大鼠髓核細(xì)胞退變模型的對比研究

杜 彤，謝依彤，王鵬博，戴順捷，耿德春，毛海青

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215006）

腰背痛（low back pain, LBP）是全球性的健康難題，約84%的成人在其一生中至少會發(fā)生一次LBP，且其中大約23%的患者癥狀會持續(xù)存在[1]。研究[2]證實，在美國，每年因LBP所引起的經(jīng)濟損失高達(dá)6 250億 美元。在中國，LBP所致的傷殘損失壽命年高達(dá)1 634.7萬人年，是導(dǎo)致中國人群傷殘負(fù)擔(dān)的第一原因[3-4]。研究顯示，椎間盤退變（intervertebral disc degeneration, IVDD）是誘發(fā)LBP的首要原因。然而，目前對于LBP的治療局限于藥物或者手術(shù)緩解癥狀，而針對IVDD并沒有有效的治療方法。椎間盤體外退變模型的建立是探究IVDD發(fā)生發(fā)展機制及找尋治療方法的基礎(chǔ)。因此，對比不同模型間的優(yōu)缺點以找出合適的體外退變模型具有十分重要的臨床意義。

椎間盤主要由三個部分組成：中央富于彈性的髓核、包繞于髓核外側(cè)的纖維環(huán)以及位于上下的終板軟骨[5]。一個健康的椎間盤能夠吸收脊柱的軸向壓縮應(yīng)力，維持脊柱的穩(wěn)定性[6]。在這一結(jié)構(gòu)中，髓核細(xì)胞的退變是引起IVDD的主要原因。作為椎間盤內(nèi)的主要組織，髓核主要由髓核細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）構(gòu)成。ECM作為髓核組織內(nèi)的主要成分，主要由蛋白聚糖及Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ, Col-2）組成，以維持髓核組織內(nèi)的水分，維持正常的椎間盤高度從而吸收身體的軸向壓縮應(yīng)力[7]。研究[8]證實，退變的髓核組織會分泌大量的基質(zhì)金屬酶（matrix metalloproteinases,MMPs），影響ECM的代謝平衡，加速髓核組織內(nèi)的水分丟失，影響椎間盤正常高度，改變椎間盤的正常力學(xué)環(huán)境，最終加速IVDD。但是，IVDD的具體機制還不是很明確。

目前，多項研究表明，IVDD是一個復(fù)雜的過程。影響IVDD的主要因素涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、衰老凋亡、異常機械負(fù)荷等[9]。H2O2作為三羧酸循環(huán)以及多種氧化酶代謝的產(chǎn)物，具有強氧化性，能夠引起細(xì)胞內(nèi)強烈的氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）[10]。過量ROS的堆積將引起髓核細(xì)胞DNA損傷，加速髓核細(xì)胞凋亡、衰老等多種病理過程，導(dǎo)致ECM代謝失衡，最終加劇IVDD[11]。此外，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作為革蘭氏陰性菌的主要成分，當(dāng)其與Toll樣受體4結(jié)合時，通過銜接蛋白-髓樣分化因子88激活絲氨酸/蘇氨酸激酶，產(chǎn)生與白介素-1類似的炎癥反應(yīng)[12]。在退變的髓核組織中，多種炎癥因子包括白介素-1β水平較正常椎間盤組織明顯升高，產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，加速ECM的分解代謝，最終加劇IVDD[13]。

在本研究中，我們擬通過使用H2O2以及LPS干預(yù)大鼠髓核細(xì)胞，探究這兩種常用的體外誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞退變模型對髓核細(xì)胞ECM的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：6 周齡雄性Sprague Dawley大鼠，購自蘇州大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器：體視顯微鏡（Carl Zeiss公司）；逆轉(zhuǎn)錄儀（Bio-Rad公司）；Real-time PCR擴增儀（Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀（Biotec公司）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）；WB曝光儀（Bio-Rad公司）；胎牛血清、青鏈霉素（Gibco公司）；PBS（新賽美公司）；兔抗大鼠Col-2抗體、兔抗大鼠MMP13抗體（Abcam公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔lgG（碧云天公司）；羊抗兔熒光二抗488、647（Abcam公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 髓核細(xì)胞培養(yǎng)基配置：髓核細(xì)胞增殖培養(yǎng)基：DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1%青鏈霉素。

1.2.2 髓核細(xì)胞培養(yǎng)：通過腹膜內(nèi)注射過量戊巴比妥處死Sprague-Dawley大鼠。然后收集大鼠尾部的髓核組織，用0.5%的Ⅱ型膠原酶在37 ℃水浴中消化2 h。離心后，收集沉淀物，重懸并種植在6孔板中，與含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基一起孵育。將6孔板置于恒溫37 ℃且含有5% CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并重新種植在直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中。我們的實驗使用了3代內(nèi)的髓核細(xì)胞。

1.2.3 Western blot：使用補充有苯甲磺酰（Beyotime）的RIPA緩沖液獲得6孔板培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的總蛋白。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（Beyotime）定量蛋白質(zhì)濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）用于分離等量的蛋白質(zhì)（20 μg），然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）上。隨后，將條帶用快速封閉液（Beyotime）封閉，并與適當(dāng)?shù)囊豢狗磻?yīng)：抗-β-actin（1:5 000，AF5001，Beyotime），抗-Col-2（1:5 000，ab34712，Abcam），抗-SOX9（1:5 000，ab185230，Abcam），抗-MMP9（1:1 000，ab283575，Abcam），抗-MMP13（1:5 000，ab39012，Abcam）。然后，加入二抗并孵育1 h。最后用電化學(xué)發(fā)光試劑（Thermo Fisher Scientific）檢測。Image Lab 3.0軟件（Bio-Rad Laboratories）用于量化條帶圖像。

1.2.4 PCR：我們使用TRIzol試劑（Invitrogen）提取總RNA，然后使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測量總RNA濃度。隨后，我們使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒（Takara，Kusatsu，Japan）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，確保逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的濃度達(dá)到1 μg/20 μL，并使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴增。每個反應(yīng)共需20 μL液體，包括10 μL SYBR Premix Ex TaqTM、0.5 μL正向和反向引物、1 μL cDNA和8 μL無酶水。使用CFX96 Touch實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）進(jìn)行擴增。將循環(huán)閾值標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色：髓核細(xì)胞以10 000/mL的密度接種于24孔板中，并用不同的干預(yù)方法進(jìn)行處理。12 h后，用PBS洗滌24孔板，隨后依次用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用Triton透化，用快速封閉液封閉非特異性結(jié)合位點后，將細(xì)胞與一抗孵育，置于4 ℃冰箱過夜。第二天，將細(xì)胞與二抗置于37 ℃恒溫箱中孵育1～2 h，最后用DAPI染色。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0分析，兩兩比較在總體方差齊的條件下，選用LSD及Dunnett-t法進(jìn)行分析。P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細(xì)胞培養(yǎng) 髓核細(xì)胞增殖傳代后，倒置顯微鏡下觀察髓核細(xì)胞貼壁生長，多數(shù)細(xì)胞呈梭形，生長狀態(tài)良好，適用于后續(xù)實驗（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察髓核細(xì)胞形態(tài)

2.2 H2O2、LPS誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變后ECM代謝指標(biāo)比較 隨后，我們進(jìn)一步進(jìn)行了Western blot及PCR實驗，結(jié)果顯示H2O2以及LPS能夠明顯誘導(dǎo)髓核細(xì)胞二型膠原（collagen Ⅱ, Col-2）、Y染色體性別決定區(qū)-盒轉(zhuǎn)錄因子9（SRY-box transcription factor 9, SOX9） mRNA及蛋白表達(dá)降低，同時促進(jìn)其分解代謝指標(biāo)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9, MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinases 13, MMP13）的升高。H2O2較LPS進(jìn)一步促進(jìn)了ECM分解代謝相關(guān)基因表達(dá)，而其對ECM合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響則沒有LPS明顯（圖2）。

圖2 Col-2、SOX9、MMP9及MMP13的mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.3 H2O2、LPS誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變后免疫熒光染色結(jié)果 通過免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)H2O2以及LPS能夠明顯抑制髓核細(xì)胞ECM中Col-2染色強度，同時均增強了MMP13的熒光強度。結(jié)果證實了H2O2和LPS均能夠通過減少髓核細(xì)胞合成代謝、增強其分解代謝來誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變（圖3，圖4）。

圖3 Col-2及SOX9的免疫熒光染色及其定量分析

圖4 MMP9及MMP13的免疫熒光染色及其定量分析

3 討論

IVDD是一種常見病，并且其發(fā)病越來越年輕化，給社會帶來了巨大的經(jīng)濟及醫(yī)療壓力，也給病人帶來了巨大的心理和生理壓力[14]。髓核細(xì)胞退變引起的ECM分解代謝增加、合成代謝抑制是引起IVDD的主要原因之一，然而目前尚缺乏針對性治療[15]。氧化應(yīng)激、炎癥作為導(dǎo)致IVDD的重要原因之一，常用于體外誘導(dǎo)IVDD[16]。因此，在本研究中我們試圖去比較LPS及H2O2對髓核細(xì)胞ECM代謝的影響以尋找合適的體外退變模型。

H2O2被證實能夠參與包括髓核細(xì)胞炎癥、凋亡、衰老、線粒體功能障礙以及抑制髓核細(xì)胞增殖的多種病理生理過程，最終促進(jìn)包括MMP13、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTs5）在內(nèi)的ECM代謝相關(guān)酶類的表達(dá)，以促進(jìn)Col-2及蛋白聚糖的降解，導(dǎo)致IVDD[17]。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)H2O2確實能夠促進(jìn)MMP9、MMP13的上調(diào)以及Col-2、SOX9表達(dá)的降低，是一個合適的體外退變模型。而LPS能夠引起包括炎癥、焦亡、凋亡在內(nèi)的多種病理過程，促進(jìn)MMP13及ADAMTs4的表達(dá)，從而加劇IVDD[18]。而我們的結(jié)果顯示，LPS也能夠在促進(jìn)MMP9、MMP13表達(dá)的同時抑制Col-2、SOX9的表達(dá)。

然而，本實驗還存在一定的不足。我們選擇比較的指標(biāo)較少，沒有比較其他MMPs及ECM成分（aggrecan等）的表達(dá)變化。并且沒有比較其他因素（如細(xì)胞衰老，凋亡，線粒體功能紊亂等）以及其他干預(yù)措施（如叔丁基過氧化物，晚期糖基化產(chǎn)物等）對IVDD的影響。在接下來的實驗中，我們會進(jìn)一步比較不同干預(yù)措施對不同指標(biāo)的作用。

在本研究中，我們通過免疫熒光染色、PCR以及蛋白印跡等多種手段證實H2O2及LPS均能夠誘導(dǎo)髓核細(xì)胞ECM代謝變化，從而建立髓核細(xì)胞體外退變模型。LPS對ECM合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用更為明顯，而H2O2更為明顯地促進(jìn)了ECM分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)。