川芎嗪通過(guò)JAK 2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)線粒體自噬減輕心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

陳乘波 陳天寶 許友榜 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院心內(nèi)科，泉州362000）

心肌缺血是心臟性猝死的主要原因之一，冠狀動(dòng)脈再灌注是治療缺血性疾病最有效的方法，但其可能加重細(xì)胞損傷，即缺血再灌注損傷。由于心肌細(xì)胞無(wú)法再生，減少心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的策略受到了廣泛關(guān)注［1］。目前，心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的防治主要包括通過(guò)腺苷與別嘌呤醇減少炎癥反應(yīng)、阿托伐他汀鈣降低TNF-α、IL-1β濃度與心肌細(xì)胞凋亡及心肌缺血預(yù)處理等［2］。心肌再灌注期由于血氧的突然再補(bǔ)給而伴隨活性氧（reactive oxy‐gen species，ROS）的積累。線粒體不僅是心肌細(xì)胞產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵細(xì)胞器，也是ROS的主要來(lái)源和靶點(diǎn)。ROS可通過(guò)過(guò)氧化氫離子氧化細(xì)胞膜和細(xì)胞器脂質(zhì)，這種脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)一步導(dǎo)致反應(yīng)性醛的增加，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷。內(nèi)源性酪氨酸激酶2（ja‐nus kinase signal transducers 2，JAK2）是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduc‐ers and activators of transcription 3，STAT3）為其受體，JAK2與STAT3結(jié)合后可啟動(dòng)目的基因表達(dá)，促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡［3］。AG490為JAK2激酶的有效抑制劑，可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活［4］。川芎嗪是從中藥傘形科植物川芎提取出的四甲基吡嗪有效成分，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管等作用，臨床常用于心腦血管疾病的治療，但對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與機(jī)制鮮有報(bào)道［5］。本研究采用川芎嗪治療心肌缺血再灌注損傷，闡明其保護(hù)作用并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SD雄性大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重200～220 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0011。戊巴比妥鈉、肝素鈉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；AG490、TTC、DAPI購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Bcl2、Bax、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）及β-actin一級(jí)抗體購(gòu)自細(xì)胞信號(hào)技術(shù)有限公司；抗JAK2、STAT3一級(jí)抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）購(gòu)自中山公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick labeling，TUNEL）染色試劑盒購(gòu)自羅氏公司。

1.1.2 主要儀器 Langendorff小動(dòng)物心臟灌注裝置購(gòu)自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Leica RM2135組織切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；LIOOS600T熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組 SD大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg），腹腔注射500 U/kg肝素鈉20 min后，仰臥位固定于無(wú)菌操作臺(tái)。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)建立缺血再灌注模型，將左上肢、右上肢和左下肢接針形電極，用以記錄大鼠心電圖（elec‐trocardiogram，ECG）和心率（heart rate，HR）；于氣管處行縱切口，插管連接動(dòng)物呼吸機(jī)。同時(shí)參照文獻(xiàn)［9］采用6-0線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，穩(wěn)定10 min后，收緊線結(jié)即造成左冠狀動(dòng)脈閉塞以致大鼠心肌缺血，由左冠狀動(dòng)脈所支配的局部心肌發(fā)紺，心臟局部搏動(dòng)受限，血壓下降，ECG顯示ST段波動(dòng)較大或抬高或降低，呈現(xiàn)心肌梗死改變，視為大鼠心臟缺血成功，缺血30 min后再灌注60 min，以心電圖ST抬高≥0.15 mV為結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)，松開線結(jié)后ST-T回落超過(guò)50%為再灌注成功的標(biāo)志。造模成功后將大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組（IR組）、川芎嗪治療組（Lig組）、川芎嗪治療且AG490處理組（Lig-AG組）及AG490處理組（AG組），15只/組。Lig組造模前灌胃3 mg/L川芎嗪；Lig-AG組灌胃3 mg/L川芎嗪且含有5 mg/L的AG490；AG組灌胃5 mg/L的AG490；給藥體積5 ml，IR組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 LVDP、HR、±dp/dtmax及CF的檢測(cè) 心臟缺血再灌注結(jié)束后，通過(guò)傳感器（Biopac System）檢測(cè)各組大鼠LVDP、HR及CF，該傳感器與通過(guò)左心房插入左心室的注水乳膠球囊相連。心肌功能指數(shù)由左室舒張壓和最大壓力變化率（+dp/dtmax）決定。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，通過(guò)充氣使LVEDP調(diào)整到大約5 mmHg。隔離的心臟被恒溫玻璃罩（37℃）包圍以保持溫度。所有數(shù)據(jù)均采用AcqKnowledge 3.8.1軟件包和Biopac數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進(jìn)行記錄和存儲(chǔ)。

1.2.3 心肌梗死面積檢測(cè) 心功能檢測(cè)結(jié)束后，迅速剝離大鼠心臟，并沿長(zhǎng)軸連續(xù)切成6片。在37℃、1%TTC孵育10 min后，分別稱重6個(gè)心肌切片。計(jì)算機(jī)輔助平面測(cè)量法（OPTIMASv5.2）評(píng)估梗死區(qū)域的年齡百分比。標(biāo)準(zhǔn)化梗死面積（%）=梗死面積/總危險(xiǎn)面積×100%。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平。采用雙染色法，TUNEL染色定量凋亡核，DAPI染色定量心肌細(xì)胞核總數(shù)。在400倍放大條件下，隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，對(duì)綠色染色的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和所有藍(lán)色DAPI染色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）=總陽(yáng)性凋亡心肌細(xì)胞/總肌細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 線粒體膜電位檢測(cè) 采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）染色，熒光顯微鏡觀察拍照。自噬細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后觀察應(yīng)顯示綠色熒光，正常細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光，常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的檢測(cè)指標(biāo)之一，熒光定量采用Image J軟件。

1.2.6 氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 取部分大鼠心臟組織，試劑盒測(cè)定SOD活性和H2O2、MDA、GSH、GSSG水平。GSH和GSSG的值用于使用能斯特方程計(jì)算線粒體氧化還原電位（Eh）。

圖1 Lig對(duì)缺血再灌注心臟功能損傷的影響Fig.1 Effect of Lig on ischemia reperfusion injury

圖2 Lig對(duì)大鼠心臟梗死體積的影響Fig.2 Effect of Lig on the volume of heart infarction in rats

1.2.7 Western blot 提取心肌組織總蛋白并定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，95℃或更高溫度下變性10 min。將樣品加入SDSPAGE膠樣品孔（80 V，2 h）。膜轉(zhuǎn)移后（90 V，60 min），2%BSA密封過(guò)夜。TBST清洗4次后，4℃下一級(jí)抗體孵育過(guò)夜。TBST清洗4次，37℃下二級(jí)抗體孵育1 h。TBST清洗4次，反應(yīng)30 s后，將顯影液加入成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和圖像采集，并以β-actin作為內(nèi)參蛋白計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

汽輪機(jī)整個(gè)啟動(dòng)過(guò)程就是一個(gè)緩慢均勻的加熱過(guò)程，各部溫差及膨脹不正常的情況下就容易發(fā)生碰磨產(chǎn)生振動(dòng)，升速率及暖機(jī)點(diǎn)的選擇和控制就至關(guān)重要。本次汽封更換間隙調(diào)整后，除臨界轉(zhuǎn)速區(qū)以外，升速率及機(jī)組帶負(fù)荷速度均應(yīng)比正常啟動(dòng)緩慢，以便汽輪機(jī)加熱和汽封磨合，通過(guò)脹差、汽缸膨脹、各部溫度綜合判斷暖機(jī)效果及汽封磨合狀況，再?zèng)Q定升速或加負(fù)荷，切忌單純憑時(shí)間或某一參數(shù)決定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVDP、HR、±dp/dtmax及CF的比較 如圖1所示，與IR組相比，Lig組LVDP、HR、+dp/dtmax和CF明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組LVDP、HR、+dp/dtmax和CF明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 大鼠離體心臟梗死面積比較 如圖2所示，TCC染色結(jié)果顯示，與IR組相比，Lig組心肌梗死面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組心肌梗死面積明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Lig對(duì)缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響（×400）Fig.3 Effect on myocardial cell apoptosis after ischemia reperfusion（×400）

圖4 Lig對(duì)缺血再灌注后線粒體膜電位的影響Fig.4 Influence of Lig on mitochondrial membrane poten?tial after ischemia reperfusion

2.3 心肌細(xì)胞凋亡比較 如圖3所示，與IR組相比，Lig組細(xì)胞凋亡率明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 線粒體膜電位比較 如圖4所示，與IR組相比，Lig組線粒體膜電位明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組線粒體膜電位明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 Lig對(duì)缺血再灌注后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of Lig on oxidative stress response after isch?emia reperfusion

圖6 Lig對(duì)缺血再灌注后JAK2/STAT3通路及Bcl2、Bax蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Lig on JAK 2/STAT3 pathway，Bcl2 and Bax protein expression after ischemia reperfusion

2.6 JAK2、STAT3、Bcl2、Bax的表達(dá) 如圖6所示，與IR組相比，Lig組JAK2、STAT3、Bcl2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax蛋白表達(dá)明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組JAK2、STAT3、Bcl2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

缺血性心臟病是臨床常見(jiàn)心血管系統(tǒng)疾病之一，實(shí)行冠狀動(dòng)脈再灌注可有效降低死亡率［6］。然而，在短時(shí)間內(nèi)中斷心肌供血，一定時(shí)間后恢復(fù)供血，原缺血心肌會(huì)發(fā)生較為嚴(yán)重的損傷，包括心肌功能異常和細(xì)胞死亡等，這種情況稱為心肌再灌注損傷［7］。通常認(rèn)為，再灌注時(shí)自由基爆發(fā)、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡等是缺血再灌注損傷的重要原因［8］。

細(xì)胞通過(guò)自噬機(jī)制來(lái)清除受損或不需要的線粒體稱為線粒體自噬，發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，線粒體可產(chǎn)生大量ROS，且線粒體通透性發(fā)生改變，從而誘發(fā)線粒體自噬，線粒體通過(guò)細(xì)胞的自噬機(jī)制被清除［9-10］。另外，MDA是自由基引起不飽和脂肪過(guò)氧化作用的特征產(chǎn)物，心肌缺血再灌注損傷時(shí)，線粒體內(nèi)MDA含量顯著升高［11-12］。同時(shí)，GSH是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的多肽，研究表明，GSH預(yù)處理可減少線粒體氧化應(yīng)激，減少缺血再灌注損傷［13-14］。因此，缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體能量障礙是細(xì)胞壞死和凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

川芎嗪對(duì)心血管病的治療具有顯著療效，其作用機(jī)制主要有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝、調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)、影響細(xì)胞因子等。熊響清等［15］研究表明，川芎嗪可以和參麥注射液協(xié)同作用治療腦缺血再灌注損傷，緩解大鼠大腦缺血再灌注與多器官損傷；彭淼云等［16］研究表明當(dāng)川芎嗪與地塞米松聯(lián)合用藥時(shí)，用于治療腎缺血再灌注損傷，可能通過(guò)誘導(dǎo)Bcl2蛋白的合成，下調(diào)c-Fos、ICAM-1蛋白的合成減輕腎損傷；有研究表明，川芎嗪能夠平衡eNOS/iNOS兩種蛋白表達(dá)，維持體內(nèi)NO正常濃度以防止過(guò)量NO造成的心肌組織損傷［17-18］。李鵬飛等［19］研究表明，川芎嗪作用于缺血再灌注的大腦時(shí)還可減少線粒體損傷。然而，川芎嗪對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)與機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，川芎嗪能夠顯著減小心肌梗死面積、改善心肌功能、減少心肌細(xì)胞凋亡，可對(duì)缺血再灌注后的心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯保護(hù)作用。且川芎嗪能夠抑制線粒體膜電位降低，抑制線粒體內(nèi)MDA表達(dá)、GSH/GSSG升高并促進(jìn)SOD表達(dá)，提高缺血再灌注后心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制線粒體自噬，最終緩解缺血再灌注對(duì)于心肌細(xì)胞的損傷。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是參與機(jī)體分化、代謝、血管再生與侵襲的重要信號(hào)通路，多種因子及藥物可通過(guò)激活此通路促進(jìn)細(xì)胞新生，改善缺血，參與心肌保護(hù)［20］。Bcl2蛋白質(zhì)家族可在線粒體水平上決定細(xì)胞的存活或死亡，定位于細(xì)胞內(nèi)膜系特別是線粒體外膜上的Bcl2可起抗凋亡作用［21-22］。Bax作為促凋亡因子可活化轉(zhuǎn)移至線粒體外膜形成蛋白性孔道，改變線粒體膜通透性，激活下游caspase-9而誘導(dǎo)凋亡起始［23］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，川芎嗪能夠促進(jìn)JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活與Bcl2的表達(dá)，同時(shí)抑制Bax表達(dá)。因此，川芎嗪可通過(guò)對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活促進(jìn)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2與Bax表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，JAK2/STAT3信號(hào)通路可能與缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡相關(guān)，通過(guò)川芎嗪治療可緩解缺血再灌注后心肌細(xì)胞的損傷。川芎嗪對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路及線粒體自噬的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。