白菜DBB基因家族的鑒定與表達(dá)分析

陳雨,鄧九州,吳曉宇,趙玉梅,王潔,段巧紅,黃家保

白菜基因家族的鑒定與表達(dá)分析

陳雨,鄧九州*,吳曉宇,趙玉梅,王潔,段巧紅,黃家保**

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室, 山東 泰安 271018

基因在開花調(diào)控、根系生長、光形態(tài)建成、種子萌發(fā)、果實發(fā)育、逆境脅迫等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，但在白菜中還未有關(guān)于基因的報道。本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定到18個白菜基因，其蛋白分子量為11285.63~35796.93D，理論等電點介于4.66~9.35之間，外顯子數(shù)量為2~5個；大多數(shù)成員N端都含有保守結(jié)構(gòu)域B-box1和B-box2，精氨酸和亮氨酸是在所有成員中都保守的氨基酸殘基；該家族基因不均勻分布于白菜10條染色體上，多數(shù)基因出現(xiàn)基因復(fù)制，產(chǎn)生2個以上同源基因；多數(shù)基因與擬南芥基因具有線性對應(yīng)關(guān)系。順式作用元件分析表明白菜基因啟動子上含有大量的光、厭氧、激素、低溫等響應(yīng)元件。組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因在不同組織中的表達(dá)水平與根類似；在花中的表達(dá)水平顯著高于其它成員。此外，絕大多數(shù)白菜基因?qū)}脅迫有不同程度的響應(yīng)。這些結(jié)果為后續(xù)解析基因在白菜中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

白菜; DBB; 生物信息學(xué)分析

鋅指蛋白是真核生物中的一類具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]，其中含有B-box基序的蛋白稱為BBX，在擬南芥中有32個成員，其C端通常含有CCT結(jié)構(gòu)域[2]。含有CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白通常與光周期有關(guān)，在植物中與成花相關(guān)基因一起調(diào)控開花時間[3]。但BBX中有一類缺乏CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白，稱為DBB（double B-BOX），其突出特點是N端具有兩個或以上的B-Box結(jié)構(gòu)域且C端缺乏CCT結(jié)構(gòu)域[4]。

植物DBB家族在逆境脅迫（鹽脅迫、溫度脅迫、干旱脅迫等）、開花調(diào)控、光形態(tài)建成、根系生長、種子萌發(fā)，果實發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。(SALT TOLERANCE)最初是酵母中發(fā)現(xiàn)的耐鹽基因[5]，后來在擬南芥中發(fā)現(xiàn)它能挽救鹽敏感突變體的表型[6]。擬南芥基因的下調(diào)表達(dá)植株對高溫性的耐受性提高，而過表達(dá)株系對高溫敏感[7]。桃與擬南芥同源，研究顯示桃在0℃條件下儲存28 d后的保鮮效果比4 ℃條件下明顯要好，基因表達(dá)分析結(jié)果顯示在0 ℃條件下被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測其很可能與桃的低溫適應(yīng)相關(guān)[8]。菊花與擬南芥為同源基因，其過表達(dá)能夠增強(qiáng)菊花在低溫和干旱條件下的適應(yīng)能力[9]。之前的研究還發(fā)現(xiàn)STO在開花調(diào)控中的重要作用，STO可以降低FLC的表達(dá)激活開花時間決定基因和的表達(dá)，從而促進(jìn)開花[10]。DBB在光形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，DBB2、STH2、DBB3、DBB4促進(jìn)光形態(tài)的建成，而DBB1a、DBB1b、STO、STH是光形態(tài)建成的負(fù)調(diào)控因子[11]。另外STO和GA互作在UV-B誘導(dǎo)的擬南芥根系生長抑制中具有負(fù)調(diào)控作用[12]。Bai等發(fā)現(xiàn)(AtBBX19)過表達(dá)植株表現(xiàn)為ABA超敏，通過與啟動子中的基序結(jié)合誘導(dǎo)其表達(dá)，從而調(diào)控種子萌發(fā)[13]。果實發(fā)育調(diào)控方面，蘋果中MdBBX20受紫外線誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)后顯著促進(jìn)蘋果花青素的合成，在低溫環(huán)境下與MdbHLH3互作共同調(diào)控花青素的積累，從而影響蘋果的著色[14]；番茄SlBBX20可以激活類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶來促進(jìn)番茄中類胡蘿卜素的合成[15]。

隨著基因測序成本的降低，大量的物種完成基因組測序，育種工作進(jìn)入分子時代。白菜已于2011年完成了基因組測序工作[16]。但是到目前為止尚未有關(guān)于白菜基因家族成員及其基本生物信息學(xué)分析的研究報道。本研究對白菜的基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)鑒定并研究其在不同組織中的表達(dá)情況和鹽脅迫下的表達(dá)情況，為后續(xù)深入研究白菜基因家族功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 白菜DBB家族基因成員鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)擬南芥已經(jīng)鑒定的8個DBB序列，通過BLAST在白菜基因組（genome v1.5）中搜索候選的白菜DBB家族成員，最后通過保守結(jié)構(gòu)域分析等綜合方法進(jìn)一步確定候選基因。使用TBtools軟件[17]結(jié)合Expasy（https://www.expasy.org/）[18]分析白菜DBB基因家族的蛋白質(zhì)分子量(MW)、等電點(pI)等理化性質(zhì)。

1.2 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用TBtools繪制白菜基因的結(jié)構(gòu)圖；利用MEME (http://meme-suite.org/)[19]預(yù)測白菜DBB蛋白保守基序；使用軟件DNAMAN中的Multiple Sequence Alignment功能對白菜DBB序列進(jìn)行比對，分析其保守氨基酸位點。

1.3 染色體定位和共線性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

從白菜數(shù)據(jù)庫下載gff3文件，用TBtools繪制基因在染色體上的分布圖。通過McscanX[20]繪制白菜與擬南芥基因家族共線性分析圖。利用MEGAX[21]對白菜DBB家族氨基酸序列與擬南芥DBB家族氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，采用最大似然法（Maximum Likelihood Estimate，MLE）構(gòu)建擬南芥和白菜的基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 順式作用元件分析

從Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）[22]中查找并下載白菜家族基因起始密碼子上游2000 bp序列，使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網(wǎng)站[23]對獲取的序列進(jìn)行分析。

1.5 白菜DBB基因表達(dá)分析

本試驗采用“蛋黃白”白菜品種為材料。對于組織特異性表達(dá)分析，收集30 d苗齡的根、莖、葉和80 d苗齡的花和果莢用于RNA提取。對于鹽脅迫下基因表達(dá)分析，挑選生長狀況相近的白菜幼苗浸泡于用Hoagland營養(yǎng)液配制的150 mM·L-1NaCl溶液中，12 h后收集材料用于RNA提取，以正常水培幼苗為對照。

使用qPrimerDB-qPCR Primer Database（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）[24]查找設(shè)計引物，內(nèi)參基因為（表1），由青島擎科梓熙生物技術(shù)公司合成。采用RNA提取試劑盒（百泰克）提取白菜樣品的總RNA，參照HiScript ll QRT SuperMix for qPCR（諾維贊）試劑盒產(chǎn)品說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（諾維贊）試劑盒進(jìn)行定量PCR實驗。反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，SYBR 10 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火22 s，進(jìn)行40個循環(huán)。基因的相對表達(dá)量以2—ΔΔCt法計算。數(shù)據(jù)利用Excel軟件進(jìn)行整理并通過TBtools繪制熱圖。

表 1 熒光定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜DBB基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

通過生物信息學(xué)的方法，我們一共鑒定到18個白菜DBB家族成員（表2）。白菜DBB家族成員數(shù)量遠(yuǎn)多于擬南芥。白菜DBB蛋白分子量介于11285.63~ 35796.93D，理論等電點介于4.66 ~ 9.35之間。除Bra020746和Bra008204之外，其余16個DBB蛋白家族成員的等電點都小于7.0（表2），說明DBB家族蛋白成員大多富含酸性氨基酸，這與玉米[25]和番茄[26]的DBB家族蛋白相似。

表 2 白菜DBB基因家族信息

2.2 白菜DBB家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用TBtools繪制了白菜18個基因結(jié)構(gòu)圖。如圖1所示，白菜基因家族中外顯子數(shù)目差異不大，從2個()到5個（）不等，多數(shù)家族成員都含有3個外顯子。

使用NCBI的CDD工具結(jié)合TBtools軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，獲得DBB家族的10個保守基序（圖2）。圖中motif1和 motif2分別表示B-box1和B-box2結(jié)構(gòu)域，除Bra020746蛋白和Bra022838蛋白外的白菜DBB蛋白都含有這兩個保守基序。此外，白菜DBB蛋白motif在序列中分布較為均勻，說明該家族成員基序之間離散程度差異較小。使用DNAMAN對白菜DBB氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)白菜DBB中含有高度保守的精氨酸和亮氨酸位點（圖3）。

圖 1 白菜DBB基因結(jié)構(gòu)分析

圖 2 白菜DBB家族結(jié)構(gòu)域分析

2.3 白菜DBB基因染色體定位及與擬南芥基因的共線性分析

基因在染色體上定位圖（圖4）顯示在白菜的10條染色體上都有基因分布。A07染色體分布的家族成員最多，有4個基因。A02和A08各有三個基因，其余只有1~2個。在白菜基因家族中鑒定出13個存在基因復(fù)制的基因。

圖 3 白菜DBB家族氨基酸序列比對

圖4 白菜的DBB基因在染色體上的分布

Fig.4 Distribution of DBB genes on chromosome ofin Brassica rapa

使用TBtools對白菜與擬南芥的DBB家族成員進(jìn)行共線性分析（圖5），結(jié)果顯示除了和，其它都在擬南芥家族中找到了對應(yīng)的直系同源基因，表明白菜與擬南芥DBB家族具有良好的共線性關(guān)系。

圖 5 白菜與擬南芥間DBB家族共線性分析

2.4 白菜DBB的系統(tǒng)進(jìn)化分析

用軟件MEGAX對26個DBB蛋白序列(擬南芥8個，白菜18個)進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建DBB家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。進(jìn)化樹中兩個物種的DBB家族成員在進(jìn)化樹中交叉聚集，表明白菜DBB家族成員大多與擬南芥DBB家族成員進(jìn)化關(guān)系較近。

圖 6 白菜、擬南芥DBB家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

Bra：白菜AT：擬南芥

2.5 白菜DBB基因的啟動子順式作用元件分析

基因表達(dá)的時空特性是由各種轉(zhuǎn)錄因子對基因啟動子活性的調(diào)控決定的。為了探究基因可能的調(diào)控模式，我們利用PlantCARE對基因上游2 kb啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在白菜基因家族含有的啟動子元件中光響應(yīng)元件數(shù)量最多，經(jīng)計算平均每個基因含8.44個光響應(yīng)元件，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他響應(yīng)元件的數(shù)量，其中中含有的光響應(yīng)元件數(shù)量為17個。18個基因均含有厭氧響應(yīng)元件和一定數(shù)量的激素響應(yīng)元件，其中14個含有脫落酸響應(yīng)元件，13個含有茉莉酸響應(yīng)元件，11個含有赤霉素響應(yīng)元件，10個含有生長素響應(yīng)元件，10個含有水楊酸響應(yīng)元件。此外，低溫、干旱等逆境脅迫響應(yīng)元件的數(shù)量也較為豐富；家族基因啟動子序列上還發(fā)現(xiàn)有參與分生組織表達(dá)、胚乳表達(dá)、生物鐘及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的響應(yīng)元件（圖7），暗示此家族基因功能的多樣性。

圖 7 白菜DBB基因啟動子順式作用元件分析

2.8 DBB基因在不同組織和鹽脅迫下的表達(dá)分析

為了了解不同在不同組織中的表達(dá)情況，我們通過熒光定量PCR分析了在白菜根、莖、葉、花和果莢中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示大多數(shù)基因在莖、葉、花和果莢中的表達(dá)水平與根中類似；在莖中相對表達(dá)量較高的有；葉中相對表達(dá)量較為突出的為，其中在葉中的相對表達(dá)量最高；與在果莢中的相對表達(dá)量較高。特別值得注意的是的表達(dá)模式最為特殊，該基因在莖、葉、花和果莢中的表達(dá)水平均高于在根中的表達(dá)，且在花中的表達(dá)水平為根中的三十倍左右（圖8）。

圖 8 白菜不同組織中DBB基因的表達(dá)模式

為探究白菜家族基因在鹽脅迫狀態(tài)下的表達(dá)情況，我們通過熒光定量PCR分析了在正常與150 mM·L-1NaCl脅迫狀態(tài)下的表達(dá)水平，結(jié)果表明白菜絕大多數(shù)基因會對鹽脅迫有一定程度的響應(yīng)，只有對鹽脅迫的響應(yīng)不明顯；有5個基因的表達(dá)在鹽脅迫狀態(tài)下呈上調(diào)趨勢，其中的表達(dá)量為正常情況下的兩倍多；12個基因的表達(dá)在鹽脅迫狀態(tài)下的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，其中基因的表達(dá)下調(diào)最為顯著（圖9）。

圖 9 在鹽脅迫下白菜DBB基因家族表達(dá)分析

3 討 論

白菜基因組已于2011年測序完成，但目前白菜分子生物學(xué)研究仍然較為薄弱。本研究通過生物信息學(xué)的方法鑒定到18個家族成員，并對其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)特點和表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為深入研究基因在白菜中的功能打下了基礎(chǔ)。

對擬南芥與白菜的DBB家族成員的共線性分析表明二者DBB家族的大部分成員間具有較強(qiáng)的共線性，推測它們有著類似的功能。在擬南芥中，耐鹽基因的過表達(dá)能提高植株的耐鹽性[6]?；蚣易妍}脅迫下的表達(dá)分析顯示，白菜中的四個同源基因和均在鹽脅迫條件下表達(dá)水平均受到顯著影響，因而推測這些基因很可能在白菜鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。菊花可以調(diào)節(jié)植物開花時間[9]，而我們的分析數(shù)據(jù)顯示，在白菜中的直系同源基因含有大量的光響應(yīng)元件，并在花中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，據(jù)此推測其可能在調(diào)控白菜開花中發(fā)揮重要作用，值得下一步深入研究。此外，的同源基因含有大量的低溫響應(yīng)元件，暗示該基因可能參與調(diào)節(jié)白菜低溫脅迫過程。

4 結(jié) 論

白菜中共有18個基因，與擬南芥基因有良好的共線性關(guān)系，啟動子分析、基因表達(dá)分析結(jié)果暗示白菜DBB很可能在白菜開花調(diào)控和抗鹽過程中發(fā)揮重要作用。

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Identification and Expression Analysis ofFamily Genes in

CHEN Yu, DENG Jiu-zhou*, WU Xiao-yu, ZHAO Yu-mei, WANG Jie,DUAN Qiao-hong, HUANG Jia-bao**

271018,

DBBs play an important role in plant flowering regulation, root growth, photomorphogenesis, seed germination, fruit development and abiotic stress response. However,gene family has not been identified in. In this study, 18genes were identified by bioinformatics method. The molecular weight was 11285.63 ~ 35796.93 D, the theoretical isoelectric point ranged from 4.66 to 9.35, and the number of exons ranged from 2 to 5; The N-terminus of most members contained the conserved domains B-box1 and B-box2, and the arginine and leucine were found as the most conserved amino acid in all DBBs. The DBBs were distributed unevenly on 10 chromosomes, and most of the genes were duplicated, producing more than 2 homologous genes. Most of the genes had linear correspondence withgenes. The cis-element analysis showed that thegene promoter contained a large number of light, anaerobic, hormonal and low temperature response elements. Tissue expression analysis showed that the expression level of most genes in different tissues was similar to that in the roots, interestingly, the level ofin flowers was remarkably higher than that in other members. In addition, most of theinrespond to salt stress. These results laid a foundation for further analysis of the biological functions ofgenes in.

;; bioinformatic analysis

S634.3

A

1000-2324(2021)02-0174-08

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.003

2021-3-17

2021-04-01

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才引進(jìn)啟動經(jīng)費

陳雨(2000-),男,本科生,專業(yè)方向:園藝蔬菜學(xué). E-mail:Chen_Y66@163.com

鄧九州(2000-),男,本科生,專業(yè)方向:園藝蔬菜學(xué). E-mail:DengJZ99@163.com

Author for correspondence. E-mail:jbhuang2018@outlook.com