微衛(wèi)星不穩(wěn)定、Her-2在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義

權(quán)秋穎，郭凌川，黃 山，何曉順，陳 志，郭 霞，曹 磊

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215006）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，死亡率占全世界癌癥死亡率的第四位，其致病危險因素如高能量飲食，肥胖，吸煙，缺乏鍛煉等增加了CRC的發(fā)病風(fēng)險[1]；而遺傳易感因素如APC基因的缺失，RAS基因家族如KRAS和NRAS突變或P53基因的失活等在CRC的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用[2-3]。其中，錯配修復(fù)蛋白的失活（dMMP）導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability, MSI）和人類表皮生長因子受體2（Her-2）的過表達也在腫瘤的發(fā)生中扮演特定角色。

微衛(wèi)星（microsatellite），是指存在于基因組中小片段核苷酸重復(fù)序列，包括編碼和非編碼區(qū)，而MSI是由于錯配修復(fù)蛋白或基因的失活導(dǎo)致無法糾正DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯誤，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加，進而發(fā)展為腫瘤。研究[2]表明，在轉(zhuǎn)移性CRC患者中，15%的病例可檢測到MSI，其中3%與林奇綜合征（Lynch syndrome）的發(fā)生相關(guān)，12%的散發(fā)病例與MLH1高甲基化相關(guān)，50%的患者同時具有BRAFV600E活化突變。而相對于微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable, MSS）的CRC，存在MSI的CRC多具有較獨特的發(fā)生部位和組織學(xué)表型及治療方法。

Her-2作為酪氨酸激酶家族的一員，位于17號染色體，編碼185 kD的跨膜蛋白，表達在正常細胞，其激活可以啟動如MAPK和PI3K/AKT等一系列信號通路，從而對細胞的增殖及分化產(chǎn)生重要作用，研究[4]表明Her-2可在多種惡性腫瘤包括CRC中過表達。在5%的轉(zhuǎn)移性CRC中可檢測到Her-2擴增，其在乳腺癌及胃癌中是重要的生物標志物，但在CRC中的作用尚不完全清楚。有研究者[5-6]認為，Her-2的過表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，且在直腸的發(fā)生率最高。但Her-2與微衛(wèi)星狀態(tài)之間的關(guān)系在CRC中尚未闡明，因此，探討MSI和Her-2在CRC的表達及與臨床病理特征的關(guān)系具有重要意義。

本研究通過免疫組化方法探討CRC中錯配修復(fù)蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Her-2的表達，旨在為CRC病人的精準治療提供一定的理論依據(jù)，對臨床選擇合適的病人亞群采用合適的治療方法提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年1月1日—12月31日蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的CRC標本共493 例，所有患者術(shù)前均未行放化療或其他治療，術(shù)后經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師診斷均為腺癌。其中男性共284例，女性共209 例；年齡范圍21～91 歲，中位年齡66 歲；左半結(jié)腸156 例，右半結(jié)腸184 例，直腸153例；423 例為中＋高分化，70 例為低分化；病理分期標準參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第八版TNM分期標準。

1.2 免疫組化 所有標本固定后均經(jīng)脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚切片，采用全自動免疫組化染色儀，抗體MLH1（Clone ES05）、PMS2（Clone EP51）、MSH2（Clone FE11）和MSH6（Clone EP49）均購自Dako公司，即用型；Her-2（Clone 4B5），購自VENTANA公司。

1.3 結(jié)果判讀 經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)師雙盲讀片，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6陽性染色定位于腫瘤細胞細胞核，染色呈棕黃或棕褐色（圖1，見封二），胞核不著色為表達缺失（圖2，見封二）；存在2個或2個以上蛋白表達缺失定義為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-High, MSI-H），存在1個蛋白缺失或無缺失者定義為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（microsatellite instability-Low, MSI-L）或MSS；Her-2表達在腫瘤細胞膜上，染色呈淺黃或棕黃色，其評判標準如下：無反應(yīng)或＜10%腫瘤細胞膜染色判為Her-2（-），≥10%腫瘤細胞微弱可見膜染色判為Her-2（1＋），≥10%腫瘤細胞有弱到中等的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色判為Her-2（2＋），≥10%腫瘤細胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強染色判為Her-2（3＋）（圖3）。

A：Her-2 (-)；B：Her-2 (1＋)；C：Her-2 (2＋)；D：Her-2 (3＋)。圖3 Her-2在CRC中的免疫組化表達（10×10）A: Her-2 (-); B: Her-2 (1＋); C: Her-2 (2＋); D: Her-2 (3＋).Fig.3 The Immunohistochemical expression of Her-2 in CRC (10×10)

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05認為兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSI和Her-2在CRC中的表達與臨床病理特征關(guān)系 與正常腸黏膜相比，493 例CRC手術(shù)標本中，MSI-H病例數(shù)共43 例，發(fā)生率為8.7%，MSI-L與MSS兩組在性別、年齡、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），故將MSI-L與MSS歸為一組進行研究，MSI-L/MSS共450 例，發(fā)生率為91.3%；與MSI-L/MSS相比，MSI-H的CRC患者腫瘤好發(fā)于右半結(jié)腸（P＜0.001），浸潤較深（P＝0.024），低分化（P＜0.001），瘤體較大（P＝0.001），組織學(xué)類型多為黏液腺癌（P＜0.001），與其他指標如性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期方面無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）（表1）；Her-2在CRC中高表達狀態(tài)多見于低分化者（P＜0.05），亦與腫瘤發(fā)生部位相關(guān)，直腸多見（P＜0.05）（表2）。

表1 MSI-H與MSS/MSI-L的表達與臨床病理特征的關(guān)系（例）Tab.1 Relationship between the expression of MSI-H and MSS/MSI-L and clinicopathological features

表2 Her-2的表達與臨床病理特征的關(guān)系（例）Tab.2 Relationship between the expression of Her-2 and clinicopathological features

2.2 MSI與Her-2表達的相關(guān)性 MSI與Her-2的表達呈正相關(guān)（P＝0.021，r＝0.140）（表3）。

表3 MSI與Her-2表達的相關(guān)性Tab.3 The correlation between MSI and Her-2 expression

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展與一系列基因突變累積相關(guān)，具有多遺傳模型，每年約占新診斷癌癥病例的10%，MSI被認為是導(dǎo)致CRC發(fā)生的主要原因之一，它代表了遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），即林奇綜合征的分子表型，通常與胚系突變有關(guān)，同時也可在散發(fā)性病例中檢測到，多與MLH1表觀遺傳失活相關(guān)[7]。檢測微衛(wèi)星狀態(tài)至關(guān)重要，它可作為篩查林奇綜合征的工具，同時也可為評估患者的預(yù)后，對化療藥物及免疫治療的應(yīng)用提供參考和幫助。目前主要有兩種方法檢測MSI，包括PCR和免疫組織化學(xué)，二者對dMMR和MSI的檢測均敏感且特異，一致率大于95%[8]。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測微衛(wèi)星狀態(tài)，結(jié)果表明，MSI-H患者共43 例，既往研究[7]表明，MSI-H的患者腫瘤發(fā)生具有獨特的臨床病理特點，如右半結(jié)腸多見，浸潤較深，組織學(xué)類型多為黏液或印戒樣表型，分化差，而MSI-L和MSS兩組之間無明顯差異，這與本研究結(jié)果一致，可能與近端和遠端結(jié)腸的不同胚胎學(xué)起源有關(guān)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H/dMMR的患者，由于腫瘤突變多，具有廣泛的免疫源性，腫瘤區(qū)域淋巴細胞浸潤明顯，免疫療法效果顯著，但對氟尿嘧啶類單藥治療不敏感。目前，PD-1免疫卡控點抑制劑如nivolumab或pembrolizumab已批準用于dMMR或MSI-H的患者[9-10]，同時，聯(lián)合免疫治療（nivolumab和ipilimumab）也得到了美國食品和藥物管理局（FDA）的批準[11]，其效果顯著，腫瘤消退明顯，生存時間較MSI-L/MSS患者延長，預(yù)后較好[12]。

Her-2作為腫瘤重要的驅(qū)動因子，在乳腺癌和胃癌中已作為公認的治療靶點，然而其在CRC的預(yù)測作用尚未明確。有報道[6]認為，發(fā)生于遠端CRC尤其是直腸的患者更容易檢測到Her-2或表皮生長因子受體（EGFR）擴增，這與本研究結(jié)果一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)Her-2表達與腫瘤的分化程度相關(guān)，低分化腺癌中Her-2過表達多見，表明其在評估腫瘤的惡性程度方面存在一定價值。多組報道[13-14]認為，相對于Her-2檢測陰性的患者，伴有Her-2擴增的病人對抗EGFR治療如西妥昔單抗存在抵抗和耐藥，中位生存期和總生存期明顯縮短，是預(yù)測患者預(yù)后的負性因子。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，在單獨使用西妥昔單抗或帕尼妥單抗或聯(lián)合化療治療KRAS野生型轉(zhuǎn)移性CRC的患者時，其生存均受Her-2基因拷貝數(shù)的影響，當然，也有研究認為，其擴增與否與患者的預(yù)后之間不存在相關(guān)性。然而，在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用曲妥珠單抗（trastuzumab）和來那替尼（neratinib）或拉帕替尼（lapatinib）即雙重Her-2靶向藥治療可產(chǎn)生持久的腫瘤消退[15]。因此，檢測CRC患者中Her-2蛋白的表達對選擇治療方法及評估預(yù)后具有重要意義。

有研究[16]表明，MSI和PIK3CA突變與ERBB2/ERBB3突變相關(guān)。最近一項報道[17]也發(fā)現(xiàn)，36.8%的MSI-H患者攜帶Her-2突變，且攜帶Her-2突變的MSI-H患者采用免疫治療PD-1抑制劑的中位PFS顯著低于無Her-2突變的患者。本研究結(jié)果顯示，MSI與Her-2的表達存在相關(guān)性，有研究者認為這可能是由于錯配修復(fù)導(dǎo)致突變發(fā)生率較高所致，具體機制尚需更深入的研究。此外，對同時存在Her-2突變與MSI的體外結(jié)直腸癌細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，其對不可逆EGFR抑制劑來那替尼效果更好[18]。綜上，聯(lián)合檢測MSI和Her-2在CRC中的表達可更好地評估腫瘤風(fēng)險和預(yù)后，為臨床分子靶向治療的選擇提供參考方向。