中藥活性成分對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用

楊 穎，邱 東，趙金榮

（1.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215129；2.中國科學(xué)院化學(xué)研究所，北京 100190）

長期以來，骨缺損導(dǎo)致的愈合延遲和骨骼不連等問題，始終困擾著骨科臨床治療。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，尤其是組織工程學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，基于生物材料和組織工程的治療方法逐漸取代過去的傳統(tǒng)療法，以“生長因子＋支架材料”成為新時期骨骼修復(fù)的理想策略。然而，目前充當(dāng)主要材料的骨形態(tài)發(fā)生蛋白等生長因子，由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜而難以大規(guī)模生產(chǎn)，在市場上價格高昂，并且具有一定程度的致癌性和毒性，已有文獻(xiàn)報道這種生長因子容易導(dǎo)致異位成骨，諸多隱患使得該技術(shù)的推進(jìn)受到阻礙。而尋找到價格低廉、產(chǎn)量穩(wěn)定、使用安全且符合骨組織工程學(xué)要求的活性物質(zhì)，顯得十分重要。

在骨折治療領(lǐng)域已有很多研究表明，中藥活性成分在骨折愈合方面有著良好的效果，有助于促進(jìn)成骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生蛋白和相關(guān)基因的表達(dá)。通過提取中藥成分，如淫羊藿苷、丹參酮等，具有促進(jìn)骨折愈合的作用，這為骨組織工程學(xué)的發(fā)展帶來了希望，使“生長因子＋支架材料”這種高效療法的廣泛推廣成為可能。然而，過往文獻(xiàn)中，涉及到中藥成分的報道都鮮少采用盲法，從而導(dǎo)致許多觀點仍處在探索、推測階段。有鑒于此，為了驗證中藥活性成分對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用，以及其在骨折愈合中的效果，故而將現(xiàn)有的相關(guān)研究及其結(jié)論匯總起來，采用meta分析方法做系統(tǒng)性分析，以期獲得更為科學(xué)、可靠的結(jié)論。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)的納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 通過“gene medical”網(wǎng)站，對Pubmed、NSFC等網(wǎng)站進(jìn)行檢索，通過谷歌學(xué)術(shù)對知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得文獻(xiàn)資料按照下述方法進(jìn)行篩選。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有符合中西醫(yī)關(guān)于骨折診斷標(biāo)準(zhǔn)的對象，其中中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)骨傷科病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)ZY/T001.9—94》，西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《外科學(xué)》（第五版）；(2)采用對照試驗方式展開的研究，且對照方式相似，具有完整的統(tǒng)計指標(biāo)和相應(yīng)的數(shù)據(jù)資料；(3)中藥活性成分的成骨作用經(jīng)由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實現(xiàn)，文章中具有明確的相關(guān)描述的研究；(4)實驗組采用符合經(jīng)典中藥方劑的各種中藥成分萃取，并注明相應(yīng)的萃取方法，對照組則采取常規(guī)處置方法，未采取骨肽等措施，并進(jìn)行陽性對照；(5)結(jié)局指標(biāo)具備可對比性。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)個例研究、理論研究、方法介紹、文獻(xiàn)綜述等各類非隨機對照試驗的文獻(xiàn)；(2)僅能瀏覽摘要，無法讀取全文的文獻(xiàn)；(3)同一作者在國內(nèi)外不同刊物上發(fā)表的同名或內(nèi)容相似的文獻(xiàn)，（取其最后發(fā)表時間的文獻(xiàn)，排除其他）；(4)以圖示法展現(xiàn)對比結(jié)果，并未報道相關(guān)數(shù)據(jù)的研究；(5)統(tǒng)計資料不完整，未報道關(guān)鍵統(tǒng)計指標(biāo)，或存在明顯錯誤的文獻(xiàn)。

文獻(xiàn)的納入、排除，由2名同學(xué)在相互獨立的情況下，幫助完成篩選。通過對文獻(xiàn)資料的摘要和結(jié)果部分進(jìn)行閱讀，將符合排除標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)篩除。若存在彼此意見不一致的情況，則由筆者參與判斷。

1.1.3 質(zhì)量評價：采用Cochrane 5.3方法為選取文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價，其評價標(biāo)準(zhǔn)如下所示：(1)對照試驗是否采用了科學(xué)的隨機方法；(2)分配隱藏的科學(xué)性、客觀性能否保障；(3)對照過程中的雙盲措施是否存在疏漏；(4)是否存在失訪、退出等現(xiàn)象，是否對這些現(xiàn)象加以說明；(5)數(shù)據(jù)資料之間是否可以進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析與比較。

1.2 文獻(xiàn)篩選和資料提取 從國內(nèi)外醫(yī)學(xué)期刊數(shù)據(jù)庫中，篩選其建刊以來到2020年6月30日為止所收錄的有關(guān)中藥成分聚合物對促進(jìn)骨折愈合方面的研究，通過手工檢索的方式，將論文所涉及的藥廠信息、制備方法等匯總。

1.2.1 文獻(xiàn)初篩：根據(jù)系統(tǒng)檢索所獲得的信息，如摘要、目錄等，將其中明顯符合排除標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)予以去除。

1.2.2 文獻(xiàn)復(fù)篩：(1)將剩余文獻(xiàn)的作者姓名、發(fā)表年份等基礎(chǔ)資料收錄；(2)將剩余文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)基線特征，如年齡、性別等收錄；(3)將剩余文獻(xiàn)的干預(yù)措施細(xì)節(jié)，如中成藥添加方法，以及其他輔助治療措施等整理收錄；(4)從偏倚風(fēng)險的評價要素入手，對文獻(xiàn)許多隨機方法、盲法等質(zhì)量判定指標(biāo)進(jìn)行分類整理；(5)對結(jié)局指標(biāo)的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，包括康復(fù)效果、愈合時間、疼痛情況等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本文采用元分析（meta）方法，對學(xué)術(shù)界已發(fā)表文獻(xiàn)中，關(guān)于中藥活性成分對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用進(jìn)行系統(tǒng)性分析。所有數(shù)據(jù)均采用Excel（office 365版本）進(jìn)行收集，整理后錄入Stata 15.1軟件中，運用Stata軟件的外置meta分析模塊實現(xiàn)全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析任務(wù)。其中，計數(shù)資料以O(shè)R值、CR值來表示，計量資料采用加權(quán)均數(shù)差表示。在研究過程中，若不同文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)之間無明顯的異質(zhì)性，則采用默認(rèn)的固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析，若不同文獻(xiàn)之間的異質(zhì)性顯著，則采取隨機效應(yīng)模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索流程與結(jié)果

2.1.1 文獻(xiàn)檢索流程：從國內(nèi)外各類期刊數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)資料，初篩獲得文獻(xiàn)652 篇，包含英文文獻(xiàn)112 篇與中文文獻(xiàn)540 篇。經(jīng)過納入排除，最終進(jìn)入meta分析中的文獻(xiàn)僅有23 篇，且均為中文文獻(xiàn)，篩選路徑的整體流程如表1所示。

表1 文獻(xiàn)檢索流程

2.1.2 文獻(xiàn)檢索結(jié)果：將按照納入、排除標(biāo)準(zhǔn)整理好的文獻(xiàn)資料全部錄入并整理如表2所示。從中可以看出，相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表年份從2003年到2019年，偏倚風(fēng)險評價結(jié)果中3 分較多，文獻(xiàn)質(zhì)量較好。

表2 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

2.2 meta分析檢驗

2.2.1 敏感性分析：為了驗證meta分析的合理性與有效性，所以需要對meta數(shù)據(jù)進(jìn)行敏感性分析。本文采取模型轉(zhuǎn)換方法，將原本采用固定效應(yīng)模型的數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)化為隨機模型，而后進(jìn)行對照。結(jié)果顯示，模型轉(zhuǎn)換后的統(tǒng)計結(jié)果并未發(fā)生變化，說明本次meta分析的各個指標(biāo)效應(yīng)量均比較穩(wěn)定，結(jié)果具有可信性。

2.2.2 發(fā)表偏倚檢驗：發(fā)表偏倚是影響元分析結(jié)論的一項重要干擾因素，為了避免發(fā)表偏倚對最終結(jié)果的影響，所采用Stata 15.1的meta分析模塊進(jìn)行漏斗圖檢驗，最終獲得的漏斗圖如圖1所示。

圖1 meta分析漏斗圖

在圖1中，效應(yīng)量為橫向坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)誤為縱向坐標(biāo)，小樣本因其離散度較高，因此沉積在漏斗底部，大樣本浮于頂部，從漏斗圖的直觀結(jié)果來看，所選文獻(xiàn)之間并不存在發(fā)表偏倚現(xiàn)象。

2.3 中藥活性成分對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的作用

2.3.1 淫羊藿的成骨作用：關(guān)于淫羊藿的成骨作用，經(jīng)檢索共獲得了8 篇文獻(xiàn)，圖2所示為meta分析所得的數(shù)據(jù)。異質(zhì)性卡方檢驗P＝0.146＞0.05，I2為35.3%＜50%，說明各研究之間不存在異質(zhì)性。從森林圖中可以看出，結(jié)果落在了無效線的右側(cè)，說明實驗組的成骨作用整體好于對照組，證實了淫羊藿在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方面的有效性。

圖2 淫羊藿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用meta分析及森林圖

2.3.2 鹿茸的成骨作用：關(guān)于鹿茸的成骨作用，經(jīng)檢索共獲得了6 篇文獻(xiàn)，圖3所示為meta分析所得的數(shù)據(jù)。異質(zhì)性卡方檢驗P＝0.000＜0.05，I2為28%＜50%，說明各研究之間不存在異質(zhì)性。由meta分析所獲得的森林圖可以看出，結(jié)果落在了無效線的左右兩側(cè)，很難說明實驗組的成骨作用整體好于對照組，也在一定程度上說明了鹿茸在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方面的有效性不足。

圖3 鹿茸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用meta分析及森林圖

2.3.3 熟地的成骨作用：關(guān)于熟地的成骨作用，經(jīng)檢索共獲得了4 篇文獻(xiàn)，圖4所示為meta分析所得的數(shù)據(jù)。異質(zhì)性卡方檢驗P＝0.076＞0.05，I2為12%＜50%，說明各研究之間不存在異質(zhì)性。由meta分析所獲得的森林圖中可以看出，多數(shù)結(jié)果落在了無效線的右側(cè)，說明實驗組的成骨作用整體好于對照組，也在一定程度上說明了熟地在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方面的有效性較高。

圖4 熟地對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用meta分析及森林圖

2.3.4 狗脊的成骨作用：關(guān)于狗脊的成骨作用，經(jīng)檢索共獲得了2 篇文獻(xiàn)，圖5所示為meta分析所得的數(shù)據(jù)。異質(zhì)性卡方檢驗P＝0.122＞0.05，I2為28.3%＜50%，說明各研究之間不存在異質(zhì)性。由meta分析所獲得的森林圖中可以看出，多數(shù)結(jié)果落在了無效線的右側(cè)，說明實驗組的成骨作用整體好于對照組，也在一定程度上說明了狗脊在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方面的有效性較高。

圖5 狗脊對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用meta分析及森林圖

2.3.5 當(dāng)歸的成骨作用：關(guān)于當(dāng)歸的成骨作用，經(jīng)檢索共獲得了2 篇文獻(xiàn)，圖6所示為meta分析所得的數(shù)據(jù)。異質(zhì)性卡方檢驗P＝0.108＞0.05，I2為25.1%＜50%，說明各研究之間不存在異質(zhì)性。由meta分析所獲得的森林圖中可以看出，多數(shù)結(jié)果落在了無效線的右側(cè)，說明實驗組的成骨作用整體好于對照組，也在一定程度上說明了當(dāng)歸在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方面的有效性較高。

圖6 當(dāng)歸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用meta分析及森林圖

3 討論

3.1 中藥活性成分對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨的機理 臨床醫(yī)學(xué)面對的骨折后康復(fù)、骨質(zhì)疏松等疾病類型眾多，治療難度較高。近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對中醫(yī)藥的認(rèn)識逐步提升，尤其是從單味中藥中提取有效成分，輔助臨床治療取得了良好的效果。關(guān)于中藥活性成分促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收等方面的研究已經(jīng)成為熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種起源于中胚層，在骨組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用的子細(xì)胞。由于這種細(xì)胞具有多向分化和自我更新的功能，所以對于骨脂分化失常、骨骼礦化、骨吸收異常等疾病，有著很好的輔助效果。根據(jù)中醫(yī)理論，退行性骨質(zhì)疾病屬于“腎虛腰萎”，是由于腎中精氣無法繼續(xù)溫煦和滋養(yǎng)骨骼，進(jìn)而使得骨骼脆弱無力，影響骨質(zhì)和骨愈合。從這個方向出發(fā)，許多研究者試圖從中藥中尋找能補腎健骨的成分。何偉等[24]的研究結(jié)果表明，淫羊藿苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原的分泌，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化。劉金保等[25]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸可以對大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，使之分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。經(jīng)過系統(tǒng)的分析與總結(jié)，研究者們發(fā)現(xiàn)一些中藥活性成分可以促進(jìn)Ⅰ型膠原等成骨相關(guān)因子的表達(dá)；增加成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度；通過BMP/Smad信號通路促進(jìn)骨形成；通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)骨分化。然而，現(xiàn)有研究的數(shù)量整體偏少，也缺乏對中藥活性成分效用的系統(tǒng)性研究。

3.2 中藥成分促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的研究情況 本文通過meta分析，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有研究表明，多數(shù)中藥活性成分在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨方面具有良好的輔助效用，有助于減少愈合時間，提升康復(fù)效果。但在meta分析中，同樣也發(fā)現(xiàn)這些文獻(xiàn)的隨機化操作不佳，許多文獻(xiàn)提到了應(yīng)用的隨機方法，但沒有具體描述隨機的隱藏方法。涉及該問題的研究中很少使用對照研究，所以從國內(nèi)外各類期刊數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)資料中初篩獲得文獻(xiàn)652 篇，但經(jīng)過納入排除最終進(jìn)入meta分析中的文獻(xiàn)僅有23 篇，其中大部分文獻(xiàn)都是因為不滿足雙盲對照條件而被篩除的。這是當(dāng)前中醫(yī)藥臨床研究方法學(xué)不足，嚴(yán)重影響了各研究結(jié)果的真實性，降低了結(jié)果的可信度。期待未來中醫(yī)藥研究領(lǐng)域能夠進(jìn)一步科學(xué)化、規(guī)范化。

通過系統(tǒng)性分析，獲得與研究主題相關(guān)的23 篇中文文獻(xiàn)。經(jīng)過meta檢驗，獲得了如下結(jié)論：(1)添加了部分中藥活性成分后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨效果得到了顯著的提升。其中：淫羊藿成分（MD＝10.837；95%CI：9.353～12.321，P＜0.05）；熟地成分（MD＝11.747；95%CI：9.73～13.764，P＜0.05）；狗脊成分（MD＝10.809；95%CI：8.264～13.353，P＜0.05）；當(dāng)歸成分（MD＝12.576；95%CI：10.099～15.053，P＜0.05）。(2)現(xiàn)有研究中，仍有部分中藥活性成分的效用不顯著，可能與研究數(shù)量較少有關(guān)，例如：鹿茸成分（MD＝0.456；95%CI：－0.013～0.926，P＞0.05）；(3)從現(xiàn)有研究報道的數(shù)據(jù)來看，多數(shù)中藥活性成分在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨方面具有良好的輔助效用，有助于減少愈合時間，提升康復(fù)效果。