lncRNA PCGEM 1對(duì)塵螨抗原浸出物刺激后支氣管上皮細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥的影響①

陳詠麗 董善武 蔣 姝 劉 娜 陶 雙

（武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院兒科，武漢430030）

支氣管哮喘是近年備受關(guān)注的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是兒童最常見(jiàn)的慢性疾病，以氣道反應(yīng)性增強(qiáng)、氣道發(fā)炎和氣道重塑為特征［1］。近年來(lái)，兒童哮喘發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，已嚴(yán)重影響兒童的健康和生長(zhǎng)發(fā)育［2］。因此，對(duì)兒童哮喘的早期診斷和干預(yù)具有重要意義。近年研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在哮喘的進(jìn)展中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，靶向lncRNA是治療哮喘的新方向［3］。前列腺癌基因表達(dá)標(biāo)記物1（prostate can‐cer gene expression marker 1，PCGEM1）基因位于染色體2q32.3，研究顯示PCGEM1在前列腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，干擾PCGEM1可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，是惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)［4-5］。對(duì)哮喘患者血清中差異性表達(dá)的lncRNA進(jìn)行初步篩選發(fā)現(xiàn)，PCGEM1呈低表達(dá)，是臨床檢測(cè)哮喘潛在的新型分子標(biāo)記物［6］。支氣管上皮細(xì)胞是氣道抵抗外部環(huán)境的物理屏障，其功能障礙在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，但PCGEM1對(duì)哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以塵螨抗原浸出物刺激支氣管上皮細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)PCGEM1的表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)變化，初步探討PCGEM1在支氣管哮喘中的作用，以期為支氣管哮喘的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細(xì)胞16HBE購(gòu)于美國(guó)典型菌株保藏中心；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；安脫達(dá)（塵螨抗原提取物）購(gòu)于丹麥ALKAbello A/S公司；LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invit‐rogen公司；小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）、PCGEM1小干擾RNA（si-PCGEM1）、空載體（pcDNA3.1）、PC‐GEM1過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-PCGEM1）及PCR引物購(gòu)于南京金斯瑞生物科技有限公司；TRIzol試劑、RIPA裂解液、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetra‐zolium，MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技公司；胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymostromal lymphocytin，TSLP）、ELISA試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；兔源Cyclin D1、P21、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leu‐kaemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、磷酸甘油醛脫氫酶（phosphoglyceral‐dehyde dehydrogenase，GAPDH）抗體以及上樣抗兔Ⅱ抗為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組和處理 采用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為90%時(shí)進(jìn)行胰酶消化和傳代。取對(duì)數(shù)期16HBE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將16HBE以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%時(shí)，采用300 U/L安脫達(dá)刺激細(xì)胞24 h標(biāo)記為塵螨抗原浸出物［7］。正常培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組。為證實(shí)PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物刺激支氣管上皮細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000使 用 說(shuō) 明 分 別 將si-NC、si-PCGEM1、pcD‐NA3.1、pcDNA3.1-PCGEM1轉(zhuǎn)染至16HBE，經(jīng)安脫達(dá)刺激24 h后，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子分泌情況。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)PCGEM1的表達(dá)水平 TRIzol法提取各組16HBE細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。PCGEM1上游引物序列為5′-CACGTGGAGGACTAAGGGTA-3′，下游引物序列為5′-TTGCAACAAGGGCATTTCAG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算PCGEM1的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將16HBE以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，按照1.2.1分組進(jìn)行相應(yīng)細(xì)胞處理后，分別在24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)向各孔加入20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/ml的MTT試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄去孔內(nèi)上清液，再向各孔加入150μl DMSO孵育2 h，當(dāng)結(jié)晶完全溶解后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集按照1.2.1分組處理的各組細(xì)胞，PBS液洗滌細(xì)胞后，加入適量的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/ml，取100μl細(xì)胞懸液加入流式管，加入5μl Annexin V-FITC，輕輕地混勻后，室溫避光孵育10 min，加入5μl碘化丙啶（propidium iodide PI），室溫避光孵育5 min，補(bǔ)加結(jié)合緩沖液至500μl，輕輕混勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 ELISA檢測(cè)TSLP和TNF-α水平 16HBE按照1.2.1分組進(jìn)行相應(yīng)處理后，分別收集各組細(xì)胞上清液，以3 000/rmin 4℃離心15 min，收集上清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TSLP和TNF-α水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá) 收集按照1.2.1分組處理的各組細(xì)胞，RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度和純度。取適量細(xì)胞蛋白和等體積上樣緩沖液混合后，煮沸5 min使細(xì)胞蛋白充分變性。取30μg已冷卻至室溫的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白，結(jié)束后將蛋白濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。采用5%脫脂牛奶室溫條件封閉膜1 h，TBST洗膜后，加入已稀釋的Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，利用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，拍照后，以GAPDH為內(nèi)參照，圖像處理軟件分析各目的條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)分組均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)或復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘過(guò)敏原作用于16HBE對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1、表1和表2，與對(duì)照組相比，塵螨抗原浸出物組16HBE在24、48、72 h細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，炎癥因子TNF-α和TSLP的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。

2.2 PCGEM1在塵螨抗原浸出物刺激的16HBE中的表達(dá) 與對(duì)照組（1.01±0.10）相比，塵螨抗原浸出物組（0.24±0.02）16HBE細(xì)胞PCGEM1的表達(dá)水平顯著降低（t=22.651，P＜0.001）。

圖1 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on apoptosis

2.3 抑制PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用于16HBE增殖的影響 與si-NC組相比，si-PCGEM1組16HBE中的PCGEM1表達(dá)顯著降低，Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，P21的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞在24、48、72 h細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.001，圖2）。

2.4 抑制PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用于16HBE中凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響 與si-NC組相比，si-PCGEM1組16HBE中Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞上清液中TNF-α和TSLP表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。見(jiàn)圖3、表3。

表2 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對(duì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of dust mite antigen extract on expression of cytokines in 16HBE（±s，n=9）

表2 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對(duì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of dust mite antigen extract on expression of cytokines in 16HBE（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）Control45.672±3.59427.182±2.685 Dust miteantigen extract144.582±12.5921）112.275±10.2721）t 22.66024.044 P 0.0000.000

圖2 抑制PCGEM 1對(duì)塵螨抗原浸出物作用于16HBE增殖蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of PCGEM 1 inhibition on expression of 16HBE proliferative protein by dust mite antigen extract

表1 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表1 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

Cell activity（490 nm）Apoptosis Groupsrate（%）24 h48 h72 h Control0.62±0.060.95±0.091.38±0.148.01±0.84 Dust mite antigen extract0.34±0.031）0.44±0.041）0.59±0.061）28.82±2.931）t 12.52215.53515.56020.482 P 0.0000.0000.0000.000

表3 抑制PCGEM 1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors in dust mite antigen extract（±s，n=9）

表3 抑制PCGEM 1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors in dust mite antigen extract（±s，n=9）

Note：Compared with si-NCgroup，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）BaxBcl-2Apoptosisrate（%）si-NC140.286±13.591113.511±11.2510.42±0.040.71±0.0728.11±2.82 si-PCGEM1178.110±16.2241）139.160±12.4281）0.71±0.071）0.35±0.031）34.12±3.511）t 5.3614.59010.79114.1814.004 P 0.0000.0000.0000.0000.000

表4 過(guò)表達(dá)PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors by dust mite an?tigen extract（±s，n=9）

表4 過(guò)表達(dá)PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors by dust mite an?tigen extract（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）BaxBcl-2Apoptosis rate（%）pcDNA3.1142.275±13.599113.046±12.0460.43±0.040.74±0.0728.43±2.85 pcDNA3.1-PCGEM159.671±6.1241）36.511±3.6141）0.09±0.011）1.07±0.111）12.24±1.321）t 16.61618.25724.7397.59316.759 P 0.0000.0000.0000.0000.000

圖3 抑制PCGEM 1對(duì)塵螨抗原浸出物作用于16HBE凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of PCGEM 1 inhibition on apoptosis and apoptosis protein expression of 16HBE by dust mite antigen extract

2.5 過(guò)表達(dá)PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用于16HBE增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcD‐NA3.1-PCGEM1組16HBE中的PCGEM1表達(dá)顯著升高，Cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，P21表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞在24、48、72 h細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.001，圖4）。

2.6 過(guò)表達(dá)PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PCGEM1組16HBE中Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞上清液中TNF-α和TSLP表達(dá)顯著降低，（P＜0.001，圖5、表4）。

圖4 過(guò)表達(dá)PCGEM 1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE增殖蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of overexpressing PCGEM 1 on expression of 16HBE proliferative protein in role of dust mite an?tigen extract

圖5 過(guò)表達(dá)PCGEM1對(duì)塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis and expression of apoptotic proteins in 16HBE in?duced by dust mite antigen extract

3 討論

lncRNA是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的蛋白質(zhì)編碼能力有限的RNA，其可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)等多個(gè)水平調(diào)控生物過(guò)程。近年來(lái)，lncRNA在哮喘患者中的作用被逐漸揭示。例如，哮喘大鼠模型生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrestspecific 5，GAS5）的表達(dá)上調(diào)，GAS5通過(guò)miR-10a促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，敲除GAS5可顯著降低哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性［8］；靶向人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移 基 因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）可控制重癥哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥因子釋放，有效減少氣道重塑，對(duì)哮喘患者具有積極意義［9］；外周血Treg和Th17細(xì)胞失衡的程度與哮喘癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）通過(guò)調(diào)控哮喘患者Treg/Th17平衡進(jìn)而緩解哮喘癥狀［10］。PC‐GEM1最早發(fā)現(xiàn)于前列腺癌，其在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，抑制PCGEM1可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)早期凋亡［11］。此外，PCGEM1在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中也發(fā)揮癌基因作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12-13］。但PCGEM1在支氣管哮喘中的作用并未闡明。

本研究以過(guò)敏原刺激支氣管上皮細(xì)胞，探討PCGEM1對(duì)支氣管上皮細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響。氣道上皮細(xì)胞是抵抗病原體的天然屏障，當(dāng)其受到病原體或過(guò)敏原刺激后，支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生TSLP等炎癥細(xì)胞因子，TSLP通過(guò)與其受體相互作用，激活局部樹突細(xì)胞，促進(jìn)Th2免疫應(yīng)答炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞凋亡，破壞上皮屏障的完整性［14-15］。TNF-α是支氣管哮喘研究中重要的檢測(cè)指標(biāo)，正常情況下可參與抗組織感染和炎癥反應(yīng)，但TNF-α的過(guò)度產(chǎn)生則促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，加劇氣管炎癥反應(yīng)［16］。本研究顯示，塵螨抗原浸出物刺激后支氣管上皮細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，炎癥因子TNF-α和TSLP表達(dá)顯著升高，PCGEM1表達(dá)水平顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制PCGEM1可促進(jìn)TNF-α和TSLP分泌，促進(jìn)P21和Bax蛋白表達(dá)，抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)，加劇塵螨抗原浸出物刺激對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用；而過(guò)表達(dá)PCGEM1則逆轉(zhuǎn)塵螨抗原浸出物刺激對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及TNF-α和TSLP分泌的影響。提示PCGEM1在支氣管哮喘進(jìn)展中具有重要作用。然而，lncRNA調(diào)控通路復(fù)雜，PCGEM1下游是否存在miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是下一步研究重點(diǎn)［3］。

綜上所述，塵螨抗原浸出物刺激后支氣管上皮細(xì)胞中PCGEM1表達(dá)水平顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)PC‐GEM1可促進(jìn)哮喘過(guò)敏原刺激條件下支氣管上皮細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，減輕炎癥，上調(diào)PCGEM1有望成為支氣管哮喘治療的新途徑。