植物花青素合成與調(diào)控研究進展

劉愷媛，王茂良，辛海波，張 華，叢日晨，黃大莊

（1北京市園林科學研究院，綠化植物育種北京市重點實驗室，北京 100102；2河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，河北保定 071000）

0 引言

花青素是糖基化的多酚類化合物，又稱花青素苷，是植物類黃酮化合物中的重要一類?；ㄇ嗨貜V泛存在于植物葉、花和果實等器官中，是植物呈現(xiàn)五顏六色的基礎?；ㄇ嗨氐幕窘Y(jié)構(gòu)是3,5,7-羥基-2-苯基苯并吡喃，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可分為6大類：天竺葵素(Pelargonidin)、矢車菊素(Cyanidin)、芍藥花素(Peonidin)、飛燕草素(Delphinidin)、矮牽牛素(Petunidin)和錦葵素(Malyidin)[1]。以上6類花青素的羥基與不同的糖類結(jié)合進而產(chǎn)生不同種類的花色苷。目前自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)650多種花色苷，約92%的花色苷由這6類花青素衍生而來[2]。不同種類的花色苷所呈現(xiàn)的顏色也略有差異，天竺葵素及其衍生物呈紅色或橙色，矢車菊素及其衍生物主要呈磚紅或洋紫色，飛燕草素及其衍生物呈藍色或者紫色[3-4]?；ㄇ嗨氐念伾€與植物液泡的pH值有關，液泡pH值為1.0～2.0時，花青苷表現(xiàn)為紅色；液泡pH值為6.0～6.5時，花青苷表現(xiàn)為藍色；液泡pH＞7.0時，花青苷表現(xiàn)為淺黃色[5]。

對植物來說，花青素具有多種多樣的生物學功能?；ㄇ嗨卦谥参锲鞴僦蟹e累，使植物呈現(xiàn)多種顏色賦予植物觀賞價值，同時鮮艷的色彩為植物吸引昆蟲授粉和傳播種子，對植物繁殖具有重要意義[6-7]?；ㄇ嗨啬芴岣咧参锟剐?，幫助植物抵御多種生物與非生物脅迫?；ㄇ嗨乜梢晕斩嘤嗟目梢姽夂蛶椭参锏挚棺贤饩€，并清除氧自由基保護植物不受強光灼傷，是植物天然的光保護劑[8]。對人類來說，花青素具有豐富的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健功能，對人類身體健康有著極大益處?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸芰?，在防癌變、抗衰老、預防心血管疾病以及降血脂等方面有重要醫(yī)療價值[9]。食用花青素還能修復記憶損傷，緩解近視[10]，因此富含花青素的食品藍莓、紫薯和黑枸杞等越來越受到人們重視。

基于花青素的應用前景和研究潛力，剖析花青素的生物合成途徑具有經(jīng)濟學和科學的重要意義。本研究從花青素生物合成的內(nèi)外影響因子入手，重點綜述了調(diào)控觀賞植物和園藝作物花青素合成的環(huán)境因子、結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。旨在通過對前人研究成果的總結(jié)，以期為利用分子生物學開展花青素代謝工程的研究提供參考。

1 環(huán)境因子對花青素的生物合成及植物呈色的調(diào)控

研究表明，植物通過感知外界環(huán)境因子的變化，調(diào)控體內(nèi)花青素合成通路中結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達，從而合成積累花青素，并確定花青素的種類[11]?；ㄇ嗨睾铣珊筠D(zhuǎn)運至液泡儲存，環(huán)境因子會影響花青素的穩(wěn)定性，對花青素苷的降解產(chǎn)生加速或減速作用。植物所處的環(huán)境不同，其葉色和花色也會產(chǎn)生一定程度的變化，更加說明植物顏色受環(huán)境因子調(diào)控。影響植物體內(nèi)花青素苷含量變化的環(huán)境因子主要有光、溫度、植物激素以及糖類等[12]。

1.1 光

光通過激活花青素合成通路中的相關基因，促使植物體內(nèi)合成并積累花青素[13]。研究表明，植物在強光條件下更易形成花青素。高光強可以同時誘發(fā)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達，而弱光或者黑暗會對結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達產(chǎn)生抑制，從而減少花青素的合成，使植物呈現(xiàn)淺色甚至白色[14]。例如將茄子進行不透光的套袋處理發(fā)現(xiàn)茄子最終表現(xiàn)為白色[15]。李虹等[16]對月季的研究結(jié)果表明，光照是影響月季變色的關鍵因素，遮光處理阻礙了月季花瓣中花青素的合成，抑制了CHS和DFR的表達,最終導致月季花冠不能著色。

高等植物通過不同的光受體接收和傳遞信號來實現(xiàn)對光的應答反應，從而完成自身的生長發(fā)育[17]。高等植物主要有5類光受體，它們分別是：光敏色素、隱花色素、向光素、UVR8和ZTLs家族[18]。感應光信號的順式作用元件在結(jié)構(gòu)基因的啟動子序列中，轉(zhuǎn)錄因子在感受到光信號后，與順式作用元件結(jié)合，進一步調(diào)控結(jié)構(gòu)基因[12]。葉片是大多數(shù)植物感受光信號的重要器官。在開花植物中，葉片感受光信號并將光信號傳遞到花冠中，從而打開花青素合成通路，最終使花冠呈現(xiàn)出特定顏色[19]。此外，在對非洲菊的研究中發(fā)現(xiàn)，遮光處理花序后，舌狀花內(nèi)色素含量減少，基因CHS和DFR的表達受到抑制，說明部分植物的花冠在植物感受光信號的過程中也起到重要作用[20]。

在各種光照因素中，光質(zhì)對花青素苷的合成起關鍵作用[12]。不同的光質(zhì)對花青素合成影響不同，其中UV-A和UV-B通過加強花青素合成通路中關鍵基因的表達來積累花青素，是花青素合成的重要條件[21-22]。在擬南芥中，UV-A和UV-B可以上調(diào)CHS的表達[23]；在蕪菁中，UV-A上調(diào)PAL、CHS、F3H、ANS、DFR和GST等一系列基因的表達進而調(diào)控花青素的合成[24]；在萵苣葉片，UV-B上調(diào)CHS、F3H和DFR等基因的表達，促進花青素合成[25]。李夢靈[26]通過光質(zhì)對菊花呈色的研究發(fā)現(xiàn)，藍光處理使基因CHS、F3H、ANS和3GT的表達量上升，而紅光處理使基因CHS、F3H和轉(zhuǎn)錄因子MYB4的表達量下降。

1.2 溫度

溫度是影響植物體內(nèi)花青素苷合成的另一重要因素。低溫可以增強花青素合成通路中CHS、CHI和DFR等關鍵基因的表達，促進花青素在植物體內(nèi)的積累；高溫則抑制相關基因的合成，降低花青素的含量[27]。高溫可以使李子果實中花青素苷降解，導致花青素含量降低[28]。溫度不僅調(diào)控花青素合成通路中的相關基因，還影響花青素的穩(wěn)定性。高溫情況下，花青素合成速率減慢，降解速率加快。例如，當溫度大于30℃時，菊花較難著色或者出現(xiàn)褪色情況[29]。此外，研究發(fā)現(xiàn)溫度主要通過影響酶的活性來影響花青素的穩(wěn)定性[30]，高溫下，花青素合成通路中相關酶的活性降低，因此花青素含量會降低。

1.3 激素

對植物施加外源激素可以促進或抑制植物花青素合成通路中部分基因的表達，植物內(nèi)源激素通過影響調(diào)節(jié)基因來控制花青素的合成[31]。生長素在植物愈傷組織花青素合成過程中起重要作用。將紅肉蘋果使用濃度大于0.15 mg/L的2,4-D和濃度大于1.5 mg/L的NAA處理后，愈傷組織中的花青素積累受到明顯抑制[32]。而經(jīng)IAA處理的擬南芥幼苗，其花青素合成通路上的結(jié)構(gòu)基因CHS、CHI和F3H以及調(diào)節(jié)基因MYB12、TTG1和PAP1的表達量有所上升，植株體內(nèi)花青素的含量提高[33]。細胞分裂素對植物體內(nèi)花青素的積累也具有一定影響，使用6-BA處理荔枝可以抑制荔枝果皮花青素的積累[34]。外源赤霉素處理矮牽牛，可以誘導花冠CHS基因的表達，促進花青素苷的積累[35]。擬南芥ga1-5突變體的內(nèi)源赤霉素含量較低而激活了花青素生物合成的部分基因，使其體內(nèi)花青素含量增加[36]。乙烯在花青素合成途徑中也發(fā)揮重要作用。使用乙烯處理葡萄果實后，結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H和UFGT的表達量顯著升高，花青素含量也隨之升高[37]。此外乙烯對花青素合成的抑制作用也是顯著的，乙烯可以通過激活負轉(zhuǎn)錄因子MYBL2實現(xiàn)抑制作用[38]，牡丹切花要使用乙烯處理，再次證實了乙烯對結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的抑制[39]。

1.4 糖類

糖類對花青素的合成調(diào)控主要有兩方面原因:其一是糖參與花青素的合成，花青苷元經(jīng)過糖基化后形成穩(wěn)定的花青素；其二是花青素苷合成所需前體經(jīng)由莽草酸產(chǎn)生，而莽草酸的形成依賴于旺盛的戊糖呼吸，充足的糖是戊糖呼吸的必要條件[40]。Lotkowska[41]等證實高濃度的糖分可以促進葡萄果實中的花青素積累。研究發(fā)現(xiàn)蔗糖不僅可以調(diào)控花青素合成通路中的結(jié)構(gòu)基因，還能特異性地調(diào)控部分調(diào)節(jié)基因。使用外源蔗糖、果糖和葡萄糖處理的擬南芥，部分結(jié)構(gòu)基因CHS、CHI、F3H和DFR以及調(diào)節(jié)基因PAP1的表達量顯著上升[42]。

2 植物花青素的合成通路

2.1 花青素的合成途徑

花青素合成通路是類黃酮合成通路中的一個重要分支，在高等植物中較為保守，其過程涉及多個復雜的酶促反應（圖1所示），主要分為3個階段：花青素基本骨架的形成、花青素前體的形成以及將花青素前體修飾成各種不同花青素苷[22]?；ㄇ嗨卦诩毎|(zhì)表面合成，后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜經(jīng)過不同的甲基化、糖基化、羥基化和酰基化等修飾后形成了穩(wěn)定的花青素苷[43]。最后花青素苷在轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)運囊泡的協(xié)助下進入液泡中匯集并積累[44]?；ㄇ嗨剀盏姆e累和轉(zhuǎn)運對植物的呈色具有一定影響，目前已報道4類蛋白可能參與花青素苷向液泡的轉(zhuǎn)運，分別是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)、多藥耐藥抗性相關蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)、多藥和有毒化合物排出家族(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)和 BTL-homologue[40]。

圖1 花青素的合成通路

第一階段是許多植物次生代謝的共有途徑，主要由苯丙氨酸(phenylalanine)經(jīng)過三次酶促反應合成4-香豆酰 A(4-coumaroyl-CoA)。苯丙氨酸(phenylalanine)由苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)催化形成肉桂酸(cinnamic acid)，肉桂酸羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)將肉桂酸(cinnamic acid)催化成香豆酸(p-coumaric acid)，最后香豆酸(p-coumaric acid)在4-香豆酰CoA連接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)的作用下合成4-香豆酰A(4-coumaroyl-CoA)。

第二階段是4-香豆酰A合成二氫黃酮醇(dihydrokaempferol)的過程。4-香豆酰A(4-coumaroyl-CoA)和丙二酰A(malonyl-CoA)在查爾酶合成酶(chalcone synthase,CHS)催化下形成通路中第一個類黃酮物質(zhì)查爾酮(Chalcone)，為后續(xù)化合物的合成提供了基本的碳骨架。后在查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)和黃烷酮-3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)的作用下合成二氫黃酮醇(dihydrokaempferol)。

第三階段即各種不同種類花青苷元的形成。二氫黃酮醇(dihydrokaempferol)合成之后產(chǎn)生三條支路，類黃酮3-羥化酶(flavonol 3'hydroxylase,F3'H)和類黃酮3,5-羥化酶(flavonol 3',5'hydroxylase,F3',5'H)以二氫黃酮醇(dihydrokaempferol)為共同底物，分別催化生成雙氫槲皮素(dihydroquercetin)和二氫楊梅黃酮(dihydromyricetin)，之后處于三條支路上的二氫黃酮醇(dihydrokaempferol)、二氫楊梅黃酮(dihydro.myricetin)和雙氫槲皮素(dihydroquercetin)在二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)的催化下合成無色花青素，最后在花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的氧化脫水作用下，分別生成顯色但不穩(wěn)定的天竺葵色素(pelargonidin)、矢車菊色素(cyanidin)和翠雀色素(delphinidin)[45-47]。

2.2 花青素生物合成通路中的主要結(jié)構(gòu)基因

花青素合成通路中的相關酶由結(jié)構(gòu)基因編碼而成，這些結(jié)構(gòu)基因分為早期生物合成基因(EBG)：CHS、CHI、F3H和F3′H；晚期生物合成基因(LBG)：F3′,5′H、DFR、ANS和UFGT等[48]。這些結(jié)構(gòu)基因的表達受環(huán)境因子和轉(zhuǎn)錄因子的共同控制，轉(zhuǎn)錄因子主要包括MYB、bHLH和WD40三大類[7]。

2.2.1 查爾酮合成酶基因 查爾酮合成酶基因CHS是類黃酮合成通路中的第一個關鍵基因，CHS催化香豆酰輔酶A(4-coumaroyl-CoA)和丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)形成類黃酮合成通路中的第一個有色物質(zhì)查爾酮(Chalcone)，并為后續(xù)類黃酮物質(zhì)的合成提供碳骨架。研究表明，CHS是一個超家族基因，目前已從多種植物中鑒定并克隆，如擬南芥、玉米、大豆、矮牽牛和金魚草。柑橘中有3個CHS基因，分別是CitCHS1、CitCHS2和CitCHS3。CitCHS2和CitCHS3的表達量與柑橘根、莖和子葉中的類黃酮含量呈正相關，CitCHS1可以加速葉片中類黃酮的積累[49]。CHS處于花青素合成的上游關鍵位置，因此使CHS基因沉默或使其過量表達對改變花色具有重要意義，例如矮牽牛中，CHS表達量減少，花色由紫色變?yōu)榘咨?。番茄果實成熟的過程中CHS的活性顯著增加，利用VIGS(Virus induced gene silencing)技術下調(diào)SICHS的表達量，果皮中類黃酮含量減少的同時顏色也會變淡[50]。

2.2.2 查爾酮異構(gòu)酶基因 查爾酮異構(gòu)酶基因CHI催化查爾酮(Chalcone)形成柚皮素，是類黃酮化合物生物合成的上游關鍵基因之一，其表達量對植物體內(nèi)類黃酮含量具有重要影響。Mehdy[51]最早從法國豌豆中分離出CHI，后陸續(xù)從矮牽牛等植物中克隆出來。CHI是多基因家族，其表達和積累具有時間和空間特異性。例如CHI-A和CHI-B，二者的表達具有組織特異性，CHI-A在成熟的花藥中表達，CHI-B主要在未成熟的花藥中表達[52]。在葡萄果實中，CHI主要分布在外果皮的細胞質(zhì)、細胞核和葉綠體，中果皮維管束細胞的細胞質(zhì)中；在葡萄根、莖、葉中，CHI分布在細胞質(zhì)、細胞壁和細胞核中[53]。徐靖等[54]檢測了黃、白和紫肉3個品種甘薯的花青素含量，只在紫肉品種中檢測出花青素，經(jīng)過定量PCR結(jié)果顯示，IbCHIL1在紫肉甘薯中大量表達，在黃肉甘薯中微量表達，不在白肉甘薯中表達。杭菊中，CmCHI1和CmCHI3是參與類黃酮合成的主要結(jié)構(gòu)基因，而CmCHI2是輔助基因[55]。

2.2.3 黃烷酮3-羥化酶基因 黃烷酮3-羥化酶基因F3H是花青素代謝途徑上游的又一個關鍵結(jié)構(gòu)基因，該基因催化黃烷酮C3位上添加一個羥基形成二氫黃酮醇。F3H的催化反應依賴Fe2+、氧、2-酮戊二酸等作為輔助因子[56]。目前，F(xiàn)3H在金魚草、擬南芥、玉米和胡蘿卜等多種植物中克隆出來。F3H在植物中的表達具有組織特異性，例如在豆科植物中，F(xiàn)3H在根瘤維管束中表達，在根中不表達；在苜蓿中，該基因在花、根和根瘤中表達，在葉中不表達。F3H對花色差異形成具有一定影響，繡球花中HmF3H基因在不同組織器官中均能表達，但是對比盛花期的紅色品種‘粉黛’和藍色品種‘無盡夏’發(fā)現(xiàn)，HmF3H在‘粉黛’盛花期時表達量較高[57]。馮志熙等[58]對金鳳花IuF3H進行克隆并分析，證實IuF3H參與花青素合成并起到關鍵作用。

2.2.4 二氫黃酮醇還原酶基因 二氫黃酮醇還原酶基因DFR是花青素合成后期的基因，是無色翠雀素、無色天竺葵素以及無色矢車菊素合成的關鍵基因，對植物顯色具有重要作用。Beld等[59]從玉米中克隆出第一個DFR基因，后相繼從金魚草、擬南芥、玫瑰、葡萄和蘋果等植物中克隆出。甘霖鑫等對比丹鳳牡丹的白色期、變色期、褐色期和黑色期，發(fā)現(xiàn)變色期PoDFR的表達量最高。證實DFR表達量與花青素合成密切相關。Zhuang等[60]通過對比紫色蘿卜和綠色蘿卜的代謝組與轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，紫色蘿卜中DFR的表達量上調(diào)導致類黃酮物質(zhì)合成向花青素方向偏移，此外綠色蘿卜中DFR基因產(chǎn)生突變，給綠色蘿卜積累花青素造成障礙。

2.2.5 花青素合成酶基因 花青素合成酶基因ANS將無色花青苷轉(zhuǎn)化為有色花青素，其產(chǎn)物是花青素代謝途徑中的第一個有色化合物，因此其表達對植物花、葉和果實等器官的呈色極為重要。抑制ANS基因的表達或使其活性降低會使植物花色變淡甚至變白。此外，將ANS導入植物中使其超量表達，花青素苷在植物體內(nèi)的積累量會改變，植株的抗氧化能力增強。前人研究發(fā)現(xiàn)2個ANS等位基因變異可以造成洋蔥花青素的缺失[61-62]。ANS基因的表達具有特異性，在桑樹的特定部位葉片尖端和莖生長點能檢測到MaANS的表達。

3 花青素合成通路中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

花青素的合成、轉(zhuǎn)運和積累受到多種轉(zhuǎn)錄因子的特異性和協(xié)同性調(diào)控。目前花青素合成通路中被研究最多也是最重要的三類轉(zhuǎn)錄因子分別是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族、bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族和WDR轉(zhuǎn)錄因子家族。三類轉(zhuǎn)錄因子可以單獨調(diào)控結(jié)構(gòu)基因或者MYB、bHLH和WDR相互結(jié)合組成MBW復合體共同調(diào)控結(jié)構(gòu)基因[45,63]。這些轉(zhuǎn)錄因子通過識別結(jié)構(gòu)基因啟動子特定區(qū)域，并與結(jié)構(gòu)基因啟動子結(jié)合，從而達到促進或抑制花青素生物合成的作用[7,64-65]。研究發(fā)現(xiàn)，單子葉植物和雙子葉植物的調(diào)控模式也有差異[66]，單子葉植物花青素合成調(diào)控由MBW復合物完成。雙子葉植物例如擬南芥中，R2R3-MYB與bHLH和WDR構(gòu)成MBW復合物激活晚期生物合成基因DFR、ANS和UFGT的表達最終導致花青素在植物體內(nèi)的積累[67]，而早期生物合成基因主要由R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子MYB11、MYB12、MYB111以及MYB75/PAP1進行調(diào)控[68]。此外，還報道了一些其他轉(zhuǎn)錄因子比如COP1、JAZ、NAC、SPL和WRKY都可以和MBW復合物互相作用調(diào)控花青素和合成[69]。

3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子

MYB是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，通過分析被子植物6個不同亞群的MYB蛋白發(fā)現(xiàn)，盡管它們的表達強度和作用強度不同，但是都保留著激活花青素生物合成的能力。MYB轉(zhuǎn)錄因子是一類DNA結(jié)合蛋白，具有高度保守的DNA結(jié)合域—MYB結(jié)構(gòu)域，由51～52個氨基酸構(gòu)成。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域達到個數(shù)可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4類：R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[45]。Cone等[70]從玉米中分離出調(diào)控胚乳糊粉層中花青素合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmC1，是植物體內(nèi)研究報道的第一個調(diào)控花青素生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子。R3-MYB和R2R3-MYB兩類轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)蛋白廣泛參與苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控，在植物中發(fā)揮巨大作用。擬南芥花青素合成過程涉及6個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞群，分別是：AtMYB75(PAP1，At1g56650)、AtMYB90(PAP2、At1g66390)、AtMYB113(At1g66370)和AtMYB114(At1g66380)[71-72]。其中PAP1被證實是擬南芥花青素合成通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子[73]，過量表達PAP1使得轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉和花中積累了大量花青素。PAP2、MYB113和MYB114在特定的環(huán)境或者植物某一發(fā)展階段也可以激活DFR和ANS等結(jié)構(gòu)基因的表達，但是激活程度不如PAP1[71]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與重要花卉和園藝作物中花青素的生物合成。在蘋果中分離出多個與花青素合成有關的MYB轉(zhuǎn)錄因子，包括與果皮花青素合成有關的MdMYBA和MdMYB1，以及與葉和果肉花青素合成有關的MdMYB10和MdMYB110a等[74]。MdMYB10及其同源基因廣泛存在與薔薇科植物的果實中并參與果實花青素的合成，比如在櫻桃、桃子、梨子、梨、覆盆子、草莓中均鑒定出MdMYB10[75]。Ravaglia等[76]從桃中分離出PpMYB10。Lin-Wang等從草莓中分離出FaMYB10，過量表達FaMYB10使草莓中的花青素含量增加70%。Jin等[77]從甜櫻桃中克隆出PavMYB10。對葡萄的研究表明，至少有3個MYB類轉(zhuǎn)錄因子VvMYBA1、VvMYBA2和VvMYB5b參與漿果成熟過程中花青素的積累，并且對UFGT、GST和OMT等結(jié)構(gòu)基因進行調(diào)控。血橙體內(nèi)的花青素主要在內(nèi)果皮中積累而外果皮缺少花青素，主要因為R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子RUBY無法在果肉中表達[78]。SmMYB1在茄子的花青素合成通路中起到關鍵作用，該基因的表達上調(diào)使得花青素在葉片、花瓣、雄蕊以及其他內(nèi)部組織中大量積累[79]。

在矮牽牛中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子AN1、JAF13、PhMYB27和AN2先后被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控花青素的合成[80]。對月季‘紅勝利’中與花青素合成有關的轉(zhuǎn)錄因子MYB4-1和MYB6-1檢測可知，二者在花瓣中高水平表達，而葉片和花藥中表達量較低。通過分析不同顏色的月季花瓣發(fā)現(xiàn)，花青素含量與兩轉(zhuǎn)錄因子的表達量呈正相關，說明MYB4-1和MYB6-1在月季花青素苷合成和花瓣著色的過程中發(fā)揮重要作用[81]。王雪霽[82]分析了小蘭嶼蝴蝶蘭花、葉、莖、根4種組織中的PeMYB71表達量，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子在花中的表達量最高，花器官中的花青素含量也最多。郭亞飛等[83]研究發(fā)現(xiàn)CsMYB123正調(diào)控茶樹花青素的生物合成。毛白楊中分離出R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子MYB6，并證實該因子主要在幼葉中表達。MYB6過表達使轉(zhuǎn)基因毛白楊中的花青素和原花青素積累量顯著增加[84]。

相比MYB轉(zhuǎn)錄因子，MBW復合體對靶細胞的激活能力更強，可以更加有效的對花青素合成通路中合成、修飾和轉(zhuǎn)運等相關基因進行調(diào)控[40]。MBW復合體主要依靠其中的MYB和bHLH對靶基因進行調(diào)控，而WD40有可能在增強MBW復合體穩(wěn)定性的同時，為二者形成轉(zhuǎn)錄復合體提供平臺[85]。MYB轉(zhuǎn)錄因子被認為是MBW復合體中起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子[86]。在擬南芥中，MYB家族的PAP1和PAP2可以與bHLH家族的TT8以及WD40家族的TTG1結(jié)合，形成復合體激活花青素合成過程中CHS和DFR的表達[87]。茄子中的SmGL3、SmTT8以及SmTTG1形成MBW復合體進而調(diào)控花青素合成[88]。MBW復合蛋白中，按WD40-bHLH-MYB的順序，轉(zhuǎn)錄因子特異性逐漸提高，所涉生物學過程逐漸專一[89]。

R3-MYB和R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅能促進花青素的合成，也能抑制花青素的合成進而減少花青素的積累，正調(diào)控和負調(diào)控相互結(jié)合，維持植物體內(nèi)花青素的平衡。尤其是R2R3-MYB的第四亞族成員大多為轉(zhuǎn)錄抑制因子[90]。研究發(fā)現(xiàn)的第一個具有負調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子是金魚草中的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子AmMYB308，AmMYB308的過量表達可以抑制苯丙烷的代謝[91]。R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子通過阻礙MBW復合物和晚期生物合成基因的聯(lián)系來抑制花青素的合成[92]。

研究報道，MYB4在調(diào)節(jié)擬南芥類黃酮生物合成時起到雙重作用，MYB4與其同源轉(zhuǎn)錄因子MYB7是苯丙烷合成的阻遏物。MYB4、MYB7、MYB32與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子TT8、GL3、EGL3相互作用，干擾MBW復合物的轉(zhuǎn)錄活性[46]（圖2）。此外，MYB4還可以通過抑制ADT6(ArogenateDehydratase6)基因的表達來抑制類黃酮的積累[46]。目前報道的擬南芥中的負轉(zhuǎn)錄因子還有MYBL2、MYB2、SPL9、GL2和CPC。例如MYBL2轉(zhuǎn)錄因子可以與TT8結(jié)合抑制DFR和TT8的表達來抑制植物體內(nèi)花青素的合成[93-94]。Albert等[95]研究發(fā)現(xiàn)，MYB27與AN11互作，結(jié)合bHLH類轉(zhuǎn)錄因子破壞MBW復合蛋白，以此實現(xiàn)MYB27在花青素合成通路中的負調(diào)控功能。由此可見，MYB轉(zhuǎn)錄因子抑制花青素合成的調(diào)控機制大致可分為3類：一是通過破壞MBW復合體的穩(wěn)定性，進而發(fā)揮其抑制功能；二是通過抑制結(jié)構(gòu)基因尤其是DFR基因的表達；三是與其他轉(zhuǎn)錄因子互相作用來抑制正向轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而減少花青素含量[45]。

圖2 MYB4調(diào)控類黃酮合成通路的模型

3.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子

堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basichelix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子是植物第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，約含有50～60個氨基酸殘基。該蛋白結(jié)構(gòu)包含兩個功能不同的區(qū)域：堿性區(qū)域和螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)區(qū)域。堿性區(qū)域在N端為DNA識別區(qū)，HLH區(qū)域在C端形成同源或異源二聚體，因此bHLH在植物的生長發(fā)育、抵抗脅迫和傳導信號等方面以二聚體的形式發(fā)揮重要作用[96]。bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子有Myc、R、Sn和Lc等。在MBW復合物中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性識別并激活靶基因的啟動子[3]。Ludwig等[97]發(fā)現(xiàn)植物中第一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子是玉米R1(RED1)蛋白。

在模式植物擬南芥中bHLH蛋白TT8、GL3、EGL3、MYC1通過和MYB蛋白結(jié)合形成MBW復合體，參與調(diào)控花青素的合成[98-99]。通過對模式植物的還研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子對花青素合成通路的調(diào)控主要體現(xiàn)在兩方面，一是與MYB轉(zhuǎn)錄因子互作；二是對DFR和ANS的調(diào)控，尤其是對DFR的調(diào)控[45]。比如煙草中與花青素合成有關的bHLH蛋白是NtAn1a和NtAn1b，NtAn1a與NtAn2相互作用激活CHS和DFR的表達[100]。過表達擬南芥MYC3和MYC4均能促進植物中的花青素積累。

觀賞植物和園藝作物的bHLH調(diào)控機制與模式植物中基本相同，仍是與MYB轉(zhuǎn)錄因子的互作和對DFR表達量的調(diào)控。例如Espley[101]發(fā)現(xiàn)蘋果中的MdbbHLH3和MdbbHLH33均與MdbMYB10互作，促使果實變紅。荔枝中LcbHLH1、LcbHLH3與LcMYB1協(xié)同作用，調(diào)控荔枝中花青素的合成與積累[102]。CsbHLHs和CsMYBs轉(zhuǎn)錄因子在茶樹中相互作用促進了茶葉中類黃酮的積累[103]。茄科植物中，參與花青素合成調(diào)控的bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要有兩個分支，分別是矮牽牛PhAN1和PhJAF13。茄子和辣椒中，已經(jīng)顯色的果實和未成熟的果實相比，PhAN1的同源基因CabHLH和SmbHLH的表達量明顯較高[104]。Li等[105]通過分析光誘導的茄子花青素合成的分子機理發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SmTT8參與茄子花青素的合成。Zong等[106]證實TsMYC2誘導小麥胚芽鞘中花青素的合成，是培育具有新性狀藍色糊粉層小黑麥的重要基因。獼猴桃的內(nèi)果皮中積累著大量花青素，證實基因ACMYB123和ACBHLH42的協(xié)同作用是使內(nèi)果皮中ACANS的表達上調(diào)的原因[107]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子也能抑制花青素的合成，抑制花青素合成的機制推測為：bHLH負轉(zhuǎn)錄因子通過破壞bHLH-MYB復合體，阻止bHLH-MYB復合體發(fā)揮作用；或不與MYB蛋白結(jié)合，干擾具有活性的bHLHMYB復合體形成。

3.3 WD40轉(zhuǎn)錄因子

WD40轉(zhuǎn)錄因子又稱WDR蛋白，是一類高度保守的蛋白，一般含有4～16個串聯(lián)重復的WD基元序列，每個WD基元由44-60個氨基酸殘基組成。WD40主要功能是促進蛋白相互作用，為MYB和bHLH蛋白形成MBW復合物提供一個穩(wěn)定的平臺。WD40轉(zhuǎn)錄因子家族主要有AN11、TTG1、PFWD40和PAC1。第一個被發(fā)現(xiàn)的WD40蛋白是矮牽牛的AN11（ANTHOCYANIN11）蛋白。目前多種WD40蛋白已從植物中被分離鑒定出來，主要包括玉米PAC1蛋白、擬南芥TTG1蛋白、紫蘇PFWD40蛋白、茄子SmWD40蛋白和辣椒CaWD40蛋白等，它們的轉(zhuǎn)錄水平幾乎不隨結(jié)構(gòu)基因的表達水平和花青素的含量而改變。WD40的表達也具有特異性，馮如[108]在銀杏葉片中發(fā)現(xiàn)3個WD40蛋白，分別是GbWD401、GbWD402和GbWD403，并證實3個蛋白只在莖和葉中表達，在根中不表達。

WD40轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定表達也是花青素穩(wěn)定積累不可或缺的一環(huán)。馬鈴薯中的StAN11基因?qū)儆赪D40轉(zhuǎn)錄因子，該基因過量表達能調(diào)控DFR基因表達，進而加深塊莖表皮顏色。矮牽牛PhAN11的突變導致矮牽牛出現(xiàn)白色花[109]。辣椒中的CaMYBA和CaWD40保持沉默，結(jié)構(gòu)基因的表達和花青素的含量也會對應的下降[110]。小蒼蘭中的WD40類轉(zhuǎn)錄因子FhTTG1的表達與植株內(nèi)花青素和原花青素的積累同步。FhTTG1與MYB和bHLH形成復合體后，能夠高度激活花青素或原花青素生物合成的相關結(jié)構(gòu)基因，這說明FhTTG1作為MBW復合體中的重要一員，調(diào)控小蒼蘭花青素合成[111]。此外，TTG1能與bHLH蛋白互作并轉(zhuǎn)移至細胞核中，TTG1進入細胞核后，能提高MBW復合物的穩(wěn)定性，從而使MBW復合物更易與相關結(jié)構(gòu)基因的啟動子結(jié)合，進而對花青素的生物合成進行調(diào)控。

4 展望

植物體內(nèi)花青素的含量對植物呈色具有重要意義，而花青素的合成與積累同環(huán)境因子、結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因有密不可分的關系。因此，改變環(huán)境因子，激活或抑制結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，誘導關鍵基因突變對修飾花色、調(diào)控葉色、豐富果色，提高園林植物的觀賞價值，改良園藝作物的關鍵性狀具有重要作用。目前，花青素代謝途徑中一些關鍵問題仍未闡明，例如環(huán)境因子、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子之間如何互作，花青苷如何進一步修飾成顏色不同的花青素，花青素的合成與降解如何實現(xiàn)動態(tài)平衡。利用分子育種技術對植物顏色進行調(diào)節(jié)是目前研究的熱門，但是還缺乏非常有用的外源基因，找到并克隆有效的基因也是漫長而艱巨的任務。此外，盡管利用基因工程對月季、菊花、香石竹等花色的改良已基本成功，但是仍有許多植物的再生及轉(zhuǎn)化體系較難建立，轉(zhuǎn)基因體系仍需要進一步完善。綜上所述，在未來的研究中應重點解決以下問題：（1）深入研究花青素代謝過程中各類影響因子的互相作用模式；（2）通過多組學聯(lián)合分析，挖掘花青素通路中關鍵有效的基因；（3）加大對建立植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究力度，為基因育種奠定基礎。