產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對(duì)多粘菌素異質(zhì)性耐藥及治療策略的研究

程可平，艾 濤，焦 政

（江西省進(jìn)賢縣人民醫(yī)院，江西 進(jìn)賢 331700）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, Kpn）在臨床上存在于多個(gè)系統(tǒng)疾病中，例如肺炎、氣管炎、泌尿疾病等[1]。產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌是Kpn的一個(gè)主要耐藥菌類(lèi)型。耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）在全球眾多國(guó)家均有發(fā)現(xiàn)，并具有廣泛流行性，是腸道感染的主要病原菌，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康[2]。近年來(lái)，由于Kpn對(duì)幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物及多種非β-內(nèi)酰胺藥物的耐藥性不斷增加，臨床抗菌藥物的選擇非常受限制[3]。因而碳青霉烯類(lèi)抗生素特別是廣譜抗生素的使用不斷增加，但是越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)CRKP對(duì)其耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，尤其是多重耐藥菌株的檢出率不斷提高，導(dǎo)致臨床療效不理想[4-5]。多粘菌素由于其可能會(huì)對(duì)腎臟和神經(jīng)造成損傷，過(guò)去臨床應(yīng)用較少，但是現(xiàn)在對(duì)多重耐藥菌并無(wú)有效抗菌藥物，因此多粘菌素被重新應(yīng)用，且成為治療多重耐藥革蘭陰性菌最直接、有效的抑菌方案[6-7]。大量研究發(fā)現(xiàn)在多粘菌素發(fā)揮抑菌作用的過(guò)程中，有新的耐CRKP菌株出現(xiàn)。因此本文通過(guò)本院收治72 株CRKP菌探討對(duì)多粘菌素異質(zhì)性耐藥及治療策略。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集本院2017年1月—2018年12月微生物實(shí)驗(yàn)分離出CRKP菌72 株，所有菌株的來(lái)源均為本院臨床病人，菌株保存在甘油肉湯中，采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)分析，檢測(cè)結(jié)果按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。質(zhì)控菌株為Kpn ATCCBAA-1705、ATCCBAA-1706，購(gòu)自衛(wèi)生部門(mén)。

1.2 儀器及試劑 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（梅里埃VITEK 2 Compact），PCR儀（PD公司，美國(guó)）；－80 ℃低溫冰箱（海爾生物醫(yī)療）；瓊脂糖（Biskanten，青島）；QW988-WGZ-2XJP比濁儀（北京海福達(dá)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液配置及鑒定：將臨床分離株均勻接種于血瓊脂平板上，隨機(jī)挑取5 個(gè)菌落，采用無(wú)菌生理鹽水配置菌懸液，比濁儀測(cè)定菌懸液濃度并調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋s為1.5 ×108/mL），按說(shuō)明書(shū)操作步驟采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定菌株。

1.3.2 藥敏實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用藥敏復(fù)合板進(jìn)行常規(guī)藥物敏感實(shí)驗(yàn)，抗菌藥物分別為美羅培南、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、莫西沙星、克拉維酸、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、替加環(huán)素、多粘菌素B、氨曲南。

1.3.3 改良Hodge試驗(yàn)：將0.5麥?zhǔn)蠞岫菿pn用無(wú)菌生理鹽水按1:10的比例稀釋?zhuān)鶆蛲磕ǖ組H瓊脂平板上，靜置10 min，將美羅培南紙片貼在紙板中央，挑取3～5 個(gè)菌落垂直于紙片，在平板與紙片中間畫(huà)線(xiàn)，37 ℃孵育18～24 h，若劃線(xiàn)處有菌群生長(zhǎng)，表示該菌株產(chǎn)KPC酶。陽(yáng)性對(duì)照為Kpn ATCCBAA-1705，陰性對(duì)照為Kpn ATCCBAA-1706。

1.3.4 耐藥基因檢測(cè)：煮沸法提取菌群DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)耐藥基因blamcr-1、blaKPC、blaCTX-M和blaNDM-1，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，陽(yáng)性產(chǎn)物通過(guò)上海鉑尚公司檢測(cè)，PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 微量棋盤(pán)稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration, MIC）和分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration, FIC）：采用MH肉湯培養(yǎng)基將菌懸液按1:8比例稀釋?zhuān)謩e倍比稀釋多粘菌素B、美羅培南和利福平至7個(gè)濃度梯度，濃度范圍為多粘菌素B 0.5～256 μg/mL，美羅培南5～2 560 μg/mL，利福平2.5～1 280 μg/mL。在96孔板上按棋盤(pán)分布分別將多粘菌素B與美羅培南、利福平組合，每孔添加50 μL稀釋藥液再加入100 μL稀釋菌液，37 ℃孵育20 h，肉眼觀(guān)察MIC，并計(jì)算FIC，F(xiàn)IC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，2＜FIC≤2為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用。FIC＝MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用＋MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用WHONET 5.4統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行菌群藥物敏感、耐藥等數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株來(lái)源及分布 72 株CRKP菌來(lái)源分別為神經(jīng)內(nèi)科15 株，ICU 14 株，神經(jīng)外科10 株，泌尿外科9株，呼吸內(nèi)科8 株，急診內(nèi)科6 株，急診ICU 4 株，普外科3 株，血液內(nèi)科2 株，肝病科1 株。送檢樣本包括痰42 株，尿液18 株，腹水4 株，全血3 株，腦脊液3 株，切口分泌物3 株。

2.2 CRKP對(duì)抗菌藥物敏感度 在72 株CRKP菌中，耐藥程度依次是：替加環(huán)素（80.20%）、環(huán)丙沙星（73.50%），克拉維酸（45.80%）、頭孢噻肟（39.30%）；多粘菌素B敏感度最高為100%，其次是美羅培南96.10%，見(jiàn)表2。

表2 CRKP對(duì)抗菌藥物敏感度（%）

2.3 改良Hodge實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在所有CRKP菌株中，發(fā)現(xiàn)在劃線(xiàn)處出現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)，通過(guò)改良Hodge試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)65 株陽(yáng)性表達(dá)為產(chǎn)碳青霉烯酶Kpn，陽(yáng)性率為90.28%，見(jiàn)圖1。

圖1 改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果

2.4 耐藥基因檢測(cè) PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，KPC-2菌株陽(yáng)性數(shù)量為66 株，但未見(jiàn)mcr、CTX-M及NDM-1陽(yáng)性菌表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 KPC-2凝膠電泳結(jié)果

2.5 藥物聯(lián)用對(duì)CRKP的FIC分布及協(xié)同作用率比較 多粘菌素B與美羅培南組合的協(xié)同抑菌率為58.33%，相加抑菌率為41.65%，多粘菌素B與利福平組合的協(xié)同抑菌率為70.83%，相加抑菌率為29.17%，二者的無(wú)關(guān)和拮抗作用均為0%，兩組藥物的協(xié)同作用率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.459，P＝0.117），見(jiàn)表3。

表3 藥物聯(lián)用對(duì)CRKP的FIC分布及協(xié)同作用率比較[例(%)]

3 討論

Kpn引起的感染在臨床上比較常見(jiàn)，大量臨床病例發(fā)現(xiàn)，此類(lèi)患者通常需要進(jìn)行有創(chuàng)性操作治療，包含深靜脈置管及氣管插管等，導(dǎo)致機(jī)體菌群紊亂，大大增加感染風(fēng)險(xiǎn)，引起感染性疾病。Kpn感染易發(fā)于老人、幼兒及免疫力低下者，研究[8-9]表明ICU患者更容易感染Kpn。耐碳青霉烯類(lèi)藥物在治療Kpn時(shí)廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致其耐藥性逐漸提高，因此CRKP的檢出形勢(shì)不容樂(lè)觀(guān)[10]。因此以多粘菌素為基礎(chǔ)的針對(duì)CRKP耐藥性用藥方案在臨床應(yīng)用中具有重要作用。

本文研究發(fā)現(xiàn)CRKP的來(lái)源多數(shù)在ICU、神經(jīng)內(nèi)外科，在患者的痰及尿液中較多，神經(jīng)外科一般是對(duì)腦部進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后需要在ICU病房進(jìn)行觀(guān)察，患者病情嚴(yán)重且免疫能力低下，易出現(xiàn)反復(fù)感染，需要長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行抗菌治療，致使ICU成為多重耐藥菌容易爆發(fā)流行地點(diǎn)[11-12]。在72 株CRKP中，對(duì)替加環(huán)素的耐藥性超過(guò)80%，對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性達(dá)到70%以上，說(shuō)明KPC酶能夠引起Kpn對(duì)各種臨床常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，而對(duì)多粘菌素B的敏感性為100%，表明CRKP對(duì)多粘菌素B非常敏感，臨床治療效果較為理想。

在72 株CRKP中，共有65 株CRKP為產(chǎn)KPC陽(yáng)性，占90.28%，PCR檢測(cè)耐藥基因發(fā)現(xiàn)有66株CRKP的KPC-2基因表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為91.67%，KPC-2基因檢測(cè)的準(zhǔn)確度高于改良Hodge試驗(yàn)。KPC的基因可選擇性進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并依靠多種基因進(jìn)行多重傳播，從而進(jìn)行耐藥和移動(dòng)，后者也是引發(fā)Kpn耐藥并進(jìn)行多重感染的重要機(jī)制[13-14]。CRKP包含許多耐藥機(jī)制，在細(xì)菌細(xì)胞壁上出現(xiàn)大量青霉素結(jié)合蛋白改變，并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯水解酶占據(jù)主導(dǎo)因素，其中KPC-2基因是造成醫(yī)院感染Kpn耐藥的主要基因，KPC-2在Kpn中的作用不可忽視[15]。

本文為了探討多粘菌素B對(duì)CRKP的抑菌程度，采用聯(lián)合藥物作用發(fā)現(xiàn)與美羅培南聯(lián)合后，協(xié)同作用為58.33%，相加作用為41.67%，與利福平聯(lián)合后發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用70.83%，相加作用為29.17%，兩種聯(lián)合方法均對(duì)CRKP有良好的抑制作用。周翔等[16]的研究中采用多粘菌素B聯(lián)合用藥對(duì)Kpn進(jìn)行抗菌效果分析，協(xié)同作用率為85.71%。張愛(ài)榮[17]將亞胺培南與多粘菌素B聯(lián)合對(duì)Kpn主要具有協(xié)同作用。本文研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果相似，可能與藥物抗藥效果及菌株特異性有關(guān)。卞婷婷等[18-19]研究證實(shí)通過(guò)多粘菌素B和磺胺類(lèi)及其他類(lèi)聯(lián)合用藥對(duì)KPC菌株出現(xiàn)協(xié)同作用，這與施騰飛等[20]研究結(jié)果一致。

綜上所述，早期預(yù)防和治療是應(yīng)對(duì)CRKP的有力措施，需運(yùn)用科學(xué)方式進(jìn)行抗菌藥物治療。采用多粘菌素B聯(lián)合其他抗菌藥物，對(duì)CRKP的抑菌效果較好，為臨床抗感染治療帶來(lái)新的選擇。