蛋白質免疫印跡技術在大學生創(chuàng)新實驗中的應用

陳立杰　杜巧麗　陳美晴　謝鑫

摘 要 在生物功能研究過程中，通常需要從混合蛋白中區(qū)分、檢測目標靶蛋白，而蛋白免疫印跡技術能較好的實現(xiàn)該目的。蛋白免疲印跡技術是一種先擇性地結合被分離混合物中特異蛋白的分析技術，具有靈敏度高、特異性強、分辨率高、分析容量大，可對蛋白進行定性、定量分析，檢測蛋白的時空表達變化情況，被廣泛應用于蛋白定性實驗技術中。為在大學生創(chuàng)新實驗中推廣該技術，本教學實驗以貴州大學本科生為對象，課程的主要內容包括了解蛋白印跡法的原理、目標蛋白載體的構建、蛋白可溶性表達、PAGE膠制作，以及蛋白質免疫印跡試驗。該教學可提高學生對蛋白免疫印跡技術原理和實驗操作技能的認識和掌握，同時訓練學生在科研中的能力。

關鍵詞 蛋白 免疫印跡 實驗教學

中圖分類號：G642 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ?DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2021.01.022

Abstract In the process of biological function research， it is usually necessary to distinguish and detect the target protein from the mixed protein， and Western blot technology can better achieve this purpose. Protein immunoblotting is a kind of analytical technology that selectively combines the specific proteins in the separated mixture. It has high sensitivity， specificity， high resolution and large analysis capacity. It can be used for qualitative and quantitative analysis of proteins and detect the changes of spatiotemporal expression of proteins. It is widely used in the qualitative experiment of proteins. In order to popularize the technology in the innovative experiment of college students， this teaching experiment is aimed at undergraduates of Guizhou University. The main contents of the course include understanding the principle of western blotting， the construction of target protein vector， the soluble expression of protein， the preparation of page gel， and the protein immunoblot test. This teaching can improve students' understanding and mastery of Western blotting technology principle and experimental operation skills， and train students' ability in scientific research.

Keywords protein; immunoblotting; experimental teaching

蛋白質印跡法（蛋白免疫印跡）即Western Blot，[1-2]是在DNA印跡法（Southern blot）和RNA印跡法（Northern blot）之后，整合電泳、轉印和免疫標記為一體的蛋白分離檢測技術，是對電泳技術的進一步延深和發(fā)展。目前是一種應用比較廣泛的蛋白質檢測實驗方法，主要應用于免疫遺傳學、生物化學和分子生物學中，同時也廣泛應用于蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個領域。[3]其基本原理主要是將經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的細胞或組織蛋白，用電印免疫印跡法轉移到固相支持物（化學惰性的高分子轉移膜，如聚偏二氟乙烯膜）上，然后將目標蛋白的特異性抗體（一抗）與轉移膜上的目標蛋白進行免疫結合反應，再用被辣根過氧化物酶標記過的二抗與一抗結合，隨后通過分析著色的位置和著色深度來檢測目標蛋白。

進行蛋白質免疫檢測通常需經過蛋白裂解及變性、蛋白電泳分離、轉模、封閉、一抗孵育、二抗孵育和特異性檢測等環(huán)節(jié)，由于該試驗涉及的步驟較多，對實驗設備及操作人員的要求較高，目前還未針對本科生開設此類課程。本文以貴州大學面向本科生開設的大學生開放性實驗課為基礎，對該實驗在本科實驗教學中進行應用，教學效果良好。

1 課程內容設計

該課程為大學生創(chuàng)新性實驗計劃課程，是農業(yè)及生命科學學科的選修課程。整個實驗課程內容為一個小設計型實驗項目。本課程的主要內容包括掌握蛋白質印跡法的原理、目標蛋白載體的構建、蛋白質可溶性表達、PAGE膠制作，以及Western blot實驗。

本課程通過設定不同條件（如溫度、菌株及不同IPTG，異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl-D-Thiogalactoside，濃度），以實現(xiàn)對目標蛋白的可溶性表達。由于本課程需進行連續(xù)性實驗，課程均安排于周末進行，共分為5次實驗及1次匯報，每次實驗時間約2～8學時，共約20～28學時。具體課程內容和安排見表1。

2 代表性結果

以在實驗教學過程中1組同學選擇的高粱（Sorghum bicolor）的抗病蛋白STG1為例。同學們對STG1進行了基因擴增、生物信息學分析、載體pET28a載體構建、原核表達條件摸索以及Western blot檢測，最終用Anti His抗體在重組菌株的上清樣品中檢測到一條清晰單一條帶，而空載體對照都沒有相應條帶，說明STG1蛋白成功表達。

3 教學效果

3.1 增強學生對蛋白免疫印跡技術及相關生化實驗技術的理解

在本次大學生創(chuàng)新實驗教學中，首先讓學生利用在線網(wǎng)站和文獻檢索了解相關實驗技術，了解其原理和實驗操作步驟。其次，學生要通過自主設計實驗并驗證蛋白是否成功表達，前提就要求學生要對基因、蛋白有一定的了解。學生通過親自參與整個實驗設計與操作，更進一步地增強了對蛋白免疫印跡技術及相關生化實驗技術的理解和掌握。

3.2 鍛煉學生的動手和分析能力

在實驗操作中，蛋白免疫印跡技術有兩大關鍵因素：（1）必須將分離的蛋白很好地從PAGE凝膠上轉到固相支持物上。在此過程中，對轉膜緩沖液的選擇顯得尤為重要，它對蛋白與膜和探針的結合起著決定性作用。（2）對抗體的選擇，抗體是目前在該技術中最常用的標記探針。在實驗驗證環(huán)節(jié)，許多學生會出現(xiàn)沒有得到理想的預期結果（信號弱或無信號、條帶大小與預期不符、非特異條帶、背景高、污點等常見問題），這是可能由于在轉膜過程中所配緩沖液組分不對，抗體選擇不對（一抗、二抗選擇及濃度選擇），在轉膜時溫度過高，制作PAGE凝膠時膠上有氣泡、膠厚度不一致、凝固程度不一致等因素造成的。這些都需要學生在操作過程中認真思考、按要求操作、多次摸索、總結經驗、找出失敗原因，多與老師和同學進行討論問題才能最終找到解決方案。問題能得到有效的解決，是鼓勵學生進行下一步實驗的關鍵。對于在本實驗中出現(xiàn)的問題，說明學生的動手操作能力還不夠，在本科階段很有必要設立此類動手能力強的生化實驗類創(chuàng)新課程，提高本科生的實際動手操作能力。

3.3 實驗教學的推廣性分析

蛋白免疫印跡技術在分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中是一種非常實用的實驗技術。對于只了解其理論知識而未受到過實際操作培訓的同學，具有實際的意義。對于農業(yè)及生命科學學科類專業(yè)的同學，學校具備實施此類實驗技術的相關設備，更應開設其相關實驗課程。此外，該實驗的最大優(yōu)勢就在于其適應性好，不需要特殊的實驗儀器。因此，希望通過蛋白免疫印跡技術的推廣，能讓廣大本科生受益。

4 教學總結

對2019年度的教學總結發(fā)現(xiàn)，40%的實驗組通過自主學習下完成實驗，約55%的實驗組能在老師的指導下完成實驗，5%的實驗組不能順利完成實驗。教學實踐結果顯示該實驗適合于高年級本科生（大三、大四），最好有分子生物學以及基本的生物信息學基礎的同學。學生在課程結束時要PPT匯報，并寫一份實驗報告以及個人學習總結，以鍛煉他們的書面和口頭表達能力。從匯報和實驗報告來看，學生對實驗背景、材料與方法、實驗操作過程和各階段的實驗結果都有清晰的認識。因此，非常有必要在本科教學中推廣此類課程。

*通訊作者：謝鑫

參考文獻

[1] Xu J， Bai L， Gu YY， Du F， Liu YJ. Synthesis， characterization， apoptosis， ROS， autophagy and western blotting studies of cyclometalated iridium（iii） complexes[J]. Inorganic Chemistry Communications，2019，111：107594.

[2] Moritz CP. 40 years Western blotting： A scientific birthday toast[J]. Journal of Proteomics， 2020，212.

[3] 宋亮，陳丹丹.淺談蛋白質印跡法操作過程中的實驗技巧[J].科技資訊，2015，13（21）：63-65.