甜菜M14品系BvM14-RIN4基因的克隆及應(yīng)答鹽脅迫分析

賈惠旭，李海英，端木慧子

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 1500500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜M14品系是由栽培甜菜(BetavulgarisL.)與野生白花甜菜(BetacorollifloraZoss.)雜交及多次回交所獲得的甜菜單體附加系[1]，附加了野生白花甜菜第9號染色體；前期實驗表明甜菜M14品系擁有耐鹽和無融合生殖等優(yōu)良性狀，是用于挖掘優(yōu)質(zhì)基因的良好材料[2-3]。

RIN4(RPM1-interacting protein 4)存在于多種單子葉植物和雙子葉植物中，如番茄、煙草、大豆、玉米和萵苣等[4-5]，是植株正常生長發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)。RIN4是病原相關(guān)分子模式(PAMP)激發(fā)的免疫反應(yīng)PTI(PAMP-triggered immunity)的負調(diào)節(jié)因子，其在免疫應(yīng)答中的作用機制已有明確報道，rin4基因的擬南芥突變株系可以增強了PAMP誘導(dǎo)的防御信號，從而激活擬南芥的免疫應(yīng)答[4-11]。最近的研究也表明，RIN4也參與了效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)ETI。RIN4是效應(yīng)因子AvrB，AvrRpm1和AvrRpt2的靶蛋白[5-8]。正常情況下，RIN4與抗病R蛋白結(jié)合，R蛋白保持非活性狀態(tài)。當(dāng)丁香假單胞菌侵染植物細胞時，細菌中的效應(yīng)因子AvrB，AvrRpm1和AvrRpm2通過磷酸化或降解RIN4，從而釋放抗病R蛋白，以此為信號啟動植物體內(nèi)的防御應(yīng)答，促使植物體內(nèi)一系列防衛(wèi)機制的產(chǎn)生[12-17]。

RIN4基因除了參與免疫應(yīng)答，還參與了非生物脅迫。研究顯示，擬南芥RIN4與14-3-3蛋白形成復(fù)合物被質(zhì)膜家族成員GCN4降解后，調(diào)節(jié)氣孔開閉，從而響應(yīng)干旱脅迫[18]；胡楊(Populuseuphratica)PeRIN4基因在擬南芥中異源表達會增強細胞外排H+的能力，并且抑制了細胞內(nèi)K+外流，這兩方面共同作用，維持了植物體內(nèi)K+/Na+平衡，使轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠有更高的耐鹽性[19]。RIN4定位于質(zhì)膜，它可以通過激活質(zhì)膜H+-ATPase，進而調(diào)控細胞平衡和活性氧平衡，從而使植物應(yīng)答鹽脅迫[20]。

目前，仍然沒有對RIN4響應(yīng)非生物脅迫的系統(tǒng)研究。因此，本研究對甜菜M14品系BvM14-RIN4基因進行克隆、生物信息學(xué)分析、組織特異性及該基因在鹽脅迫下表達分析，為進一步研究BvM14-RIN4基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料選用甜菜M14品系（專利號：CN1263695A），種植于植物培養(yǎng)室。

1.1.2 主要試劑和引物 First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒與KOD-Plus-Ver.2試劑盒均購于東洋紡（上海）生物科技有限公司。本實驗訂購引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司負責(zé)合成。

表1 PCR擴增用到的所有引物

1.2 方法

1.2.1 甜菜M14品系總RNA提取 使用TRIzol試劑提取甜菜M14品系200 mmol/L NaCl處理下根的總RNA。使用NanoDrop儀器檢測RNA樣品的A260/A280，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的純度和完整性。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 按照東洋紡（上海）生物科技有限公司試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書，進行200 mmol/L NaCl脅迫下甜菜M14品系根cDNA反轉(zhuǎn)錄。按照30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min的實驗條件進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3BvM14-RIN4基因cDNA全長的獲得 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因特異性引物，上游引物為BvM14-RIN4-S，下游引物為BvM14-RIN4-AS。以鹽脅迫下的根RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增，并使用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。PCR 擴增反應(yīng)：94℃，2 min；98℃，10 s；58℃，30 s；74℃，30 s，循環(huán)35次；74℃，7 min。

1.2.4BvM14-RIN4基因生物信息學(xué)分析 使用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder程序進行開放閱讀框分析；采用ProParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析；蛋白親水/疏水性分析采用http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl在線進行；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SOPMA軟件進行預(yù)測；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型使用RaptorX數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測；使用NCBI網(wǎng)站的Blastp對BvM14-RIN4蛋白進行同源序列搜索，使用DNAman軟件進行氨基酸多重序列比對；使用MEGA7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5BvM14-RIN4基因組織特異性分析和應(yīng)答鹽脅迫分析 分別提取200 mmol/L NaCl處理0、3、6、9、12 h甜菜M14品系葉片和根部總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈作為模板。通過實時熒光定量PCR技術(shù)，以18SrRNA作為內(nèi)參基因，分析BvM14-RIN4基因在甜菜不同組織的表達模式以及在鹽脅迫下不同組織（根、葉）中不同時間的表達模式，qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書設(shè)置。每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-△△Ct相對定量法計算基因的相對表達量，采用方差分析進行差異顯著性分析，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvM14-RIN4基因的克隆

2.1.1 甜菜鹽脅迫下的根部總RNA的提取 提取樣品的根部總RNA凝膠電泳圖1顯示：28SrRNA條帶的寬度和亮度是18SrRNA條帶的2倍，A260/A280為1.891，濃度為400 ng/μL，RNA完整性很好，無降解，可用于后續(xù)試驗。

圖1 甜菜M14品系根部總RNA提取1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.1.2BvM14-RIN4基因cDNA全長的獲得 以甜菜M14品系鹽脅迫下的根部總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異引物BvM14-RIN4-S和BvM14-RIN4-AS進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示：BvM14-RIN4基因PCR擴增條帶大小大約在250 bp左右，條帶大小符合預(yù)期，對PCR產(chǎn)物進行凝膠回收并與pMD18-T載體連接，獲得重組載體命名為pMD18-T-BvM14-RIN4。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選鑒定陽性克隆子，送至測序公司測序，結(jié)果顯示克隆成功。

圖2 BvM14-RIN4基因cDNA全長產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 BvM14-RIN4基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1BvM14-RIN4基因的開放閱讀框分析 開放閱讀框分析結(jié)果如圖3所示：cDNA序列全長為264 bp（包括終止密碼子），編碼87個氨基酸。圖中紅色方框為起始密碼子，黑色方框為終止密碼子。

圖3 BvM14-RIN4基因cDNA全長的開放閱讀框

2.2.2 BvM14-RIN4蛋白的理化性質(zhì)分析 利用Protparam在線軟件分析BvM14-RIN4蛋白的分子式為C415H652N130O132S3，分子量為9.67 kDa，理論等電點(pI)為9.64，帶正電氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為13，帶負電氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為7，不穩(wěn)定系數(shù)為42.9，脂肪系數(shù)為37.01，平均親疏水系數(shù)為-1.340。

利用ProtScale在線網(wǎng)站對BvM14-RIN4蛋白進行親/疏水性分析，結(jié)果如圖4所示：多肽鏈第83位具有最高分值1.411，疏水性最強：第69位具有最低分值-3.589，親水性最強。此外，整個肽鏈中親水性氨基酸分布較多。總體來看，這條多肽鏈表現(xiàn)出較強的親水性，推測其為可溶性蛋白。

圖4 BvM14-RIN4蛋白序列的親/疏水性預(yù)測結(jié)果

2.2.3 BvM14-RIN4蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用SOPMA軟件進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。BvM14-RIN4蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成包括：4.44%的α-螺旋，5.51%的β-轉(zhuǎn)角，31.11%的延伸鏈和53.33%的無規(guī)卷曲，該蛋白二級結(jié)構(gòu)元件主要為延伸鏈和無規(guī)卷曲。

圖5 BvM14-RIN4蛋白的二級結(jié)構(gòu)

使用RaptorX數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖6所示，粉色部分為該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，紅色部分為該蛋白的疏水區(qū)，白色線條為該蛋白的無序區(qū)域。

圖6 BvM14-RIN4蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.2.4 BvM14-RIN4蛋白氨基酸多重序列比對分析 利用NCBI網(wǎng)站的Blastp對甜菜BvM14-RIN4基因編碼蛋白序列與擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、玉米(ZeamaysL.)、萵苣(LactucasativaL.)、藜麥(ChenopodiumquinoaL.)、菠菜(SpinaciaoleraceaL.)等物種的RIN4蛋白的氨基酸序列進行檢索，采用DNAman軟件進行多重序列比對，如圖7所示。結(jié)果表明，RIN4擁有2個硝酸鹽誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域NOI（PxFGxW和Y/FTxxF）和含有一個保守的半胱氨酸殘基。BvM14-RIN4蛋白與菠菜(Spinacia oleraceaL.)的氨基酸序列相似度為76.92%。利用軟件MEGA7.0對BvM14-RIN4蛋白與其他物種之間的親緣關(guān)系進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，如圖8所示，BvM14-RIN4蛋白與菠菜(SpinaciaoleraceaL.)SoRIN4和藜麥(ChenopodiumquinoaL.)CqRIN4蛋白親緣關(guān)系最近。

圖7 BvM14-RIN4與其他植物RIN4蛋白多重序列比對

圖8 BvM14-RIN4蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 BvM14-RIN4基因組織特異性分析和應(yīng)答鹽脅迫分析

本研究測定BvM14-RIN4基因在0、200 mmol/L NaCl脅迫甜菜M14品系葉、根中0、3、6、9、12、24、48 h的表達情況，結(jié)果如圖9，BvM14-RIN4基因在未處理的甜菜M14品系中根的表達量是葉的2.26倍，說明其具有組織特異性。BvM14-RIN4基因在200 mmol/L NaCl處理甜菜M14品系根6、24 h時表達量顯著增加，分別是0 h的1.96倍和6.84倍；該基因在200 mmol/L NaCl處理甜菜M14品系葉中表達量沒有明顯變化。

圖9 甜菜M14品系葉和根BvM14-RIN4基因的應(yīng)答鹽脅迫的表達情況

3 討論與結(jié)論

本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，BvM14-RIN4蛋白是由無規(guī)卷曲和延伸連組成的親水性蛋白，與該蛋白在大多數(shù)物種中的性質(zhì)一致[19-20]。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果證實該蛋白為固有無序蛋白(IDP)，IDP可以作為蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的樞紐，在信號傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用。BvM14-RIN4蛋白具有硝酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域NOI（PxFGxW和Y/FTxxF），NOI最初是從硝酸鹽誘導(dǎo)的基因中鑒定出來的[22]，該NOI結(jié)構(gòu)與鹽脅迫之間的聯(lián)系還沒有建立。另外本研究結(jié)果顯示，BvM14-RIN4蛋白C末端具有半胱氨酸殘基，DongHyuk等[23]研究表明，擬南芥中AtRIN4半胱氨酸殘基通過翻譯后修飾，可以與周圍的質(zhì)膜(PM)相連，并使該蛋白定位于質(zhì)膜；也有研究顯示，胡楊PeRIN4與質(zhì)膜H+-ATPase相互作用，提高轉(zhuǎn)PeRIN4基因擬南芥的H+外排能力，因此BvM14-RIN4蛋白可能定位于質(zhì)膜并與H+-ATPase相互作用從而應(yīng)答鹽脅迫。BvM14-RIN4蛋白與其他12種植物中RIN4蛋白的氨基酸序列高度同源，該結(jié)果表明RIN4蛋白高度保守，且與Tania等[5]有關(guān)RIN4蛋白的研究結(jié)果一致。此外，進化分析表明BvM14-RIN4蛋白與菠菜(SpinaciaoleraceaL.)SoRIN4和藜麥和和藜麥(ChenopodiumquinoaL.)CqRIN4蛋白親緣關(guān)系最近。

BvM14-RIN4基因組織特異性分析結(jié)果顯示，BvM14-RIN4基因在未處理的甜菜M14品系中根的表達量是葉的2.26倍，說明其具有組織表達特異性；該基因在鹽處理甜菜M14品系根中表達量顯著增加，且在鹽處理24 h時，表達量達到最大值，是0 h的6.84倍，說明BvM14-RIN4基因響應(yīng)鹽脅迫，但是該基因在鹽處理的甜菜M14品系葉中表達量沒有明顯的變化，這可能是因為根是直接接觸鹽處理的器官，能快速地應(yīng)答鹽脅迫，因此在鹽脅迫下根中該基因的表達水平變化明顯。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，BvM14-RIN4基因參與甜菜M14品系應(yīng)答鹽脅迫過程，但RIN4基因以何種途徑響應(yīng)非生物脅迫尚不明確，還需要進一步的基因功能驗證。但隨著研究的不斷深入，基于生物信息學(xué)分析所得結(jié)果可為后續(xù)BvM14-RIN4蛋白功能鑒定、結(jié)構(gòu)分析等研究提供一定基礎(chǔ)信息；而BvM14-RIN4蛋白的同源比對和進化分析結(jié)果也為探討植物中RIN4的起源與進化予以借鑒。