但是TPPP3在其他腫瘤上的表達(dá)及TPPP3導(dǎo)致腫瘤的分子機制、靶向作用機制等，目前仍不明確，需要進(jìn)一步的研究和探討?；谝陨涎芯勘尘昂湍壳癟PPP3在胃癌研究中的空白，本課題組將通過檢測胃癌組織、癌旁正常組織中TPPP3的表達(dá)水平，探討TPPP3基因在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床生物學(xué)行為和患者生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例收集 本研究選取2014年07月—2017年01月在蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院接受胃癌手術(shù)的患者，共收集102 例胃癌組織及其匹配的癌旁組織（界定為癌灶外5 cm以上）。病例納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)胃癌根治術(shù)后（R0切除）；(2)組織病理學(xué)證實為胃腺癌；(3)手術(shù)前未接受過抗腫瘤治療；(4)患者以及家屬對該研究均知情，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)手術(shù)前接受過抗腫瘤治療者；(2)哺乳期及妊娠期女性；(3)合并其他尚未治愈的惡性腫瘤；(4)合并有內(nèi)分泌、代謝性、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病者。所有病例術(shù)后病理均應(yīng)確診為胃癌，并記錄其完整的臨床病理資料。術(shù)中取得標(biāo)本后常規(guī)固定包埋切片。所有患者術(shù)前均未行任何形式新輔助治療或轉(zhuǎn)化治療。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查后批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 實驗方法 所有胃癌組織標(biāo)本收集后常規(guī)固定、石蠟包埋后，4 μm連續(xù)切片。石蠟切片在二甲苯中分離，在分級乙醇中再水化，使用EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，使用Dako試劑盒中提供的過氧化物酶阻斷劑（SM801）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。隨后使用兔抗人TPPP3多克隆抗體（Abcam）、EnVision? FLEX/HRP（Dako）孵育，再經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水封片，最后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 結(jié)果判定由兩名研究者在病理醫(yī)師指導(dǎo)下獨立閱片完成，以染色陽性強度作為TPPP3表達(dá)的主要判定指標(biāo)，染色陽性強度評分＝染色強度評分×染色陽性率評分。染色強度判定依次為無色（0 分，陰性），淡黃色（1 分，1＋），棕黃色（2 分，2＋）；染色陽性率判定：在正置光學(xué)顯微鏡下（200×）隨機選取5 個染色不同的視野，每個視野隨機計數(shù)出的100 個細(xì)胞，然后計算100 個細(xì)胞中陽性細(xì)胞占的百分率，最終取5個陽性率的平均值。將其換算為評分：0 分（陰性），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3分（51%～75%），4 分（76%～100%）。癌組織和癌旁組織分別判讀。染色陽性強度判斷及對應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)為：≤ 2 分（-），3～5 分（＋），6～8分（＋＋）。根據(jù)TPPP3表達(dá)的中位值，總評分＞2 分為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 23.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用率（%）表示，分類變量的組間差異采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，來判斷TPPP3在人胃癌組織中的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性。而其與預(yù)后的相關(guān)性采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，Log-rank檢驗評估生存差異，COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例一般情況 本研究共收集102 例胃癌患者，其中男性79 例，女性23 例；年齡31～83 歲，中位年齡66.5 歲，按年齡分為高齡組（≥60 歲）69例，低齡組（＜60 歲）33 例；病理類型：102 例均為腺癌；組織分化：中/高分化29 例，低分化73例；腫塊大小≥5 cm者65 例，＜5 cm者37 例；有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76 例，無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26 例。按浸潤深度分兩組，T1/T2（未侵及漿膜層者）14 例，T3/T4（侵及漿膜和漿膜外者）88 例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）/國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）2016年10月頒布的第八版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計，Ⅰ＋Ⅱ期42例，Ⅲ期60 例。

2.2 TPPP3在胃癌組織及癌旁組織的表達(dá) 經(jīng)免疫組化檢測，結(jié)果顯示，TPPP3在胃癌癌細(xì)胞的胞漿中有表達(dá)，呈棕黃色顆粒染色（圖1A），在胃癌癌旁上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，但染色較淺，呈淡黃色顆粒染色（圖1B），具體染色評分判定見圖2。102 例胃癌組織中，79 例（77.5%）表達(dá)陽性，23例（22.5%）表達(dá)陰性，而在癌旁組織中，35 例（34.3%）表達(dá)陽性，67 例（65.7%）表達(dá)陰性，TPPP3在胃癌癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝38.494，P＜0.001）。

圖1 TPPP3在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況（IHC，200×）

圖2 TPPP3在胃癌組織中的染色情況（IHC，200×）

2.3 TPPP3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 腫塊＜5 cm的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為59.5%，腫塊≥5 cm的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為87.7%，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.001）；無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為53.8%，有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為85.5%，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.001）；浸潤深度為T1/T2的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為42.9%，浸潤深度為T3/T4的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為83.0%，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.003）；TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為61.9%，TNM分期為Ⅲ期的胃癌組織中的TPPP3陽性表達(dá)率為88.3%，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.002）。而TPPP3的陽性表達(dá)與性別、年齡及組織分化程度無關(guān)（P＞0.05）（見表1）。

表1 102 例胃癌患者TPPP3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 TPPP3在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌生存期的關(guān)系 對102 例胃癌患者進(jìn)行后期隨訪，從2014年08月開始隨訪至2019年08月，中位隨訪時間33.3 個月，通過門診和電話隨訪，定期復(fù)查CT和胃鏡，其中85例患者隨訪資料完整，失訪患者17 例。隨訪截止時，所有患者的1 年、2 年和3 年的總生存率分別是78.8%、64.7%和45.9%，共有46 例患者死亡，其中有41 例的死因與胃癌或者治療相關(guān)，另有5 例死于心腦血管疾病、肺炎等非胃癌、治療相關(guān)疾病。

采用Kaplan-Meier法分析胃癌組織中TPPP3表達(dá)對患者總生存期（overall survival, OS）的影響，得出結(jié)果：胃癌組織中TPPP3表達(dá)陽性的患者術(shù)后1 年、2 年和3 年的總生存率分別是78.5%、60.0%和38.5%，而 TPPP3表達(dá)陰性的患者術(shù)后1 年、2 年和3 年的總生存率分別是78.9%、73.7%和67.5%，生存曲線看出第3年的存活率兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組的生存結(jié)果采用Log-rank時序檢驗進(jìn)行生存分析結(jié)果顯示TPPP3在胃癌組織中表達(dá)陽性有降低患者OS的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3.589，P＝0.058）（見圖3A）。采用Kaplan-Meier法進(jìn)一步分析胃癌組織中TPPP3表達(dá)對患者無病生存期（disease-free survival, DFS）的影響，結(jié)果顯示胃癌組織中TPPP3表達(dá)陽性的患者術(shù)后1 年、2 年和3 年的無病生存率分別是42.6%、23.3%和23.3%，而 TPPP3表達(dá)陰性的患者術(shù)后1 年、2 年和3 年的無病生存率分別是79.2%、67.7%和67.7%。兩組的生存結(jié)果采用Log-rank時序檢驗進(jìn)行生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPPP3表達(dá)陽性的患者DFS明顯低于TPPP3蛋白表達(dá)陰性的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝9.006，P＝0.003）（見圖3B）。

圖3 TPPP3陽性與陰性表達(dá)胃癌患者的OS（A）和DFS（B）生存曲線圖，其中綠線代表陽性表達(dá)組，藍(lán)線代表陰性表達(dá)組，菱形代表刪失數(shù)據(jù)

應(yīng)用COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPPP3的表達(dá)水平（P＝0.035）、浸潤深度（P＝0.046）和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.044）可能是影響胃癌患者DFS的獨立因素（見表2）。

表2 影響胃癌患者DFS的多因素生存分析

3 討論

根據(jù)既往文獻(xiàn)報道，TPPP3在宮頸癌HeLa細(xì)胞、Lewis肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，在人肝癌、結(jié)直腸癌、NSCLC組織中的表達(dá)水平亦高于正常組織，且后續(xù)研究表明，TPPP3高表達(dá)與肝癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移相關(guān)。然而，迄今尚未有文獻(xiàn)報道TPPP3在胃癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義。本研究通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)TPPP3在胃癌組織、癌旁組織均有表達(dá)，其中TPPP3在胃癌組織中主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞漿中，呈棕黃色顆粒染色，而TPPP3在癌旁上皮細(xì)胞中也表達(dá)，但染色較淺。102 例胃癌癌組織中，腫瘤組織陽性表達(dá)率為77.5%（79/102），癌旁組織中的陽性表達(dá)率為34.3%（35/102），兩者陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

以往的部分研究顯示，腫瘤細(xì)胞中TPPP3的表達(dá)水平可能與腫瘤的臨床病理特征及患者預(yù)后相關(guān)。NSCLC細(xì)胞中TPPP3表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈顯著正相關(guān)性，而與年齡、性別、腫瘤位置等無關(guān)[7]。結(jié)直腸癌細(xì)胞中TPPP3表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[9]。在本研究中：在胃癌病灶≥5 cm、有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度為T3/T4及TNM分期為Ⅲ期的病例中，TPPP3陽性表達(dá)率較高，提示TPPP3高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，該結(jié)果與既往其他瘤種的研究結(jié)果一致。

本研究同時探究了胃癌組織中TPPP3表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示TPPP3表達(dá)陽性患者與陰性患者的術(shù)后1 年、2 年和3 年的總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而TPPP3表達(dá)陽性患者與陰性患者術(shù)后1 年、2 年和3 年的無病生存率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組的生存結(jié)果采用Kaplan-Meier生存分析法進(jìn)行生存期單因素分析，結(jié)果顯示胃癌中TPPP3表達(dá)陽性的患者DFS明顯低于TPPP3表達(dá)陰性的患者，而TPPP3表達(dá)陽性有降低患者生存的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2～3 年DFS完全相同說明所有患者的復(fù)發(fā)發(fā)生在2 年內(nèi)，在第3年的復(fù)發(fā)人數(shù)為0。復(fù)發(fā)都發(fā)生在2 年內(nèi)，意味著復(fù)發(fā)的患者在第3年有較大的概率死亡，從OS的生存曲線看出，第3年的存活率兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPPP3的表達(dá)水平（P＝0.035）、浸潤深度（P＝0.046）和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.044）可能是影響胃癌患者DFS的獨立因素。TNM分期與胃癌患者DFS無關(guān)可能與統(tǒng)計病例數(shù)偏少有關(guān)。在其他相關(guān)文獻(xiàn)報道中，NSCLC細(xì)胞中TPPP3高表達(dá)與患者OS短相關(guān)，提示TPPP3高表達(dá)與NSCLC的預(yù)后不良有關(guān)[7]；結(jié)直腸癌細(xì)胞中TPPP3高表達(dá)與較短的OS及DFS相關(guān)[9]。然而，在本研究中并未發(fā)現(xiàn)TPPP3高表達(dá)與胃癌患者OS的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，考慮可能與以下因素有關(guān)：1.本研究中位隨訪時間為33.3 個月，故僅統(tǒng)計了3 年以內(nèi)的生存結(jié)果，而延長隨訪時間可能得到更確切的長期生存結(jié)果；2.出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移后，部分患者選擇了挽救治療、姑息治療，包括手術(shù)、放療、化療及靶向治療，另有小部分患者因各種原因放棄了后續(xù)治療，故復(fù)發(fā)后的治療情形復(fù)雜，可能對總體的生存期造成影響，引起結(jié)果的偏倚，將來可增加入組患者的病例數(shù)并依據(jù)術(shù)后復(fù)發(fā)治療策略進(jìn)行分層分析得出更可靠的結(jié)果。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示，胃癌組織中TPPP3的表達(dá)水平與腫塊大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及TNM分期呈正相關(guān)，而與患者性別、年齡、組織分化程度并無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。另外，TPPP3高表達(dá)導(dǎo)致了胃癌患者DFS的明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但兩組OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。TPPP3的表達(dá)水平、浸潤深度和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是影響胃癌患者DFS的獨立因素。因此，我們認(rèn)為TPPP3可能參與了胃癌的發(fā)生，并可促進(jìn)腫瘤組織生長，而TPPP3高表達(dá)有導(dǎo)致術(shù)后疾病復(fù)發(fā)的趨勢。但目前TPPP3在胃癌發(fā)生發(fā)展過程及生物學(xué)行為中的具體作用機制尚不完全清楚，今后有待進(jìn)一步進(jìn)行分子水平、細(xì)胞水平及動物實驗予以探究及證實。