2-脫氧-D-葡萄糖通過誘導(dǎo)人非小細胞肺癌細胞線粒體功能障礙抑制腫瘤細胞增殖①

胡先華 趙春艷 張海迪 陳書志 母 波 （川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，南充637000）

癌癥是威脅我國乃至全球人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和致死率居各類慢性疾病之首［1］。然而，癌癥作為一種長久以來存在的惡性疾病，一直難以攻克，這源于惡性腫瘤細胞獨有的特征，包括不間斷的生長信號刺激、強勁的自我復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤和轉(zhuǎn)移能力、逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控、細胞代謝異常、基因組的不穩(wěn)定性和突變等［2］。其中，能量代謝的異常在近年來受到學(xué)界的廣泛關(guān)注［3］。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細胞代謝異常密切相關(guān)［4］。德國生化和生理學(xué)家OTTO WARBURG早在20世紀20年代就提出了著名的“Warburg效應(yīng)”：即使有足夠的氧氣供應(yīng)，腫瘤細胞仍偏好于借助糖酵解途徑而不是能產(chǎn)生更多ATP的線粒體氧化磷酸化方式產(chǎn)生能量滿足快速生長的需求［5］。

2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）能競爭性地抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運體1和己糖激酶介導(dǎo)的磷酸化，其產(chǎn)生的6-磷酸2DG（2DG-6-phosphate，2DG-6P）聚集在細胞內(nèi)無法被代謝利用，且半衰期長達50 min，2DG-6P通過競爭性抑制磷酸葡萄糖異構(gòu)酶抑制6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，阻斷糖酵解于起始階段，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［6］。糖酵解途徑一直是腫瘤靶向的目標，而2-DG作為一種糖酵解抑制劑應(yīng)用于腫瘤治療方面的研究。目前研究表明2-DG能增強阿霉素和紫杉醇的抗腫瘤活性，和組蛋白脫乙酰酶抑制劑具有協(xié)同效應(yīng)［7］；2-DG與阿霉素或l-丁硫氨酸磺酰亞胺協(xié)同作用，可減少乳腺癌細胞的黏附和遷移，但是對于靶向抑制線粒體還鮮有報道［8］。

本研究旨在通過2-DG作用于非小細胞肺癌細胞后的一系列生物學(xué)行為改變來探討線粒體在腫瘤發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細胞肺癌細胞A549由川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像研究保存并傳代。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素購自HyClone公司；2-DG購自美國Sigma公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合度達80%～90%時用0.25%胰蛋白酶按1：3消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗操作。

1.2.2 CCK-8試驗 A549細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，并加入不同濃度的2-DG繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃ 孵育2 h，450 nm波長處測定吸光度值（A），計算細胞抑制率。

1.2.3 細胞凋亡試驗 A549細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度2-DG培養(yǎng)48 h后，重懸細胞后離心棄上清，按說明書分別加入Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min，最后用流式細胞儀測定。

1.2.4 細胞周期試驗 A549細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度2-DG培養(yǎng)48 h后，PBS重懸細胞，離心棄上清，70%乙醇固定2 h以上，再次重懸細胞，加入碘化丙啶染色液37℃避光溫浴30 min，最后用流式細胞儀測定。

1.2.5 線粒體膜電位測定（JC-1） A549細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入2-DG培養(yǎng)48 h后，按說明書加入JC-1工作液，37℃孵育20 min，后續(xù)步驟按試劑盒說明書進行，最后用流式細胞儀分析。

1.2.6 線粒體基因組測定 不同濃度的2-DG處理A549細胞后，對對照組和處理組細胞進行高通量測序，對比其線粒體基因組變化情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 -DG抑制非小細胞肺癌細胞A549增殖 分別用濃度為25μmo/lL、50μmo/lL、100μmo/lL、1 mmo/lL、10 mmo/lL的2-DG處理A549細胞48 h后，計算細胞抑制率，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，作用48 h后，各濃度2-DG均可明顯抑制A549細胞增殖，且隨著藥物濃度增大，A549細胞抑制率逐漸增大，其IC50約為10 mmo/lL。

2.2 2 -DG作用于A549細胞后凋亡測定 2-DG作用于A549細胞48 h后，流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡結(jié)果如圖2所示，2-DG對非小細胞肺癌細胞A549的凋亡抑制不明顯。

2.3 2 -DG作用于A549細胞后周期測定 與對照組相比，不同濃度2-DG作用于A549細胞48 h后細胞周期均有所改變，且隨著2-DG濃度增大，細胞周期更多阻滯在S期（圖3、表1）。

圖1 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞抑制率Fig.1 Cell inhibition rate of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖2 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖3 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞周期情況Fig.3 Cell cycle of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

2.4 線粒體膜電位測定結(jié)果 如4所示，2-DG作用于A549細胞后，細胞群發(fā)生偏移，A549細胞膜電位從高到低，說明2-DG可誘導(dǎo)A549細胞的線粒體膜損傷。

表1 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞周期情況Tab.1 Cell cycle of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖4 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后線粒體膜電位（JC-1）變化情況Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential（JC-1）in A549atdifferentconcentrationsof 2-DGfor 48h

2.5 線粒體基因組測定結(jié)果 測序結(jié)果如圖5所示，經(jīng)2-DG處理后的細胞線粒體基因組結(jié)構(gòu)與對照組相比無明顯變異。本研究中的高通量數(shù)據(jù)Q30＞95%（表2），且Amplicon覆蓋均一性高（圖6），表明本次測序質(zhì)量的可信度高。

圖5 2-DG處理A549細胞后線粒體突變頻率Fig.5 Mitochondrial mutation frequency of A549 treated with 2-DG

表2 2-DG處理A549細胞后線粒體測序質(zhì)量值QTab.2 Mitochondrial sequencing quality value Q of A549 treated with 2-DG

圖6 高通量測序Amplicon覆蓋均一性Fig.6 Coverage uniformity of high-throughput sequenc?ing Amplicon

3 討論

線粒體被稱為細胞的能量屋，在細胞生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。真核細胞中，大部分細胞能量（ATP）是在線粒體中通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生的，但腫瘤細胞卻以產(chǎn)能效率更低的糖酵解方式獲取能量，提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，線粒體氧化磷酸化途徑的作用很可能被嚴重削弱［9］。研究證實，糖酵解和線粒體呼吸作用的失衡增強了腫瘤細胞對低氧環(huán)境的適應(yīng)，有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程［10］。此外，糖酵解途徑導(dǎo)致的乳酸增加還可分解破壞腫瘤細胞周圍的細胞基質(zhì)，促進腫瘤細胞遷移［11］。因此，在腫瘤的發(fā)展過程中，糖酵解是其主要的供能方式。

在氧化呼吸過程中，線粒體電子傳遞鏈通過一系列氧化還原反應(yīng)將所產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢能儲存于線粒體內(nèi)膜，造成內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子濃度的不對稱分布從而產(chǎn)生電化學(xué)梯度，形成線粒體膜電位（mitochondrial membranepotential，MMP）［12］。正常的MMP是維持線粒體進行氧化磷酸化的先決條件，MMP的穩(wěn)定有利于維持細胞的正常生理功能，也是評價線粒體功能完整性的關(guān)鍵參數(shù)。線粒體功能障礙、線粒體膜損傷、線粒體電子傳遞鏈異常等均可能導(dǎo)致MMP發(fā)生改變。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。JC-1有單體和多聚體兩種形式存在，當(dāng)膜電位較高時，形成發(fā)射紅色熒光的多聚體，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生即膜電位較低時，形成發(fā)射綠色熒光的單體形式，故而可以通過細胞群的偏移來檢測線粒體膜電位的變化。

另外，研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤表現(xiàn)出線粒體DNA變異，其變異可導(dǎo)致氧化磷酸化功能受到抑制，活性氧物質(zhì)增加，促使腫瘤細胞在不利條件下依然能夠生長。由于線粒體DNA參與編碼有氧呼吸的關(guān)鍵組成部分—呼吸鏈的多個復(fù)合體，因此，與細胞核DNA相比，線粒體DNA缺乏組蛋白，且對DNA的修復(fù)能力較弱。由藥物刺激引起的腫瘤細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致線粒體DNA在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生異常［13］。同時，腫瘤細胞中線粒體DNA發(fā)生突變的頻率較高，這些突變也可能引起線粒體功能異常［14］。

WARBURG曾假設(shè)，線粒體呼吸鏈的破壞是腫瘤細胞糖酵解增強的重要原因［18］。由于線粒體基因組編碼了呼吸鏈中13個重要的蛋白組分，且線粒體DNA在腫瘤細胞中存在高頻突變［19］。例如，在前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中均可觀察到線粒體DNA突變［20-21］。推測線粒體DNA的突變很可能影響其所編碼蛋白的功能并影響呼吸鏈。

2-DG作為糖酵解抑制劑，在多種腫瘤中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。研究表明其可通過干預(yù)N連接糖基化，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非正常蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)，繼而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［15］。ZAGORODNA等［16］在淋巴瘤細胞的研究中表明，2DG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而激活Bcl-2相互作用細胞死亡介導(dǎo)因子，通過對Bcl-2家族促凋亡蛋白的調(diào)控誘導(dǎo)細胞凋亡。程秀等［17］的研究顯示，2-DG對乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用，但其本身并不誘導(dǎo)細胞凋亡，而是通過明顯增加臨床乳腺癌常用治療藥物的療效來誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，其機制可能是通過誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生過度的ER應(yīng)激反應(yīng)，增強Caspase-3活性而發(fā)揮作用。本研究著眼于經(jīng)2-DG作用之后的非小細胞肺癌細胞的行為學(xué)改變是否與線粒體DNA突變有關(guān)，并期望找到線粒體DNA的突變模式及其作用機制。

由CCK-8結(jié)果可知，經(jīng)不同濃度的2-DG刺激后，A549細胞的增殖活性受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，細胞生長抑制率逐漸增高，說明2-DG可有效抑制非小細胞肺癌細胞的增殖活性。然而，流式細胞術(shù)結(jié)果表明，在不同濃度2-DG的刺激下，A549細胞的凋亡并未明顯增強，而隨著2-DG濃度增大，A549細胞周期阻滯在S期，說明高濃度的2-DG刺激可有效抑制細胞周期進程，從而阻斷腫瘤細胞增殖。

有研究顯示，線粒體功能障礙與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，化療誘導(dǎo)的低水平線粒體DNA與腫瘤細胞獲得性耐藥和抗凋亡特性有關(guān)［22-24］。LIjIE‐MA［22］等研究了非小細胞肺癌（NSCLC）多藥耐藥的原因，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA突變與NSCLC腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但與其多藥耐藥能力無關(guān)，另外，乳酸和ROS生成的差異提示線粒體功能障礙參與了NSCLC的多藥耐藥。因此，線粒體功能障礙可能是腫瘤細胞發(fā)展迅速的重要因素之一，線粒體功能障礙導(dǎo)致線粒體呼吸鏈的破壞或減弱，腫瘤細胞糖酵解得以增強。

本研究也測定了經(jīng)2-DG處理后A549細胞的線粒體基因組序列，與對照組相比，線粒體基因組序列并未有所改變。然而JC-1結(jié)果顯示，隨著2-DG濃度的增加，細胞群發(fā)生偏移，線粒體膜電位（MMP）由高到低發(fā)生改變，說明2-DG誘導(dǎo)A549細胞線粒體膜發(fā)生損傷。結(jié)果表明，在2-DG的刺激下，A549細胞線粒體膜受到損傷，但并未導(dǎo)致基因組結(jié)構(gòu)的破壞。

4 結(jié)論

本研究顯示，2-DG能有效抑制非小細胞肺癌細胞A549的增殖活性，線粒體基因組檢測并未發(fā)現(xiàn)細胞線粒體DNA突變，因此，2-DG對非小細胞肺癌的抑制作用可能并不是通過誘導(dǎo)DNA突變導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常來實現(xiàn)的。推測2-DG可能主要作用于A549細胞的線粒體，通過誘導(dǎo)線粒體膜損傷，使線粒體功能發(fā)生障礙，進一步誘導(dǎo)細胞周期阻滯，從而抑制腫瘤細胞生長。然而，該的推測需要佐證，其具體作用途徑尚需進一步研究。