探討血清學(xué)檢測(cè)對(duì)羊布魯氏菌病診斷的有效性

余海軍，羅代兵，楊祎祎，田新平*

（1.碧江區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧水產(chǎn)中心，貴州銅仁554300；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水生生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

羊布魯氏菌病（簡(jiǎn)稱羊布?。┦且环N以布魯氏菌為致病菌引起的人羊共患的傳染性疾病[1]，其病菌對(duì)外部環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)力、耐低溫、耐干燥，能夠長(zhǎng)期生存于動(dòng)物、水及土壤中。布魯氏菌寄生在動(dòng)物的細(xì)胞中，藥物防控?zé)o效，發(fā)生流行后，不進(jìn)行治療，立即撲殺，無(wú)害化處理[2]。羊布病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類動(dòng)物疫病，在國(guó)內(nèi)被列為二類動(dòng)物疫病[3]，不僅對(duì)養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成極大影響，也對(duì)人畜造成不可低估的危害。目前，對(duì)羊布病常使用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法為血清學(xué)檢測(cè)，包括虎紅平板凝集（RBT）、試管凝集（SAT）、膠體金免疫層析和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。本研究基于虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩定性、試管凝集和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)復(fù)檢定量，對(duì)御諾乳業(yè)奶山羊場(chǎng)438份樣本進(jìn)行血清學(xué)分析研究，探究其對(duì)于羊布病檢測(cè)的有效性，為及時(shí)了解和掌握羊布病的疫情動(dòng)態(tài)、做好羊布病有效防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究在貴州省銅仁市碧江區(qū)御諾乳業(yè)奶山羊場(chǎng)采集羊血液樣本，將采集的438份樣本分別標(biāo)號(hào)（A1-A81、B1-B112、C1-C56、C61-C98、D1-D151）放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)，待其分離血清，用于后續(xù)的血清學(xué)研究。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)

取30μL虎紅平板凝集抗原于檢查卡上，分別與等體積的受檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清混勻，室溫靜置5 min，觀察結(jié)果。

1.2.2 試管凝集試驗(yàn)

本研究采用微量法對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選出的陽(yáng)性樣本，按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）操作測(cè)定[4]。第一步將受檢血清和抗原對(duì)照在U型板中稀釋，每份血清有4孔；第二步將稀釋的抗原100μL加入第一步稀釋好的血清中，稀釋度為1∶25、1∶50、1∶75、1∶100；第三步將試驗(yàn)組和對(duì)照組充分混勻后，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，室溫放置2 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

本研究選用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選出的陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，最后使用酶標(biāo)儀對(duì)受檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行OD值的測(cè)定。

1.3 結(jié)果判定

虎紅平板凝集試驗(yàn)根據(jù)檢查卡中出現(xiàn)不同程度的顆粒狀或玫瑰花瓣?duì)钅?，判定為?biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，而標(biāo)準(zhǔn)陰性血清無(wú)變化。

試管凝集試驗(yàn)根據(jù)受檢血清出現(xiàn)1孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，2~4孔孔底均呈現(xiàn)白色點(diǎn)狀凝集，判定為可疑；受檢血清出現(xiàn)1、2孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，3、4孔孔底呈現(xiàn)白色點(diǎn)狀凝集，判定為陽(yáng)性；受檢血清出現(xiàn)1~4孔孔底均呈現(xiàn)白色點(diǎn)狀，判定為陰性。

競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的OD值，按照以下公式計(jì)算數(shù)據(jù)以判定結(jié)果。

式中：ODNC為陰性血清的平均OD值；ODPC為陽(yáng)性血清的平均OD值；ODS為受檢血清的OD值；當(dāng)ODNC>0.5，且陽(yáng)性血清抑制率>60%時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果有效，否則重新試驗(yàn)；當(dāng)樣本抑制率≥50%判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖1）

在布病血清學(xué)檢測(cè)研究中，虎紅平板凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，由于其敏感性高、特異性低，因而被廣泛用于布病的初篩[5-7]。由圖1可知，本試驗(yàn)438份羊血清，虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩147份陽(yáng)性，291份陰性。

2.2 試管凝集試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖2）

試管凝集試驗(yàn)對(duì)初篩的147份陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)核。由圖2可知，A14、B37、C72、D65、D75、D76、D80、D90、D93、D116為陰性，D131為可疑，其余136份均為陽(yáng)性。

2.3 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖3）

對(duì)147份初篩陽(yáng)性血清進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)。由圖3可知，ODNC為0.825 5，陽(yáng)性血清抑制率為89.30%（0.737/0.825 5），判定試驗(yàn)結(jié)果有效，樣本抑制率約為0.413（即樣本OD值≤0.413為陽(yáng)性，反之為陰性）；通過(guò)復(fù)核篩選出136份陽(yáng)性，11份陰性。

3 討論

羊布病嚴(yán)重影響羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此針對(duì)布病的診斷和綜合防控，有利于保障養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[8]。目前，布病的診斷檢測(cè)存在著2種方法，即血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)。病原學(xué)是通過(guò)從疑似患病羊組織、乳汁、分泌物中分離出菌落，涂片染色鏡檢，根據(jù)菌落顏色診斷[9-10]；但由于此方法周期長(zhǎng)、操作技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求高、試驗(yàn)人員存在感染風(fēng)險(xiǎn)，不能廣泛推廣應(yīng)用[11-12]。血清學(xué)檢測(cè)是通過(guò)從疑似患病羊血液中分離血清，與抗原試劑混合反應(yīng)，根據(jù)理化反應(yīng)現(xiàn)象和試驗(yàn)儀器數(shù)據(jù)讀取診斷。對(duì)比病原學(xué)檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)周期短、試驗(yàn)儀器要求不高、降低試驗(yàn)人員的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，在國(guó)內(nèi)外均采用血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)布病[13]。

本研究采用血清學(xué)檢測(cè)對(duì)羊布病進(jìn)行診斷，通過(guò)虎紅平板凝集對(duì)438份樣本初篩，試管凝集和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)對(duì)初篩的陽(yáng)性樣本進(jìn)行復(fù)核。結(jié)果表明，虎紅平板初篩出147份陽(yáng)性樣本，試管凝集復(fù)核陽(yáng)性樣本有136份、可疑1份；競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)復(fù)核有136份，診斷率達(dá)92.5%，在一定程度上證明血清學(xué)檢測(cè)對(duì)于羊布病診斷具有有效性。同時(shí)，在血清學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，D131樣本ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果為0.470，大于樣本抑制率，故可以診斷為陰性樣本；而試管凝集結(jié)果顯示其屬于可疑樣本，無(wú)法診斷其陰、陽(yáng)性，對(duì)照虎紅平板結(jié)果也無(wú)法診斷，結(jié)果見(jiàn)圖4?；谝陨辖Y(jié)果，可以推斷出在布病陽(yáng)性樣本復(fù)核中，競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)靈敏度高于試管凝集檢測(cè)，與齊景文等[14]提出的觀點(diǎn)一致，即ELISA抗體檢測(cè)用于羊布病復(fù)核較為理想。

由于缺乏基礎(chǔ)研究，對(duì)于羊布病缺乏準(zhǔn)確的診斷手段，同時(shí)也嚴(yán)重阻礙與之相關(guān)的凈化研究和發(fā)展。羊布病研究工作者任重道遠(yuǎn)，還有大量的基礎(chǔ)研究任務(wù)需要完成。因此，需要更多的研究人員參與研究，為動(dòng)物科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等學(xué)科提供有效且可信的科研資料，為布病深入研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)對(duì)貴州碧江地區(qū)所采集的438份羊血清進(jìn)行分析，運(yùn)用虎紅平板試驗(yàn)初篩出147份陽(yáng)性，試管凝集和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA抗體檢測(cè)對(duì)初篩的147份陽(yáng)性進(jìn)行復(fù)核得136份陽(yáng)性，表明92.5%的樣本能診斷為陽(yáng)性，證明血清學(xué)檢測(cè)能有效診斷羊布病。