高強度超聲波對溶菌酶抑菌活性的影響

宋凱

高強度超聲波對溶菌酶抑菌活性的影響

宋凱

徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學院 藥品食品學院, 江蘇 徐州 221006

為探究應用高強度超聲波處理后溶菌酶抑菌活性的改變，本文以蛋清溶菌酶為原料，超聲波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，間隔10 s）分別處理5、10、15、20、25、30、45以及60 min，對比超聲處理前后溶菌酶抑菌活性變化。結(jié)果表明：超聲處理后，蛋清溶菌酶對大腸桿菌JM109的抑菌活性顯著增強，而對金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌活性則明顯降低，因此，適當?shù)某暡ㄌ幚頃鰪娙芫笇Υ竽c桿菌的抑菌活性。

超聲波; 溶菌酶; 抑菌活性

溶菌酶（Lysozyme）別名球蛋白，同時被稱作胞壁質(zhì)酶。這是一種專門作用于微生物細胞壁的糖苷水解酶，廣泛存在于人體多種組織器官及血液、汗液等分泌物中，絕大多數(shù)商品溶菌酶是從蛋清中分離純化得到的。蛋清溶菌酶作為非廣譜抗菌劑，主要作用于革蘭氏陽性細菌，其主要成分肽聚糖能夠水解細胞壁，但在革蘭氏陰性菌內(nèi)含量較少，且覆有一層較厚脂多糖類物質(zhì)，因此對革蘭氏陰性細菌幾乎不產(chǎn)生抑制作用[1]。

超聲波，在適當強度和頻率下，發(fā)揮特有的空化作用，形成振蕩反應，破壞物質(zhì)之間相互引力的吸附作用[2]。嚴偉等[3]論述超聲波提取技術(shù)時同時提出高強度超聲波對酶有抑制作用；高紜芳[4]研究酪蛋白酶的蛋白結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)：隨著超聲強度的增強，其對蛋白結(jié)構(gòu)的影響就越大。在超聲強度為400 w時，蛋白結(jié)構(gòu)就會變得疏松多孔；吳瓊英等[5]將超聲未處理數(shù)據(jù)與超聲處理數(shù)據(jù)進行比較：超聲波-離子液耦合預處理對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)有明顯破壞作用，其疏水基團大量顯于蛋白表面。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溶菌酶（≥20000 U/mg），合肥博美生物科技有限責任公司。

菌株：大腸桿菌JM109，金黃色葡萄球菌，溶壁微球菌，北京索萊寶科技有限公司。

酵母粉，宜興永信生物有限公司（江蘇）；蛋白胨，盛思生化科技有限公司（上海）；氯化鈉，氫氧化鈉，中泰化學試劑有限公司（上海）；瓊脂，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細胞粉碎機，XB-20雪花制冰機，新芝生物科技股份有限公司（寧波）；KYC-100C恒溫搖床，維誠儀器有限公司(上海)；普析儀器有限責任公司(北京)；DNP9162E電熱恒溫培養(yǎng)箱，精宏實驗設(shè)備有限公司(上海)；SW-CJ-IF單人雙面超凈臺，安泰技術(shù)公司(蘇州)；MILLI-Q超純水儀；高壓蒸汽滅菌器，致微儀器有限公司(廈門)；AIRAJ游標卡尺，易購五金工具有限公司(青島)。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶菌酶超聲樣品預處理將0.2 mg蛋清溶菌酶溶于100 mL超純水中，置于冰浴中，取未經(jīng)超聲處理的樣品1 mL，設(shè)為對照組。同時在冰浴條件下，取已配置完成的溶菌酶25 mL于離心管中。分別在超聲波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，間隔10 s）條件下處理5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，45 min，60 min，各取樣1 mL，并保存8組樣品數(shù)據(jù)[6-8]。

1.3.2 培養(yǎng)基配制酵母培養(yǎng)基，在高壓滅菌鍋(121 ℃，0.1 MPa)條件下滅菌20 min。液體培養(yǎng)基靜置冷卻待用；固體培養(yǎng)基內(nèi)加入瓊脂(1.5%)，在超凈工作臺中制作無菌平板(10 mL)若干，凝固待用。

1.3.3 菌懸液的制備在超凈工作臺上，用接種環(huán)分別挑取少量的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌接種于提前制備好的培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）培養(yǎng)24 h。然后，用接種環(huán)分別挑取少量培養(yǎng)菌體，接種到液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床（37 ℃）培養(yǎng)12 h。取適量菌液根據(jù)十倍稀釋法稀釋，在一定濃度梯度下得到不同菌懸液。分別取稀釋度為10-6、10-7和10-8的菌液平板培養(yǎng)，37 ℃，24 h，計菌落數(shù)，然后用滅菌去離子水稀釋原菌懸液至106~107CFU/mL[9]。

1.2.4 抑菌圈的測定方法參考杯碟法[10]并略有修改。取20 mL熔化的固體培養(yǎng)基置于平板中，凝固后，取菌液濃度為106~107CFU/mL的三種菌懸液200 μL，分別均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，10 min后，待菌液基本干透，在每個培養(yǎng)皿表面均勻放置5片濾紙片，用移液槍分別加入9種樣品液，蓋好培養(yǎng)皿，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測抑菌圈直徑。樣品實驗分別重復3次，以計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲強度處理溶菌酶的抑菌圈直徑

根據(jù)1.2.4的方法測定未處理的蛋清溶菌酶與經(jīng)超聲波處理后改變抑菌性的溶菌酶對3種菌的抑菌圈直徑的影響。每個樣品液重復實驗3次，測其抑菌圈直徑，結(jié)果見表1~3。

表 1 溶菌酶對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑

從上表1可知，未經(jīng)過超聲處理的溶菌酶對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，平均抑菌圈6.20 mm。且溶菌酶抑菌圈總體呈下降趨勢，由此可見隨著超聲處理溶菌酶時間的延長，溶菌酶抑菌活性先增強后下降，具體情況詳見圖1。

表 2 溶菌酶對大腸桿菌JM109的抑菌圈直徑

從上表2可知，未經(jīng)過超聲處理的溶菌酶對大腸桿菌JM109無抑菌活性，平均抑菌圈6.00 mm。而溶菌酶抑菌圈總體呈上升-持平-下降趨勢，由此可見隨著超聲處理溶菌酶時間的延長，溶菌酶抑菌活性先增強后減弱，且在10 min出現(xiàn)最大值，具體情況詳見圖2。

表 3 溶菌酶對溶壁微球菌的抑菌圈直徑

從上表3可知，未經(jīng)過超聲處理的溶菌酶對溶壁微球菌有明顯抑菌活性，平均抑菌圈6.30 mm。而溶菌酶抑菌圈總體呈下降趨勢，由此可見隨著超聲處理溶菌酶時間的延長，溶菌酶抑菌活性整體逐漸下降，具體情況詳見下圖3。

2.2 不同超聲強度處理溶菌酶抑菌曲線變化

根據(jù)表1-3數(shù)據(jù)所示平均值，作折線圖，如下

圖 1 不同超聲強度處理溶菌酶對金黃色葡萄球菌活性的影響

圖 2 不同超聲強度處理溶菌酶對大腸桿菌JM109活性的影響

圖 3 不同超聲強度處理溶菌酶對溶壁微球菌活性的影響

根據(jù)圖1~圖3，在超聲時間為0 min時，溶菌酶對金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌均有抑菌活性，且對溶壁微球菌抑菌活性最高，而對大腸桿菌JM109基本無明顯抑菌活性。在超聲時間為5 min時，溶菌酶對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都有所增強，但三種菌抑菌活性的數(shù)值略有不同，金黃色葡萄球菌增強的數(shù)值最大，為0.34 mm。在超聲時間為60 min時，溶菌酶對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都逐漸消失。

綜上所述，經(jīng)過超聲波處理后，溶菌酶對大腸桿菌JM109的抑菌活性有顯著增強，而對金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌活性則明顯降低。

3 討論

在超聲處理時間為5 min時，溶菌酶對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都有上升，而隨著超聲波處理時間延長，抑菌活性呈下降趨勢。處理時間60 min時，溶菌酶對三種菌的抑菌活性消失。導致溶菌酶抑菌活性變化的原因可能是超聲波會引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變。隨著超聲處理時間的延長，溶菌酶的蛋白高級結(jié)構(gòu)開始發(fā)生改變，蛋白表面疏水性氨基酸殘基增加，溶菌酶對革蘭氏陰性菌的穿透性增強。隨著超聲處理時間的延長，蛋白高級結(jié)構(gòu)逐漸被打亂，活性中心收到破壞，抑菌活性消失。

陶樹興等[11]研究了超聲波處理與溶菌酶單獨處理對嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制作用的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能增強溶菌酶的抑菌活性。羅彩林等[12]對比超聲波處理溶菌酶和未經(jīng)超聲處理溶菌酶的活性以及西施舌活性物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)當超聲波為150 w，15 min時，超聲波處理未破壞溶菌酶活性。前者與我們的實驗得到了類似的結(jié)果，后者與我們的結(jié)論形成對比，相同超聲時間下，超聲波強度較低時對溶菌酶活性沒有影響，而高強度超聲波對溶菌酶抑菌活性有影響。同時發(fā)現(xiàn)超聲強度和超聲時間這些相關(guān)參數(shù)的改變，某種程度上會引起溶菌酶抑菌活性的改變。

4 結(jié)論

一定強度的超聲波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，間隔10 s）處理可以有效增強溶菌酶對三種菌株的抑菌活性，其中金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌的最佳處理時間為5 min，而大腸桿菌JM109的最佳處理時間為10 min。在超聲波處理時間為10 min時，溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑菌活性沒有下降。因此，適量的超聲波處理可拓寬溶菌酶的抑菌圖譜。

[1] 趙電波,白艷紅,張小燕,等.天然生物防腐劑溶菌酶的改性研究進展[J].中國食品添加劑,2010,18(5):200-2004

[2] 楊曼利.雞蛋清中溶菌酶的提取及改性研究[D].南京:江南大學,2014

[3] 應崇福.超聲學[M].北京:科學出版社,1990:513

[4] 高紜芳.超聲波處理對酪蛋白酶特性的影響[D].鄭州:河南工業(yè)大學,2013

[5] 吳瓊英,賈俊強,杜金娟,等.超聲波-離子液體耦合預處理制備蠶蛹蛋白質(zhì)ACE抑制肽的工藝優(yōu)化[J].食品與生物技 術(shù)學報,2014,33(6):633-640

[6] 羅昭鋒,瞿鑫,沐萬孟,等.超聲和高壓處理對牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J].中國生物工程雜志,2006,26(1):46-49

[7] 吳序櫟,朱倩倩,成小娟,等.光譜法研究雞蛋溶菌酶熱變性與免疫原性的關(guān)系[J].分析化學,2011,39(2):198-202

[8] 方盈盈,胡新根,于麗,等.溶菌酶熱變性的DSC研究[J].物理化學學報,2007,23(1):84-87

[9] 楊曼利,曹棟,史蘇佳.化學法改性溶菌酶抑菌性及其結(jié)構(gòu)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(6):22-26

[10] 吳迪,蔡偉民.殼聚糖對細菌細胞壁的影響[J].黑龍江大學自然科學學報,2003,20(3):101-104,108

[11] 陶樹興,王婷婷,梁健,等.超聲和溶菌酶對嗜熱脂肪芽孢桿菌的協(xié)同殺菌作用[C]//中國微生物學會學術(shù)年會論文 摘要集.?？?中國微生物學會學術(shù)年會,2008:335

[12] 羅彩林,溫揚敏,鄭晨娜.超聲波法提取西施舌活性物質(zhì)及溶菌酶(LSZ)活性的比較[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志,2011,24(4):469-472

Effect of High Intensity Ultrasound on Antibacterial Activity of Lysozyme

SONG Kai

221006,

To investigate the change of antibacterial activity of Lysozyme after high intensity ultrasonic treatment, this paper used egg white Lysozyme as raw material, ultrasonic treatment (650 w, amplitude 30%, 20 kHz, working 10 s, interval 10 s) was conducted for 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 and 60 min, respectively. Results showed after ultrasound treatment, the antibacterial activity of egg white Lysozyme againstJM109 was significantly enhanced, while the antibacterial activity of egg white Lysozyme againstandwas significantly decreased. Therefore, proper ultrasonic treatment can enhance the antibacterial activity of Lysozyme against.

Ultrasound; Lysozyme; antibacterial activity

Q814.9

A

1000-2324(2021)02-0266-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.019

2020-02-05

2020-03-21

徐州市科技計劃項目:人溶菌酶重組改性及抑菌活性研究(KC16SG274)

宋凱(1977-),男,碩士,副教授,主要從事生物工程專業(yè)教學與研究工作. E-mail:13505211235@139.com