泥鰍白頭病病原菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及拮抗菌的篩選

劉有華，許 賽，王倩楠，皮喬木，徐思琪，安賢惠，李聯(lián)泰

(江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)屬鯉形目鰍科泥鰍屬，其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，被譽(yù)為“水中人參”，是國內(nèi)外消費(fèi)者最喜愛的美味佳肴之一[1]。因其生長快、產(chǎn)量高、收益好等特點(diǎn)，近年來泥鰍養(yǎng)殖得到迅猛發(fā)展[2]。其中，江蘇省連云港市是全國泥鰍養(yǎng)殖和出口的重要地區(qū)，每年出口泥鰍約1×104噸，產(chǎn)值逾4×107美元[3]。隨著泥鰍高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，病害問題也日漸突出，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。引起泥鰍病害的原因主要包括細(xì)菌性疾病、寄生蟲病和環(huán)境因素等，其中溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)[6]、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[7]和凡隆氣單胞菌(A.veronii)[8-9]等細(xì)菌性疾病占有相當(dāng)大的比例。溫和氣單胞菌主要引起泥鰍皮膚點(diǎn)狀出血、皮膚和肌肉嚴(yán)重潰爛[4]，腹部和肛門紅腫等[10]；創(chuàng)傷弧菌感染使泥鰍體表變色、充血，且感染部位逐漸潰爛[7]；凡隆氣單胞菌同樣會(huì)引起泥鰍體表充血發(fā)紅，游泳活力減退等癥狀[8]。

2020年7月，江蘇省連云港市贛榆區(qū)墩尚鎮(zhèn)許多池塘養(yǎng)殖的泥鰍，先后發(fā)生“白頭病”，癥狀表現(xiàn)為吻部至眼前的一段皮膚呈乳白色，鰓部腐爛，部分?jǐn)囗?，每日死亡率達(dá)5%，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟(jì)損失。幾種常見水產(chǎn)藥物對此病無作用，且目前有關(guān)泥鰍白頭病病害問題還未見報(bào)道。為摸清該病害的致病原因，本研究通過病原菌分離、人工感染實(shí)驗(yàn)、生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析等方法分離鑒定泥鰍白頭病病原菌并分析其致病性，然后測定病原菌藥物敏感性，最后進(jìn)行拮抗菌的篩選，為預(yù)防和治療該病提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病魚來源

發(fā)病泥鰍于2020年7月25日采自江蘇省連云港市贛榆區(qū)墩尚鎮(zhèn)武山橋村的一家泥鰍養(yǎng)殖場。健康泥鰍由江蘇省連云港彬翔水產(chǎn)有限公司提供，泥鰍平均體長為(11±0.5) cm。

1.1.2 菌株

CMA-1[9]：甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)、4-1-3[11]：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、E14[12]：短小芽孢桿菌(B.pumilus)、X8[3]：解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)均為江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.1.3 主要試劑

革蘭氏染色液購自安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司；細(xì)菌微量鑒定管購自杭州百思生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州濱和生物試劑有限公司；引物合成及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L(液體培養(yǎng)基中不加)，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、篩選

在無菌條件下，從患病泥鰍病灶部位(頭部、體表、肝臟)分別取樣，用無菌剪刀剪碎并置于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2 h，然后稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑選單個(gè)優(yōu)勢菌落再次劃線培養(yǎng)，兩次純化后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆肹13]。將分離得到的各菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，然后分別回歸感染健康泥鰍，觀察發(fā)病情況，篩選可染病的病原菌株。為確認(rèn)病原菌株，從實(shí)驗(yàn)中被感染的泥鰍病灶處，采用同樣方法再次分離病原菌并回歸感染健康泥鰍，觀察感染癥狀是否一致[3]。

1.2.2 人工感染

取分離得到的病原菌接種于LB液體培養(yǎng)基，180 r/min，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水依次稀釋至濃度為1.6×107CFU/mL(5倍稀釋)、8.0×106CFU/mL(10倍稀釋)和4.0×106CFU/mL(20倍稀釋)3個(gè)梯度的菌液，采用腹腔注射、創(chuàng)傷和浸泡三種方法進(jìn)行人工感染[8]，每種感染包括3個(gè)梯度，每個(gè)梯度重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)感染10尾泥鰍。其中，腹腔注射是每尾注射0.1 mL菌液，以每尾注射0.1 mL無菌生理鹽水為對照；創(chuàng)傷是將泥鰍表皮劃破，置菌液中浸泡感染，以不添加菌液浸泡為對照；浸泡是選擇體表無損傷的健康泥鰍，置菌液中浸泡感染，以養(yǎng)殖水體中不添加菌液為對照。除以上條件外，其它條件基本相同：選擇的健康泥鰍大小相似，體長(11±0.5) cm，養(yǎng)殖水溫(26.5±1.0) ℃，pH(7.8±0.2)，NH3-N(1.5±0.1) μg/L，NO2-N(50±6) μg/L。

1.2.3 病原菌的鑒定

菌株的形態(tài)觀察和生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]進(jìn)行。

提取細(xì)菌基因組DNA，利用通用引物27F和1492R對菌株W1進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。上游引物為27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物為1492R：5′-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系為(25 μL)：2×San Taq PCR Mix 12.5 μL，27F 1.0 μL(25 μmol/L)，1492R 1.0 μL(50 μmol/L)，DNA模板1.0 μL(10 mmol/L)，dd H2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次；72 ℃終延伸7 min，在4 ℃下保存。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序得到的16S rRNA基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對，查找相似性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列，應(yīng)用MEGA7.0軟件進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法[15]，28 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑(mm)。

1.2.5 病原菌的特性研究

用HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為4、5、6、7、8、9。將病原菌W1以0.5%的接種量接種于裝液量為30%(即250 mL三角瓶中裝75 mL培養(yǎng)基，下同)的各培養(yǎng)基中。28 ℃下，180 r/min培養(yǎng)24 h。采用光電比濁法[16]，取3 mL菌液在波長為600 nm處測定吸光度值OD600 nm，用來表示細(xì)菌生物量，重復(fù)3次。

用NaCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鹽度為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%。將病原菌以0.5%的接種量接種于裝液量為30%的各培養(yǎng)基中。28 ℃下，180 r/min培養(yǎng)24 h。整個(gè)過程，重復(fù)操作3次。

1.2.6 拮抗菌的篩選

采用濾紙片抑菌圈法[17]研究本實(shí)驗(yàn)室保存的4株菌(CMA-1、4-1-3、E14和X8)對病原菌W1的拮抗效果。將病原菌W1在28 ℃，180 r/min下培養(yǎng)24 h，取20 μL培養(yǎng)液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中，將直徑為6 mm的無菌濾紙片置于培養(yǎng)皿中，再將20 μL待測菌液滴加于濾紙片上，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 人工感染實(shí)驗(yàn)

從病灶部位共分離得到W1、Q1、X1等7株優(yōu)勢菌，經(jīng)人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有W1對泥鰍具有高致病率，其余幾株對泥鰍不具致病性。人工感染情況如表1所示。創(chuàng)傷和浸泡感染死亡率為100%，其中在1.6×107CFU/mL濃度感染下10尾泥鰍均在第1天全部死亡。腹腔注射感染法在1.6×107CFU/mL濃度感染下的死亡率為80%。經(jīng)人工感染的泥鰍癥狀與自然發(fā)病的泥鰍癥狀一致，從吻部到眼前的一段皮膚呈乳白色，鰓部腐爛，斷須。

表1 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of artificial infection experiment

2.2 病原菌W1的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征和生理生化鑒定

經(jīng)觀察，菌株W1菌落呈圓形，淡黃色，表面光滑，邊緣整齊，中央隆起，不透明。顯微鏡觀察菌體呈桿狀，大小為(2.13±0.11) μm×(0.87±0.06) μm，革蘭氏陰性。菌株W1的生理生化特性見表2。

2.2.2 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育地位

以菌株W1基因組DNA為模板，使用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到其16S rRNA基因序列，大小為1425 bp。把序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號為MW 265010。將獲得的16S rRNA基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對，采用MEGA7.0軟件將該菌株與數(shù)據(jù)庫相似性較高的模式菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，結(jié)果表明，菌株W1與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii) ATCC33624的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)98.8%以上。結(jié)合形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)，將菌株W1初步確定為維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)。

表2 菌株W1的生理生化反應(yīng)結(jié)果Tab.2 Results of physiological and biochemical reactions of strain W1

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株W1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetics tree based on 16S rRNA gene sequence of strain W1 括號內(nèi)為菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登錄號；分支結(jié)點(diǎn)處數(shù)字為Bootstrap值；標(biāo)尺的數(shù)據(jù)為進(jìn)化距離.

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

病原菌W1對15種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。該菌對頭孢克肟高度敏感，對呋喃唑酮、鏈霉素、慶大霉素和恩諾沙星中度敏感，對紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素等表現(xiàn)一定程度的耐藥性。

表3 菌株W1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The drug sensitivity test of strain W1

2.4 病原菌W1的特性研究

2.4.1 W1對不同pH的適應(yīng)性

菌株W1在pH 5～9之間均能生長，且在此范圍內(nèi)pH對菌株W1的生長影響不大(圖2)。在pH為4時(shí)幾乎不能生長，說明過酸會(huì)抑制其生長。

2.4.2 W1對不同鹽度的適應(yīng)性

如圖3所示，菌株W1在鹽度0%～2.00%內(nèi)均能不同程度地生長，且生長無明顯規(guī)律，說明菌株W1對此鹽度范圍具有較好的適應(yīng)性。

圖2 不同pH對菌株W1生長的影響Fig.2 Effect of different pH on the growth of strain W1 小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，圖3同

圖3 不同鹽度對菌株W1生長的影響Fig.3 Effect of different salinity on the growth of strain W1

2.5 拮抗菌的篩選

按方法1.2.6進(jìn)行操作，結(jié)果如圖4所示。菌株X8和菌株E14出現(xiàn)抑菌圈，其抑菌圈直徑分別為(12.2±0.2) mm和(10.3±0.3) mm。表明這兩株菌對病原菌W1具有拮抗作用，特別是菌株X8拮抗效果突出。

圖4 拮抗菌的篩選Fig.4 Screening of antagonistic bacteria

3 討論

泥鰍在養(yǎng)殖過程中可能發(fā)生的疾病種類很多，如赤鰭病、爛鰓病、腸炎病、出血病等等，其中，赤鰭病主要癥狀表現(xiàn)為鰍體表及鰭部表皮剝落呈灰白色，腹部和體側(cè)出現(xiàn)紅斑，并逐漸變成深紅色[18]。爛鰓病因其鰓組織腐爛所致，泥鰍體色發(fā)黑，鰓絲腐爛發(fā)白[19]?；寄c炎病的泥鰍體表出現(xiàn)紅斑，腸壁充血發(fā)炎，腹部膨大，肛門紅腫，腸道呈紫紅色[4,20]。泥鰍出血病的癥狀為體表出現(xiàn)點(diǎn)狀、塊狀充血或出血，內(nèi)臟也有出血，呈敗血癥癥狀[21]。不同疾病誘因不同，引發(fā)這些疾病的病原主要有溫和氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌及維氏氣單胞菌等[6-9,22-23]。本研究從患白頭病泥鰍中分離、篩選到一株致病菌，經(jīng)鑒定為維氏氣單胞菌，經(jīng)回歸感染的病泥鰍表現(xiàn)癥狀主要為吻部前端發(fā)白、鰓部腐爛、斷須、活力較弱，這與曾明華等[24]研究的由溫和氣單胞菌引起的黃鱔白頭病癥狀相似。除曾明華等[24]發(fā)現(xiàn)的黃鱔白頭病外，有關(guān)白頭病在其它水產(chǎn)物種出現(xiàn)的病例還未見報(bào)道。

維氏氣單胞菌又稱凡隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌，隸屬弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，是一種革蘭氏陰性菌[25]。廣泛分布于淡水、污水及土壤中，不僅能引起多種水產(chǎn)動(dòng)物疾病，還會(huì)感染人類導(dǎo)致腹瀉，引起菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等[26]。關(guān)于維氏氣單胞菌引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物疾病的報(bào)道頻發(fā)，如：中華鱉腐皮、口咽腔潰爛綜合癥疾病[27]，泥鰍腐皮病[6,8]，斑點(diǎn)叉尾鮰的急性死亡[28]和錦鯉魚腸炎[29]等。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌能引起泥鰍腐皮病，并且一旦發(fā)生感染，泥鰍攝食及游泳活力很快減退，然后開始死亡，且死亡率高[8]。相較于以往研究結(jié)果，菌株W1的致病癥狀雖有所不同，但感染速度快和死亡率高這一特點(diǎn)與其相同。因此本研究篩選得到的維氏氣單胞菌W1對水產(chǎn)動(dòng)物的危害有待進(jìn)一步研究。

近年來，隨著水產(chǎn)藥物，特別是抗生素的大量使用，由此造成的細(xì)菌的耐藥性、水環(huán)境的生態(tài)失衡以及殘留物對人體的危害引起人們的極大關(guān)注[30]。因此用益生菌替代化學(xué)藥物受到廣泛的重視[31]，益生菌的使用也成為水產(chǎn)疾病防控的重要途徑[32]。本研究通過對泥鰍白頭病病原菌的拮抗菌篩選，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌X8對該病原菌W1具有較強(qiáng)的抑制作用。解淀粉芽孢桿菌作為重要的生防細(xì)菌，其抗菌譜較為廣泛[33]。孫梅等[34]篩選得到的解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌具有不同程度的抑制作用。解淀粉芽孢桿菌X8同樣具有廣譜性，不僅對維氏氣單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對其它水產(chǎn)病原菌如殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、遲緩愛德華菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌等也具有較好的拮抗作用[3]，已有實(shí)驗(yàn)證明其應(yīng)用的安全性[35]，因此X8菌株有望用于維氏氣單胞菌引起的水產(chǎn)病害的防治。