蛋白激酶PpMAPK3與PpDAM6互作調(diào)控桃花芽休眠進(jìn)程研究

許琛,李森,張宇正,蓋瑜,張新昊,李玲*,陳修德*

蛋白激酶PpMAPK3與PpDAM6互作調(diào)控桃花芽休眠進(jìn)程研究

許琛1,2,李森1,2,張宇正1,2,蓋瑜1,2,張新昊1,2,李玲1,2*,陳修德1,2*

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院,作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271018 山東省果樹協(xié)同創(chuàng)新中心, 山東 泰安 271018

為了探究PpMAPK3在桃花芽休眠過程中起到的作用，桃花芽休眠調(diào)控通路，我們以‘中油5號(hào)’桃一年生枝條為試材，對(duì)桃花芽休眠階段進(jìn)行劃分，通過熒光定量分析、酵母雙雜交篩庫、雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)以及亞細(xì)胞定位對(duì)PpMAPK3在桃花芽休眠過程中的作用進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）桃花芽的休眠過程可以劃分為內(nèi)休眠階段、休眠轉(zhuǎn)化階段和生態(tài)休眠階段3個(gè)階段，花芽萌發(fā)率與低溫積累量密切相關(guān)；（2）的表達(dá)量在休眠轉(zhuǎn)化階段隨著花芽萌發(fā)率的增加而增加，并在整個(gè)休眠轉(zhuǎn)化階段保持較高的表達(dá)量，隨后在生態(tài)休眠階段逐漸降低；（3）PpMAPK3主要定位于細(xì)胞核中，酵母雙雜交試驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明PpMAPK3與PpDAM6存在蛋白水平上的互作關(guān)系。

蛋白激酶; 桃; 芽休眠

芽休眠是多年生落葉果樹躲避溫帶和寒帶地區(qū)冬季不利氣候條件的重要生理機(jī)制，是受多種內(nèi)部及外部因素調(diào)控的復(fù)雜過程[1,2]。冬季有效的低溫積累是溫帶落葉果樹的花芽在春季正常萌發(fā)必要的先決條件[3]。對(duì)于需要休眠的桃（）來說，不同的桃品種需要低溫積累量不同[4]。近年來，隨著設(shè)施桃栽培技術(shù)的不斷發(fā)展，由于對(duì)桃休眠知識(shí)的缺乏而引起的設(shè)施桃花芽萌發(fā)不齊等問題日漸嚴(yán)重，因此充分了解桃花芽休眠過程中的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)設(shè)施桃生產(chǎn)至關(guān)重要。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的信號(hào)酶，在細(xì)胞分裂、發(fā)育、代謝和多種應(yīng)激響應(yīng)等生命活動(dòng)中起著重要作用[5,6]。MAPK家族在所有真核生物中進(jìn)化都十分保守，可以劃分為三類，形成三級(jí)MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)，其中包括：促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶（MAPKK）以及促分裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶（MAPKKK）。這些激酶通過一級(jí)一級(jí)磷酸化的形式發(fā)揮信號(hào)放大的作用，最終傳遞給其下游靶蛋白[7]。然而，在某些情況下，MAPK可以通過自身磷酸化的方式獨(dú)立于MAPKKK和MAPKK發(fā)揮功能[8-10]。根據(jù)動(dòng)植物中MAPKs數(shù)量的比較可知，植物中MAPKs的數(shù)量明顯高于動(dòng)物。這可能是由于植物無法通過移動(dòng)來避免不利條件，因此需要相對(duì)大量的MAPK來幫助植物適應(yīng)各種環(huán)境脅迫因素[11]。在擬南芥中，MAPK3參與了抗凍性，病原體響應(yīng)性和花藥發(fā)育等過程的調(diào)控[12-14]。然而，桃PpMAPK3 (Prupe.6G091700)的功能仍然知之甚少。本試驗(yàn)通過酵母雙雜交篩庫、亞細(xì)胞定位等方法對(duì)PpMAPK3調(diào)控通路進(jìn)行初步分析，為深入研究該基因在桃花芽休眠過程的作用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018-2019年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程試驗(yàn)站、設(shè)施果樹實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。所用的植物試材為8年生油桃（var.）‘中油5號(hào)’，樹體長(zhǎng)勢(shì)狀況一致且管理良好。

1.2 試驗(yàn)方法

1.1.1 桃花芽休眠階段界定于2018年10月15日起至次年1月30日取25枝一年生枝條置于溫度25 °C，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1，晝/夜14 h/10 h的培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)花芽萌發(fā)情況對(duì)桃花芽休眠階段進(jìn)行劃分。

1.1.2 RNA提取與熒光定量分析取0.5 g花芽組織用植物總RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit）提取RNA，以提取后的RNA為模板使用預(yù)混液兩步法RT-qPCR首選試劑(HiScript Q RT SuperMix for qPCR）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用SYBR premix Ex Taq進(jìn)行定量PCR分析，以為內(nèi)參基因，使用2?ΔΔCT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.1.3基因克隆使用2×Phanta Max Master Mix（諾唯贊）以桃花芽cDNA為模板克隆PpMAPK3全長(zhǎng)開放閱讀框。

1.1.4 酵母雙雜交試驗(yàn)使用Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng)（Clontech）進(jìn)行酵母雙雜交（Y2H）分析。

1.1.5 PpMAPK3亞細(xì)胞定位用攜帶GFP融合蛋白的載體（PpMAPK3-GFP以及對(duì)照GFP構(gòu)建體）轉(zhuǎn)染洋蔥表皮細(xì)胞。使用ZEN lite軟件（Zeiss）定量GFP熒光信號(hào)。

1.1.6 雙分子熒光互補(bǔ)分析在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)共表達(dá)含有PpMAPK3-CYFP和PpDAM6-NYFP的融合載體，以空載體為對(duì)照，使用ZEN lite軟件（Zeiss）鑒定YFP熒光信號(hào)。

1.1.7 數(shù)據(jù)分析方差分析采用SPSS18.0軟件Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃花芽休眠階段鑒定

我們從2018年10月15日至次年1月30日記錄每天溫度低于7.2 °C的小時(shí)數(shù)（表1），并根據(jù)低溫積累量和一年生枝條的花芽萌發(fā)率對(duì)‘中油5號(hào)’桃花芽休眠階段進(jìn)行劃分，結(jié)果如圖1所示，2018年10月15日到12月15日此階段花芽萌發(fā)率低于50%，我們將其定義為內(nèi)休眠階段；11月15日花芽開始萌發(fā)到12月15日花芽萌發(fā)率達(dá)到50%，我們將其定義為休眠轉(zhuǎn)化階段；2018年12月15日到次年1月30日此階段花芽萌發(fā)率超過50%，我們將其定義為生態(tài)休眠階段。

表 1 2018~2019年低溫積累量

圖 1 桃花芽休眠階段鑒定

2.2 PpMAPK3熒光定量分析

我們對(duì)休眠過程中桃花芽?jī)?nèi)進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果如圖2所示，在內(nèi)休眠階段前期維持較低的表達(dá)量，當(dāng)?shù)竭_(dá)休眠轉(zhuǎn)化階段時(shí)，的表達(dá)量顯著上調(diào)，并在整個(gè)休眠轉(zhuǎn)化階段維持較高的表達(dá)水平，當(dāng)進(jìn)入生態(tài)休眠階段時(shí)，的表達(dá)量開始逐漸下調(diào)，由此可以說明參與調(diào)控桃花芽休眠解除進(jìn)程。

圖 2 休眠過程中花芽PpMAPK3熒光定量分析

2.3 PpMAPK3基因克隆

我們以花芽中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板對(duì)進(jìn)行克隆，克隆得到了CDS序列全長(zhǎng)（圖3）。對(duì)克隆得到的基因測(cè)序得出克隆產(chǎn)物與CDS序列一致，全長(zhǎng)為1113bp。

圖 3 PpMAPK3基因克隆

2.4 PpMAPK3自激活鑒定

為了篩選PpMAPK3的互作蛋白，我們對(duì)PpMAPK3的自激活活性進(jìn)行了鑒定，由圖4可知，含有重組質(zhì)粒的酵母在SD/-T with X-α-Gal培養(yǎng)基上變藍(lán)，說明PpMAPK3蛋白有自激活活性，在SD/-T with X-α-Gal、200 ng/mL AbA的缺陷培養(yǎng)基酵母不生長(zhǎng)，這說明200 ng/mL AbA能夠抑制PpMAPK3蛋白的自激活活性，可以進(jìn)行下一步酵母雙雜交篩庫實(shí)驗(yàn)。

圖 4 PpMAPK3自激活鑒定

2.5 PpMAPK3亞細(xì)胞定位

為了檢測(cè)PpMAPK3的亞細(xì)胞定位，我們把含有GFP熒光蛋白的融合質(zhì)粒PpMAPK3-GFP在洋蔥上表皮細(xì)胞中表達(dá)。由圖5可知，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)洋蔥上表皮細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)，綠色螢光主要定位在PpMAPK3-GFP轉(zhuǎn)化的洋蔥上表皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)照處理的空GFP侵染的洋蔥上表皮細(xì)胞綠色螢光在細(xì)胞內(nèi)均有分布。這說明PpMAPK3主要定位在細(xì)胞核內(nèi)。

圖 5 PpMAPK3亞細(xì)胞定位（比例尺=20 μm）

2.6 PpMAPK3互作蛋白篩選

以含有CDS序列全長(zhǎng)的pGBKT7融合質(zhì)粒作為誘餌載體進(jìn)行酵母雙雜交篩庫。我們篩選出7個(gè)可能存在互作的蛋白（表2），對(duì)這些蛋白功能進(jìn)行分析和篩選，最后我們篩選出一個(gè)MADS-BOX蛋白（PpDAM6）與休眠最為相關(guān)，我們將PpDAM6作為興趣蛋白進(jìn)行進(jìn)一步互作驗(yàn)證。

表 2 PpMAPK3酵母雙雜交篩庫結(jié)果

2.7 PpMAPK3和PpDAM6酵母雙雜交驗(yàn)證

為了驗(yàn)證PpMAPK3是否是PpDAM6的互作蛋白，我們進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，以BD-PpMAPK3作為誘餌載體，AD-PpDAM6作為目標(biāo)載體，融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。由圖6可知，BD-PpMAPK3加空AD能夠在SD/-T-L缺陷培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，在SD/-T-L-A-H with 200 ng/mL AbA的缺陷培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；BD-PpMAPK3加AD-PpDAM6能夠在SD/-T-L缺陷培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，且BD-PpMAPK3加AD-PpDAM6也可以在SD/-T-L-A-H with 200 ng/mL AbA的缺陷培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。這說明PpMAPK3與PpDAM6在酵母內(nèi)蛋白互作。

圖 6 PpMAPK3與PpDAM6在酵母內(nèi)互作

2.8 PpMAPK3和PpDAM6雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確認(rèn)PpMAPK3與PpDAM6之間的互作關(guān)系，我們進(jìn)行了雙分子熒光（BiFC）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)在洋蔥上表皮細(xì)胞中共表達(dá)PpMAPK3-CYFP+PpDAM6-NYFP時(shí)，能夠在514 nm光源下觀測(cè)到黃色螢光，而當(dāng)在洋蔥上表皮細(xì)胞中共表達(dá)PpMAPK3-CYFP+NYFP、CYFP+PpDAM6-NYFP時(shí)，使用激光共聚焦顯微鏡在514 nm光源下不能觀測(cè)到黃色螢光。這說明在洋蔥上表皮細(xì)胞中PpMAPK3能夠和PpDAM6互作。

圖 7 PpMAPK3與PpDAM6雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）驗(yàn)證（比例尺=50 μm）

3 討論

休眠是典型的落葉果樹的重要生態(tài)以及農(nóng)藝性狀，對(duì)于溫帶和部分寒冷地區(qū)的落葉果樹來說，芽?jī)?nèi)休眠是果樹躲避不利氣候條件的重要過程[3]。需要休眠的落葉果樹需要經(jīng)歷一定時(shí)間的芽休眠才能完成芽?jī)?nèi)部的各種生理生化轉(zhuǎn)化，因此休眠不僅是躲避不良的外部氣候條件，還是花芽萌發(fā)的必要條件[15-17]。我們根據(jù)低溫積累量與花芽萌發(fā)率對(duì)‘中油5號(hào)’花芽的休眠階段進(jìn)行了劃分，包括三個(gè)階段：內(nèi)休眠階段、休眠轉(zhuǎn)化階段和生態(tài)休眠階段。

PpMAPK3是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，能夠參與植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)[10]。在擬南芥中MAPK3已被證明是植物先天免疫系統(tǒng)的基本組成部分[12]，且在促進(jìn)被膜中的細(xì)胞分裂中也起著重要作用，特別是在胚珠發(fā)育過程中[11]。酵母雙雜交篩庫試驗(yàn)篩選出7個(gè)可能的互作蛋白，這些蛋白參與桃生長(zhǎng)發(fā)育等各個(gè)方面，這說明PpMAPK3能夠廣泛參與調(diào)控桃的各項(xiàng)生命活動(dòng)。熒光定量結(jié)果表明，在休眠轉(zhuǎn)化階段的表達(dá)量隨著花芽萌發(fā)率的增加而增加，并在整個(gè)休眠轉(zhuǎn)化階段保持較高的表達(dá)量，在生態(tài)休眠階段逐漸降低。說明PpMAPK3能夠參與調(diào)控桃花芽休眠進(jìn)程，是桃花芽休眠解除的正調(diào)控因子。

基因是屬于MADS-box家族中的一類轉(zhuǎn)錄因子[18]。對(duì)桃樹進(jìn)行延長(zhǎng)低溫條件處理和休眠解除劑處理，發(fā)現(xiàn)和與桃芽的內(nèi)休眠過程最相關(guān)[1,19]。將因轉(zhuǎn)入楊樹中驗(yàn)證了其對(duì)芽生長(zhǎng)有抑制功能，且的表達(dá)受短時(shí)低溫誘導(dǎo)，是休眠的負(fù)調(diào)控因子[20,21]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在酵母中PpMAPK3可以與PpDAM6蛋白互作，雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它們的互作關(guān)系。PpDAM6是轉(zhuǎn)錄因子，前人研究發(fā)現(xiàn)PpDAM6主要定位于細(xì)胞核中，我們對(duì)PpMAPK3進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，PpMAPK3同樣定位于細(xì)胞核中，這說明PpMAPK3能夠在細(xì)胞核中與PpDAM6互作。

4 結(jié)論

在桃花芽休眠過程中，PpMAPK3通過與PpDAM6互作參與桃花芽休眠解除進(jìn)程，PpMAPK3是花芽休眠解除的正調(diào)控因子。推測(cè)PpMAPK3可能是通過磷酸化PpDAM6相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)來調(diào)控桃花芽休眠解除，但仍待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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Study on the Process Regulating Peach Flower Bud Dormancy by Mitogen-activated Protein Kinases PpMAPK3 and PpDAM6

XU Chen1,2, LI Sen1,2, ZHANG Yu-zheng1,2, GAI Yu1,2, ZHANG Xin-hao1,2,LI Ling1,2*, CHEN Xiu-de1,2*

1.271018,2.271018,

In order to explore the role of PpMAPK3 in the dormancy process of peach flower buds and the regulation pathway of peach flower bud dormancy, we use the annual peach shoots of 'Zhongyou 5' as the test material to classify the dormancy stages of peach flower buds through fluorescence quantitative analysis and yeast two-hybrid screening library, bimolecular fluorescence complementation test and subcellular localization have been carried out to study the role of PpMAPK3 in the process of peach flower bud dormancy. The test results show that: (1) The dormancy process of peach flower buds can be divided into three stages: endodormancy stage, transition stage and ecodormancy stage. The germination rate of flower buds is closely related to the accumulation of low temperature; (2) The expression ofincreases with the increase of flower bud germination rate in the transition stage, and maintains a high expression level throughout the transition stage, and then gradually decreases in the ecdormancy stage; (3) PpMAPK3 is mainly located in the nucleus, yeast two-hybrid assay and two-molecule fluorescence complementation experiments show that PpMAPK3 interacts with PpDAM6 at the protein level.

Protein kinases;; bud dormancy

S662.1

A

1000-2324(2021)02-0168-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.002

2020-11-25

2021-01-11

山東省自然基金面上項(xiàng)目(ZR2018MC023);山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2020LZGC007);山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目資助

許琛(1996-),男,碩士研究生,主要從事果樹分子生物學(xué)及生理研究. E-mail:xuchensdau@163.com

Author for correspondence. E-mail:liling217@sdau.edu.cn; chenxiude@163.com