基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌DSYZ發(fā)酵條件

夏邦華,趙健,宮娉,韓小斌,彭玉龍,劉凱,汪城墻,丁延芹,杜秉海*

基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌DSYZ發(fā)酵條件

夏邦華1,趙健2,宮娉1,韓小斌2,彭玉龍2,劉凱1,汪城墻1,丁延芹1,杜秉海1*

1. 山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/山東省鹽堿地植物-微生物聯(lián)合修復工程技術(shù)研究中心, 山東 泰安 271018 2. 貴州省煙草公司遵義市公司, 貴州 遵義 563000

解淀粉芽孢桿菌DSYZ（）是一種重要的生防菌株，其代謝產(chǎn)物對多種病原菌有著拮抗作用，廣泛應(yīng)用于大蒜、辣椒、花生等農(nóng)作物的生物防治，但是自然條件下其分泌的代謝產(chǎn)物濃度較低并且濃度主要與培養(yǎng)基的組成，培養(yǎng)條件以及自身誘導肽有關(guān)。因此，通過響應(yīng)面分析法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化以及提高菌株活菌數(shù)成為當前的主要目標。首先利用添加不同碳源、氮源、無機鹽的豆芽汁培養(yǎng)基對菌株進行發(fā)酵，測定菌數(shù)，篩選出最適的碳源、氮源和無機鹽。進一步通過單因素試驗考察不同濃度的碳源、氮源和無機鹽對菌種菌數(shù)的影響。然后通過響應(yīng)面分析法對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組合。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中的最優(yōu)碳源是玉米粉為18.87 g·L-1，最優(yōu)無機氮源是氯化銨為1.36 g·L-1，最優(yōu)無機鹽是磷酸二氫鉀為0.47 g·L-1，優(yōu)化后培養(yǎng)基菌數(shù)達到2.20×109cfu·mL-1，是未優(yōu)化前的1.53倍。

解淀粉芽孢桿菌; 響應(yīng)面分析法; 發(fā)酵培養(yǎng)基; 培養(yǎng)基優(yōu)化

解淀粉芽孢桿菌DSYZ（）是一種重要的生防菌株[1]，對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌等病原菌具有拮抗作用[2]。通過解淀粉芽孢桿菌DSYZ產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（脂肽類抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)、抗菌蛋白等活性物質(zhì)）可以不同程度的抑制由病原微生物引起的植物病害[3]。除此之外，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的IAA、CTK和ACC脫氫酶也可以調(diào)控植物的生長[4]。目前，解淀粉芽孢桿菌DSYZ普遍應(yīng)用于大蒜、辣椒、花生等農(nóng)作物的生物防治[5]。雖然解淀粉芽孢桿菌DSYZ具有多種生防功能，但是自然條件下其分泌的生長素濃度較低并且濃度主要與培養(yǎng)基的組成，培養(yǎng)條件以及自身誘導肽有關(guān)[6,7]，因此，改良其液體發(fā)酵培養(yǎng)基成為當前的主要目標。

文獻報道中，張寶俊等[8]從解淀粉芽孢桿菌LP-5代謝產(chǎn)物中獲得一種對梨黑斑病菌（）具有較強抑制作用的抗菌蛋白。王曉輝等[9]從解淀粉芽孢桿菌K1的代謝產(chǎn)物中獲得一種抗菌蛋白，該蛋白可有效抑制灰霉病菌（）的生長。王翠娟等[4]通過研究解淀粉芽孢桿菌YTB1407在甘薯植株上的定殖特性，及其內(nèi)生定殖對甘薯生長前期根系統(tǒng)的作用，并初步探明其在甘薯塊根分化建成中對內(nèi)源生長素吲哚乙酸（IAA），細胞分裂素（CTK）含量變化及吲哚乙酸氧化酶類吲哚乙酸氧化酶（IAAO），過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的調(diào)控。桑建偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17分泌的活性物質(zhì)具有拮抗尖孢鐮刀菌古巴轉(zhuǎn)化型的活性。羅楚平等[11]和劉郵洲等[12]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的伊枯草菌素、泛革素具有較強的抗真菌活性。Xiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)分泌的泛革素及芽孢菌霉素對番茄萎焉病菌有較強的抑菌活性。Deleu M等[14]研究認為芽孢桿菌可以增強伊枯草菌素的抗真菌能力，并且在植物根系形成生物膜，保護植物不受侵染。

本研究以解淀粉芽孢桿菌DSYZ為發(fā)酵菌株，選擇培養(yǎng)基成分為自變量，以菌數(shù)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌DSYZ發(fā)酵培養(yǎng)基，得到最優(yōu)配方，為今后該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株解淀粉芽孢桿菌DSYZ（），由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑豆芽汁培養(yǎng)基：豆芽汁100 mL，蔗糖10 g，(NH4)2SO42 g，NaCl 0.4 g，ZnSO40.08 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH自然，115 ℃高壓滅菌30 min。

固體LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH調(diào)節(jié)至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)基

1.2.1 最適碳源優(yōu)化選取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和玉米粉各10 g分別作為碳源替換豆芽汁培養(yǎng)基中的蔗糖，其他成分不變，接種量為5%，37 ℃，180 rpm的恒溫培養(yǎng)48 h后測定解淀粉芽孢桿菌DSYZ的菌數(shù)，并通過改變最優(yōu)碳源濃度再次培養(yǎng)，確定培養(yǎng)基中碳源的最適濃度。

1.2.2 最適氮源優(yōu)化選取NH4NO3、NH4Cl和尿素各2 g分別作為無機氮源替換豆芽汁培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4，其他成分不變，接種量為5%，37 ℃，180 rpm恒溫培養(yǎng)48 h后測定解淀粉芽孢桿菌DSYZ的菌數(shù)，并通過改變最優(yōu)氮源濃度再次培養(yǎng)，確定培養(yǎng)基中氮源的最適濃度。

1.2.3 最適無機鹽優(yōu)化選取CaSO4、MgSO4和KH2PO4各0.4 g作為無機鹽替換豆芽汁培養(yǎng)基中的NaCl，其他成分不變，接種量為5%，37 ℃，180 rpm恒溫培養(yǎng)48 h后測定解淀粉芽孢桿菌DSYZ的菌數(shù)，并通過改變最優(yōu)無機鹽濃度再次培養(yǎng)，確定培養(yǎng)基中無機鹽的最適濃度。

1.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基

基于單因素篩選的碳源、無機氮源以及無機鹽的試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面分析軟件，以發(fā)酵培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌數(shù)為優(yōu)化指標，進行條件優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)培養(yǎng)基配方，并對配方進行驗證試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌數(shù)的影響

由圖1可知，在不同碳源中解淀粉芽孢桿菌DSYZ的菌數(shù)由高到低為玉米粉>蔗糖>可溶性淀粉>麥芽糖>葡萄糖>乳糖，且玉米粉濃度為20 g·L-1時達到最高值1.52×109cfu·mL-1。相對其他碳源，玉米粉是一種復合碳源，含有玉米淀粉，以及少量氮源和其余生長因子，能夠促進解淀粉芽孢桿菌DSYZ的生長。除此之外，玉米粉就其余種類碳源來說相對廉價易得，所以選擇玉米粉為最佳碳源。

圖1 碳源對解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌數(shù)的影響

2.2 無機氮源對解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌數(shù)的影響

如圖2所示，在不同無機氮源中解淀粉芽孢桿菌DSYZ的菌數(shù)由高到低依次為NH4Cl> NH4NO3>尿素>(NH4)2SO4，且在NH4Cl濃度為1.5 g·L-1時達到最高值1.42×109cfu·mL-1。相比于有機氮源，無機氮源成分相對單一，且質(zhì)量更為穩(wěn)定，在發(fā)酵培養(yǎng)基中更易被微生物快速利用。尿素雖然是有機物，但由于尿素作氮源，為培養(yǎng)基所提供的是銨態(tài)氮，屬于無機形式的氮，因此在本實驗中認為尿素屬于無機氮源。本實驗中所用到的無機氮源中，NH4Cl作無機氮源時解淀粉芽孢桿菌DSYZ生長情況最好，通過平板涂布計數(shù)法得到的總菌數(shù)最多，而(NH4)2SO4作無機氮源時總菌數(shù)最少。因此，在本實驗中選擇NH4Cl作為解淀粉芽孢桿菌DSYZ發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳無機氮源。

圖2 無機氮源對解淀粉芽孢桿菌菌數(shù)的影響

2.3 無機鹽對解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌數(shù)的影響

圖3 無機鹽對解淀粉芽孢桿菌菌數(shù)的影響

由圖3可得，不同種類的無機鹽對于解淀粉芽孢桿菌DSYZ的生長有著顯著的影響。在不同種類的無機鹽中，解淀粉芽孢桿菌DSYZ的菌數(shù)由高到低依次為KH2PO4> CaSO4>NaCl>MgSO4，且在KH2PO4濃度為0.5 g·L-1時達到最高值1.69×109cfu·mL-1。說明KH2PO4對于解淀粉芽孢桿菌DSYZ的生長有著較為明顯的促生作用，故選擇KH2PO4作為最優(yōu)無機鹽來源。

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌DSYZ發(fā)酵培養(yǎng)基

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對解淀粉芽孢桿菌DSYZ發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗方案，見表1。根據(jù)試驗優(yōu)化方案，安排17個試驗組，對DSYZ菌數(shù)進行測定，見表2。

表 1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

表3 Box-Behnken 實驗結(jié)果的方差分析

從表3可以看出，模型=0.0015＜0.01，表明該模型極顯著，失擬=0.0899＞0.05，表明差異不顯著，R=0.9414表明模型相關(guān)度好。從值的分析結(jié)果可以看出，各因素對菌數(shù)影響的大小順序為：無機氮源（=29.53）、無機鹽（=3.50）和碳源（=0.44）。響應(yīng)面是響應(yīng)值對試驗因子所構(gòu)成三維空間曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上能清楚看出最佳條件及各參數(shù)之間的交互作用，響應(yīng)面圖形越陡峭，即其交互作用越明顯，圖形平穩(wěn)則說明交互作用比較微弱[15,16]。由圖4、5和6可知，碳源（玉米粉）和無機氮源（氯化銨）交互作用最強，碳源（玉米粉）和無機鹽（磷酸二氫鉀）交互作用最弱。

對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，可得到生物量和各因子（123）之間的回歸方程：=2.16-0.0141-0.112-0.0393+0.01212-0.02013-2.50E-00323-0.06412-0.2022-0.1232根據(jù)模型預(yù)測得出，當玉米粉濃度為18.87 g·L-1，無機氮源濃度為1.36 g·L-1，無機鹽濃度為0.47 g·L-1，發(fā)酵培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌菌數(shù)獲得最大值，達到2.18158×109cfu·mL-1。對發(fā)酵培養(yǎng)基預(yù)測值進行驗證試驗，取平均值測得解淀粉芽孢桿菌菌數(shù)2.20×109cfu·mL-1。預(yù)測值與實測值結(jié)果基本相同，表明回歸方程能夠比較真實的反應(yīng)各因素對菌數(shù)的影響。

圖4 碳源（玉米粉）和無機氮源（氯化銨）的響應(yīng)面和等值線

圖5 碳源（玉米粉）和無機鹽（磷酸二氫鉀）的響應(yīng)面和等值線

圖6 無機氮源（氯化銨）和無機鹽（磷酸二氫鉀）的響應(yīng)面和等值線

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在其生長的過程中產(chǎn)生的一系列的代謝產(chǎn)物，使得解淀粉芽孢桿菌具有較強的抑制真菌和細菌活性的能力，從而減輕真菌和細菌對作物造成的病害[17]。解淀粉芽孢桿菌的菌數(shù)主要受培養(yǎng)基成分、發(fā)酵培養(yǎng)條件以及復雜的代謝調(diào)理機制的影響。解淀粉芽孢桿菌DSYZ液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化涉及到多個因素和水平，若是采用傳統(tǒng)的正交試驗會造成繁重的工作量并且很難得到理想的結(jié)果。采用響應(yīng)面分析法可以迅速、有效的從影響解淀粉芽孢桿菌菌數(shù)的因子中篩選出主要影響因素，并且實現(xiàn)條件優(yōu)化，該統(tǒng)計學方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[18-22]。在單因素試驗中，玉米粉作為碳源時菌數(shù)優(yōu)于其他對照，可能原因是玉米粉屬于復合碳源，除了含有主要成分玉米淀粉外，還含有微生物生長所需要的部分氮源以及其他生長因子，能夠更大程度地滿足微生物生長的條件[23]。除此之外，玉米粉還具有價格低廉、原料易得等優(yōu)點，為下一步的大規(guī)模生產(chǎn)提供了成本上的便利。NH4Cl作為無機氮源時效果最好，可能原因是NH4Cl成分穩(wěn)定，在發(fā)酵培養(yǎng)基中更易被微生物快速利用，而KH2PO4作為無機鹽來源時對菌數(shù)影響較大，是CaSO4組的121.32%。

通過響應(yīng)面分析得到解淀粉芽孢桿菌DSYZ最優(yōu)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉濃度18.87 g·L-1，無機氮源濃度1.36 g·L-1，無機鹽濃度0.47 g·L-1。對響應(yīng)面分析結(jié)果進行驗證試驗，取平均數(shù)后得到解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌數(shù)為2.20×109cfu·mL-1，與預(yù)測值2.18158×109cfu·mL-1之間誤差小于1%，說明預(yù)測模型可靠度高。解淀粉芽孢桿菌DSYZ菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化以及菌數(shù)的提高，為其下一步的實驗室培養(yǎng)、工業(yè)化生產(chǎn)以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Optimal Fermentation Conditions forDSYZ Based on Response Surface Methodology

XIA Bang-hua1, ZHAO Jian2, GONG Ping1, HAN Xiao-bin2, PENG Yu-long2, LIU Kai1, WANG Cheng-qiang1, DING Yan-qin1, DU Bing-hai1*

1.271018,2.563000,

(DSYZ) is an important Biocontrol Strain and its metabolites have an antagonistic effect on various of pathogenic bacteria, widely used in the biological control of crops, like garlic, pepper, peanut and so on. However, its metabolites have a low concentration under the natural conditions and the concentration is mainly related to the composition of the culture medium, culture conditions, and self-inducing peptide. Therefore, the main objective is to optimize the fermentation medium and increase the number of active strains by response surface analysis. Firstly, fermenting the strain by the soybean sprout juice medium which was added with different carbon, nitrogen and inorganic salts , then determining the number of bacteria to select the exact concentrations of carbon, nitrogen and inorganic salts. Furthermore, the effect of different concentrations of carbon, nitrogen and inorganic salts on the bacteria population was investigated by single factor experiment. After that, response surface analysis was used to optimize the strain fermentation medium , along with the optimal medium combination. Finally, the best carbon source of the optimized fermentation medium was corn meal (18.87 g·L-1), the exact inorganic nitrogen source was ammonium chloride (1.36 g·L-1), the optimal inorganic salt was potassium dihydrogen phosphate (0.47 g·L-1), and the number of bacteria in the optimized medium reached 2.20×109cfu·mL-1, 1.53 times of that before optimization.

; response surface analysis; fermentation medium; medium optimization

S154.39

A

1000-2324(2021)02-0241-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.014

2019-11-04

2020-02-24

國家重點研發(fā)計劃項目(2017YSD0200804);貴州煙草遵義市煙草公司科技項目(遵煙計[2017]號)

夏邦華(1994-),男,在讀碩士研究生,研究方向:農(nóng)業(yè)微生物工程. E-mail:1037352095@qq.com

Author for correspondence. E-mail:du_binghai@163.com